مقالة منهجية

تطوير استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING) السكان في محاصيل الحبوب الصغيرة من قبل الطفرات ميثانسولفونات إيثيل

DOI:

10.3791/59743

⸱

يوليو 16, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Science and Landscape Architecture, University of Maryland, College Park

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف هو بروتوكول لتطوير الآفات المحلية المستحثة المستهدفة في الجينوم (TILLING) السكان في محاصيل الحبوب الصغيرة مع استخدام ميثانسولفونات إيثيل (EMS) كمغير. كما يتم توفير بروتوكول للكشف عن الطفرات باستخدام SCel-1.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING) هو أداة قوية للجينات العكسية التي تشمل الطفرات الكيميائية والكشف عن اختلاف التسلسل في الجينات المستهدفة. TILLING هو أداة علم الجينوم وظيفية قيمة للغاية للتحقق من الجينات، وخاصة في الحبوب الصغيرة التي تتبع النهج القائمة على التحول قيود خطيرة. إن تطوير مجموعة سكانية قوية من المتحولين أمر أساسي لتحديد كفاءة دراسة التحقق من صحة الجينات المستندة إلى TILLING. ويشير عدد السكان الذين يعانون من انخفاض معدل الطفرة الإجمالية إلى أنه يجب فحص عدد كبير من السكان بشكل غير عملي للعثور على الطفرات المطلوبة، في حين أن ارتفاع تركيز الطفرات يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات بين السكان، مما يؤدي إلى عدم كفاية عدد الأفراد المتحولين. وبمجرد تطوير مجموعة سكانية فعالة، هناك طرق متعددة للكشف عن الطفرات في جين ذي أهمية، ويعتمد اختيار المنصة على النطاق التجريبي وتوافر الموارد. إن منهج Cel-1 القائم على الجل والجيل من الأغاروز لتحديد المتحولين مناسب، ويمكن استنساخه، ومنصة أقل كثافة في استخدام الموارد. ومن المفيد من حيث أنها بسيطة، لا تتطلب أي معرفة حسابية، وأنها مناسبة بشكل خاص للتحقق من صحة عدد صغير من الجينات مع معدات المختبر الأساسية. في هذه المقالة، هي طرق لتطوير السكان TILLING جيدة، بما في ذلك إعداد منحنى الجرعة، والمتحولين والحفاظ على السكان متحولة، وفحص السكان المتحولين باستخدام اختبار Cel-1 المستندة إلى PCR .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تخدم الطفرات نقطة في الجينوم العديد من الأغراض المفيدة للباحثين. اعتمادا على طبيعتها وموقعها، يمكن استخدام هذه الطفرات لتعيين وظائف للجينات أو حتى مجالات متميزة من البروتينات ذات الأهمية. ومن ناحية أخرى، يمكن اختيار الطفرات المفيدة، كمصدر للتباين الجيني الجديد، للصفات المرغوبة باستخدام شاشات النماذج الظاهرية وزيادة استخدامها في تحسين المحاصيل. TILLING هو أداة قوية عكس علم الوراثة التي تشمل الطفرات الكيميائية والكشف عن اختلاف التسلسل في الجين المستهدف. وضعت لأول مرة في أرابيدوبسي1 ودروسوفيليا melanogaster2، وقد تم تطوير السكان TILLING واستخدامها في العديد من محاصيل الحبوب الصغيرة مثل القمح الخبز سداسية(Triticum aestivum)3، الشعير(Hordeum vulgare)4، القمح القاسي رباعي الأرجل (T.dicoccoides durum)5، القمح ثنائي الديلويد (T.monococcum)6 و "D" جينوم السلف من القمح Aegilops tauschii7 . وقد استخدمت هذه الموارد للتحقق من أدوار الجينات في تنظيماللاأحيائي والحيوي تحمل الإجهاد 8، وتنظيم وقت المزهرة9،وتطوير أصناف المحاصيل متفوقة من الناحية التغذوية5.

الحرث، جنبا إلى جنب مع استخدام العوامل المطفرة الألكيلات مثل ميثانسولفونات الإيثيل (EMS)، أزيد الصوديوم، N-ميثيل-N-nitrosourea (MNU)، وميثانسولفونات الميثيل (MMS)، له مزايا على غيرها من أدوات علم الوراثة العكسيلعدة أسباب. أولا، يمكن إجراء الطفرات على أي نوع تقريبا أو مجموعة متنوعة من النبات10 ومستقلة عن عنق الزجاجة التحول، وهو أمر صعب بشكل خاص في حالة الحبوب الصغيرة11. ثانيا، بالإضافة إلى توليد الطفرات بالضربة القاضية التي يمكن الحصول عليها من خلال نهج التحقق من صحة الجينات الأخرى، يمكن أن يسبب مجموعة من الطفرات الخاطئة والربط، والتي يمكن تمييز وظائف المجالات الفردية للبروتينات ذات الأهمية12. وعلاوة على ذلك، تولد TILLING مجموعة خالدة من الطفرات في جميع أنحاء الجينوم. وبالتالي، يمكن استخدام مجموعة واحدة للتحقق الوظيفي من الجينات المتعددة. وعلى النقيض من ذلك، فإن أدوات وراثية عكسية أخرى تولد موارد خاصة بالجين فقط تحت الدراسة13. ويمكن نشر الطفرات المفيدة التي يتم تحديدها من خلال TILLING لأغراض التكاثر ولا تخضع للتنظيم، على عكس تحرير الجينات، التي لا يزال تصنيفها غير المعدل وراثيا غير مؤكد في العديد من البلدان. هذا يصبح [توين تو] بشكل خاصّ إلى حبات صغيرة أنّ يكون دوليّا يتاجر14.

الحرث هو استراتيجية بسيطة وفعالة للتحقق من الجينات ويتطلب السكان المتحولين لتطوير هافة الجينات ذات الأهمية. إن تطوير مجموعة سكانية فعالة من المتحولين أمر أساسي لتحديد كفاءة دراسة التحقق من صحة الجينات المستندة إلى TILLING. ويشير عدد السكان الذين يعانون من انخفاض معدل الطفرة الإجمالية إلى أنه يجب فحص عدد كبير من السكان بشكل غير عملي بحثاً عن الطفرات المطلوبة، في حين أن ارتفاع تركيز الطفرات يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات بين السكان وعدم كفاية عدد السكان. الأفراد المتحولين. وبمجرد تطوير مجموعة جيدة من السكان، هناك طرق متعددة للكشف عن الطفرات في الجينات ذات الأهمية، ويعتمد اختيار المنصة على النطاق التجريبي وتوافر الموارد. وقد استخدم تسلسل الجينوم كله وتسلسل exome لتوصيف جميع الطفرات في مجموعات TILLING في النباتات مع الجينوم الصغيرة15،16. وقد تم تنفيذ تسلسل Exome من اثنين من السكان TILLING في الخبز والقمح القاسي ومتاح للجمهور لتحديد الطفرات المرغوب فيها وترتيب خطوط متحولة من الفائدة17. وهو مورد عام كبير من حيث توافر الطفرات المستصوبة؛ ومع ذلك، في دراسات التحقق من صحة الجينات، يجب أن يمتلك خط من النوع البري الجين المرشح للاهتمام. ولسوء الحظ، لا يزال من الباهظ التكلفة تسلسل الإكسوتومي من جميع سكان TILLING للتحقق من صحة الجينات العكسية القائمة على علم الوراثة لعدد قليل من الجينات المرشحة في خلفية أخرى. وقد استخدمت تسلسل Amplicon والاختبارات المستندة إلى Cel-1 في الكشف عن الطفرات في السكان المستهدفين في القمح، وCel-1 الاختبارات هي أبسط، لا تتطلب أي معرفة حسابية، ومناسبة بشكل خاص للتحقق من صحة عدد صغير من الجينات مع الأساسية معداتالمختبر 6،18.

في هذه المقالة، وصفت هي أساليب لتطوير السكان TILLING جيدة، بما في ذلك إعداد منحنى الجرعة، والمتحولين والحفاظ على السكان متحولة، وفحص السكان المتحولين باستخدام اختبار Cel-1 المستندة إلى PCR . وقد تم بالفعل تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح في تطوير واستخدام السكان المتحولين من Triticum aestivum، Triticum monoccocum6، الشعير ، Aegilops tauchii7، والعديد من الاخرين. وشملت تفاصيل صريحة من هذه الأساليب جنبا إلى جنب مع نصائح مفيدة من شأنها أن تساعد الباحثين على تطوير السكان TILLING، وذلك باستخدام EMS كمغيرة في أي مصنع الحبوب الصغيرة من الاختيار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد منحنى الجرعة لتحول فعال

  1. نقع 100 بذور مع النمط الجيني من الاهتمام في ستة قوارير زجاجية 250 مل (100 في كل قارورة) تحتوي على 50 مل من الماء المقطر. يهز في 100 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) لimbibition من البذور.
  2. في غطاء الدخان، إعداد 50 مل من 0.4٪، 0.6٪، 0.8٪، 1.0٪، و 1.2٪ (ث / خمسة) إيثيل ميثانسولفونات (EMS) الحل عن طريق حل 0.167، 0.249، 0.331، 0.415، و 0.498 مل من EMS في الماء المقطر، على التوالي.
    ملاحظة: EMS سائل في RT بكثافة 1.206 جم/مل.
    تحذير: استخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) أثناء التعامل مع EMS.
  3. Decant الماء من خمسقوارير وإضافة 50 مل من حل EMS في كل قارورة تحتوي على البذور المنغمسة بحيث يكون هناك ستة علاجات مختلفة مع 0.0٪، 0.4٪، 0.6٪، 0.8٪، 1.0٪، و 1.2٪ حل EMS. هز القوارير لمدة 16 ساعة في 75 دورة في الدقيقة وRT.
  4. Decant حل EMS وجمع البذور المعالجة بشكل منفصل لكل علاج باستخدام قطعة قماش الجبن. تعطيل الحل EMS المستخدمة عن طريق إضافة حجم واحد من EMS-تعطيل الحل (0.1 M هيدروكسيد الصوديوم، 20٪ ث / ف Na2S2O3)لمدة 24 ساعة. أيضا علاج قوارير الملوثة ونصائح ماصة مع حل EMS-تعطيل لمدة 24 ساعة.
  5. اغسل البذور المعالجة بنظم الإدارة البيئية تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 2 ساعة.
  6. تنمو النباتات في 20-25 درجة مئوية تحت فترة ضوء 16 ساعة.
  7. تسجيل بيانات عن بقاء النبات بعد 15 يوما من الزرع. استخدم المعادلة التالية لحساب معدل البقاء على قيد الحياة لكل علاج:
    figure-protocol-1
    ملاحظة: إذا كان معدل الإنبات أقل من 100٪ في الضوابط، يجب حساب معدلات البقاء على قيد الحياة دقيقة في جميع العلاجات بعد طرح عدد البذور التي فشلت في الإنبات في الضوابط. معدل البقاء على قيد الحياة من 40٪ -60٪ هو مرغوب فيه للطفرات فعالة. قد يكون مطلوباً لإجراء جولة ثانية من تحسين الجرعة مع تركيز معدل وفقاً لبقاء البذور المعالجة حتى تحقيق معدل الفتكا المرغوب فيه من 40%-60%.

2- الطفرات والحفاظ على السكان المتحولين

  1. نقع الدفعة النهائية من ما لا يقل عن 3000 بذور تقسيم بالتساوي (600 بذور لكل منهما) في خمسة 1000 مل قوارير تحتوي على 300 مل الماء المقطر. يهز لمدة 8 ساعة في 100 دورة في الدقيقة تحت RT لimbibition.
    ملاحظة: يعتمد الحجم النهائي للسكان المرغوب فيهم على تردد الطفرة ومستوى البليدي من النمط الجيني، ولكن من المستحسن استخدام ما لا يقل عن 3000 بذور للسداسيات، و4000 بذور لرباعيات الأضلاع، وأكثر من 7000 بذور للثنائيات.
  2. في غطاء الدخان، وإعداد 1500 مل من محلول تركيز EMS الأمثل في الماء المقطر.
  3. قم بإزالة الماء من القوارير وأضف 300 مل من التركيز الأمثل لحل EMS في كل قارورة تحتوي على 600 بذور متشرب. هز القوارير لمدة 16 ساعة في 75 دورة في الدقيقة وRT.
  4. Decant EMS وجمع البذور المعالجة في قطعة قماش الجبن. تعطيل حل EMS وحاويات المعالجة مع حل تعطيل EMS كما هو الحال في الخطوة 1.4.
  5. اغسل البذور المعالجة بنظم الإدارة البيئية تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 2 ساعة.
  6. تنمو M1 النباتات (المستمدة من بذور M0) في 20-25 درجة مئوية تحت فترة ضوء 16 ساعة.
    ملاحظة: قد يكون مطلوبا ً من الشتلات في مرحلتي الورقة لمدة 6 أسابيع عند درجة حرارة 4 درجة مئوية، إذا كان النمط الجيني للفائدة لديه عادة نمو من نوع الشتاء.
  7. السماح للنباتات M1 لتلقيح الذاتي، وحصاد بذور M2 بشكل منفصل لكل نبات M1 الخصبة.
    ملاحظة: لتجنب فرص العبور المحتملة، تغطية المسامير من النباتات M1 مع أكياس التلقيح قبل التخدير.
  8. قم بزرع بذرة M2 واحدة من كل نبات M1 لتجنب التكرار الوراثي.
  9. جمع الأنسجة من النباتات M2 في مرحلة ورقتين في 1.1 مل من الأنابيب الدقيقة 96 جيدا. جمع حوالي 80 ملم من الأنسجة الورقية من كل نبات وتسجيل هوية كل عينة في خطة جمع الأنسجة.
  10. تجميد الجافة الأنسجة ورقة باستخدام الليوفيلوووالمخزن وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  11. الحفاظ على النباتات M2 في 20-25 درجة مئوية تحت فترة ضوء 16 ساعة.
  12. تسجيل البيانات عن الأنماط الظاهرية المتحولة للنباتات M2 على فترات منتظمة. الأنماط الظاهرية المتوقعة هي المهق، الكلور، تبادل لاطلاق النار العشبية، متنوعة، خصبة جزئيا، معقمة، الخ.
  13. السماح للنباتات M2 لتخصيب الذات وناضجة. حصاد وحفظ بذور M3 من النباتات M2 (الشكل1).
    ملاحظة: يتم استخدام بذور M للتحقق من النمط الظاهري في دراسات علم الوراثة العكسي. لذلك، M ينبغي أن تكون مفهرسة بعناية وتخزينها في ظل ظروف باردة وجافة. بدلا من ذلك، إذا كان يجب زيادة البذور في الميدان، يمكن زرع صفوف الرأس لكل نبات M، ويمكن حصاد بذور M من كل صف وحفظها بشكل منفصل كمورد السكان TILLING.

3- اختبار Cel-1 للتوصيف الوراثي للمتحولين

  1. استخراج الحمض النووي من الأنسجة الورقية من M2 باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي النباتية مع نظام تنقية الحمض النووي (انظر جدولالمواد) بعد توصيات الشركة المصنعة.
  2. تحديد الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف وتطبيع تركيزات الحمض النووي إلى 25 نانوغرام/ميكرولتر مع المياه الخالية من النوكل في 96 كتلة بئر.
    ملاحظة: من المهم التحقق من جودة الحمض النووي عن طريق تشغيله على هلام، كما الحمض النووي منخفض الجودة (الحمض النووي مسحة) قد يؤدي إلى سلبيات كاذبة في عينات مجمعة.
  3. إنشاء 4X حمامات الحمض النووي عن طريق الجمع بين الحمض النووي من أربع كتل بئر 96 في لوحة واحدة، مع الحفاظ على هوية الصف والعمود من كل عينة. إضافة 50 درجة مئوية من الحمض النووي من كل عينة فردية في لوحة تجمع بحيث كل لوحة تجمع يحتوي جيدا على ما مجموعه 200 درجة مئوية من الحمض النووي من أربع كتل مختلفة 96 جيدا.
  4. فهرسة هوية الحمض النووي المجمع في شكل تجمع لوحة صف العمود (على سبيل المثال، تجمع 1 A1 = Box1A1 + Box2A1 + Box3A1 + Box4A1).
  5. تصميم مواد أولية خاصة بالجينوم [A1] للجين ذي الأهمية باستخدام صفحة المبادئ التمهيدية الخاصة بالجينوم (GSP) مع الإعدادات الافتراضية للأنواع المتعددة اللمع. بالنسبة للثنائي بلويد، استخدم التمهيدي 3 لتصميم التمهيديات باستخدام الإعدادات الافتراضية. تصميم التمهيديات متعددة، إذا لزم الأمر، لتغطية منطقة الترميز بأكملها من الجين من الفائدة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أحدث تجميع IWGSC للحصول على تسلسلات لجين الاهتمام بالقمح باستخدام أداة أورجي BLAST .gt;. ويتراوح طول أمبليكون الأمثل بين 800-1500 نقطة أساس. ويبين الجدول 1 أمثلة من المواد التمهيدية للجينات الشمعية في القمح سداسي البروم.
  6. تشغيل PCR للمواد التمهيدية الخاصة بالجينات على الحمض النووي المجمع على النحو التالي:
    1. إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت PCR، 2 ميكرولتر (كل) من 4 μM إلى الأمام وعكس التمهيديات، 0.1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي (انظر جدول المواد)، 5 ميكرولتر من قالب الحمض النووي المجمع، ثم زيادة حجم إلى 25 درجة مئوية باستخدام المياه الخالية منالنوكليس.
    2. استخدام ملف تعريف لمسة لأسفل لتشغيل رد فعل PCR على دورة الحرارية على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، سبع دورات من 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 67 درجة مئوية إلى 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة مع انخفاض درجة الحرارة من 1 درجة مئوية لكل دورة و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 30 دورة من 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
      ملاحظة: فوق PCR الشخصي يعمل على قالب الحمض النووي القمح لمعظم التمهيديات المصممة باستخدام التمهيدي 3 الإعدادات الافتراضية. وفي حالة التضخيم غير المحدد، ينبغي أن تكون صورة PCR صارمة قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.
  7. توليد heteroduplexes بين الحمض النووي غير متطابقة عن طريق احتضان منتجات PCR في دورة الحرارية باستخدام الملف الشخصي على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، خمس دورات من 95 درجة مئوية ل1 s، 95 درجة مئوية إلى 85 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة مع انخفاض درجة الحرارة من 2 درجة مئوية لكل دورة، و 60 دورات من 85 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية مع انخفاض 1 درجة مئوية لكل دورة.
  8. إضافة 2.5 درجة مئوية من الإندونووكينج محلية الصنع من Cel-1 إلى منتجات PCR غير الدوبلكس وحضانة لمدة 45 دقيقة عند 45 درجة مئوية. إنهاء رد فعل Cel-1 عن طريق إضافة 2.5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (درجة الحموضة 8.0).
    ملاحظة: يمكن استخراج الإندونووكينج سيل-1 من سيقان الكرفس الطازجة باستخدام البروتوكول الذي قام به Till et al.19 من المهم جداً اختبار النشاط والكمية المثلى من الإندونوكليس سيل-1، والتي يمكن اختبارها باستخدام المتحولين المميزين سابقاً أو مجموعة أدوات الكشف عن الطفرات المتاحة تجارياً.
  9. تشغيل المنتجات المعالجة Cel-1 على هلام أجاروز 3.0٪ في 100 V لمدة 2.5 ساعة. الآبار التي تحتوي على أصغر وفريدة من نوعها الفرقة المقطّعة، بالإضافة إلى العصابات غير المعبّأة طولكامل، سوف تحتوي على عينة الحمض النووي متحولة.
  10. حمامات السباحة المتحولة المناوّقة.
    1. اتبع الخطوات 3.6 و3.7 و3.8 و3.9 لعينات الحمض النووي M2 الفردية التي تشكل برك المتحولين المحددة في الخطوة 3.9.
    2. لتحديد zygosity من المسوخ، تشغيل اثنين PCR (كما هو موضح في الخطوة 3.6) للفرد M2 الحمض النووي، الذي يحتوي على رد الفعل الأول 2.5 ميكرولتر من M2 DNA و 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي البري ة، ويحتوي رد الفعل الثاني على 5 ميكرولتر فقط من الحمض النووي M2. إذا كانت الطفرة هي heterozygous، وسوف تكون الفرقة مقطع إضافية موجودة في كل من ردود الفعل. من ناحية أخرى، سيتم العثور على العصابات مقطع إضافية فقط في رد الفعل الأول إذا كان متحولة هو homozygous.
  11. لتحديد طبيعة الطفرة، تسلسل منتجات PCR من المسوخ المؤكدة باستخدام منصة تسلسل Sanger بناء على تعليمات الشركة المصنعة.

4. حساب تردد الطفرة

ملاحظة: يشير تردد الطفرة في عدد السكان TILLING إلى متوسط المسافة المادية التي تحدث فيها طفرة واحدة في الأفراد من تلك السكان. على سبيل المثال، يعني تردد طفرة من 1/35 كيلو بايت في السكان TILLING أن الفرد المتوسط من تلك السكان تمتلك 1 طفرة لكل 35 كيلو بايت في الجينوم.

  1. لتحديد تردد الطفرة من السكان TILLING، حساب العدد الإجمالي للقواعد التي تم فحصها.
  2. لحساب العدد الإجمالي للقواعد التي تم فحصها، اضرب حجم منتج PCR بالعدد الإجمالي للأفراد الذين تم فحصهم.
  3. تقسيم العدد الإجمالي للقواعد التي تم فحصها من قبل عدد الطفرات الفريدة التي لوحظت باستخدام المعادلة التالية، والتي سوف تسفر عن المنطقة المادية التي تمتلك 1 طفرة في السكان TILLING معينة:
    figure-protocol-2
    ملاحظة: لحساب الحد في القرار 50 نقطة أساس في كلا الطرفين استناداً إلى منصة المستندة إلى هلام أغاروز طرح 100 نقطة أساس من حجم المنتج في الحساب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 2 يظهر منحنى الجرعة من سداسي ة القمح القمح المستعمر جاغر، القمح ثنائي الديبلويد Triticum monococcum6، ومانح الجينوم من القمح Aegilops tauschii7. وكانت جرعات EMS لمعدلات البقاء على قيد الحياة 50٪ المطلوب حوالي 0.25٪، 0.6٪ و 0.7٪ لT. monococcum، Ae. tauschii،وT. aestivum،على التوالي. ويرجع ارتفاع تحمل EMS للقمح سداسي اللولب إلى قدرته على تخزين الجينوم. ومع ذلك، عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TILLING هو أداة وراثية عكسية قيمة للغاية للتحقق من الجينات، وخاصة بالنسبة للحبوب الصغيرة حيث النهج القائمة على التحول لديها اختناقات خطيرة11. تطوير السكان المتحولين مع تردد طفرة عالية هي واحدة من الخطوات الحاسمة في إجراء دراسات الجينوم الوظيفية. الخطوة الأكثر أهمية في تطوير السكان TILLING قوية هو تحديد التركيز الأمثل للنظم البيئية. وقد وجد أن معدل البقاء على قيد الحياة 40٪ -60٪ في M1 أن يكون مؤشرا جيدا على فعالية الطفرات EMS في القمح والشعير4،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن المؤلفون عن أي مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية، ومشروع هاتش 1016879، ومحطة ماريلاند للتجارب الزراعية عن طريق منحة MAES رقم 2956952.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96 جيدا 1.1 مل من الأنابيب الدقيقة في الركوف الصغيرةNational ScientificTN0946-08Rلجمع أنسجة الأوراق Agarose
I من الناحية الحيوية من الدرجةVWR0710-500G
Biosprint 96 مجموعة نباتات الحمض النوويQiagen941558Kit لاستخراج الحمض النووي
Cel-1 endonucleaseالمستخرج كما هو موضح بواسطة Till et al 2006نوكلياز داخلي محدد أحادي الخيط
جهاز طرد مركزي 5430 REppendorf
إيثيل ميثان سولفوناتسيجما ألدريتشM-0880-25GEMS ،
تجميد الجاف / التجميد الكيميائيLabconcoللتجميد بالتجميد من أنسجة الأوراق
نظام تنقية الرفراف المرن5400610 علميروبوت استخراج الحمض النووي عالي الإنتاجية
Taq DNA البوليميرازBiolineBIO-21107
مياه خالية من النوكليزSigma aldrichW4502-1L
نظام تصوير هلام NuGeniusSyngene
Orbit Environ-shakerخط
SPECTROstar NanoBMG LABTECHقطرة نانو لقياس الحمض النووي
T100 Thermal cyclerBIO-RAD1861096
نظام My مختبر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeted screening for induced mutations. Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).
  2. Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. Targeted Recovery of Mutations in Drosophila. Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).
  3. Tsai, H., et al. Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing. Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).
  4. Caldwell, D. G., et al. A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.). The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).
  5. Hazard, B., et al. Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat. Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).
  6. Rawat, N., et al. A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics. BMC Plant Biology. 12, 205(2012).
  7. Rawat, N., et al. TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement. Frontiers in Plant Science. 9, (2018).
  8. Rawat, N., et al. Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight. Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).
  9. Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes. Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).
  10. Greene, E. A., et al. Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis. Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).
  11. Harwood, W. A. Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).
  12. Henikoff, S., Comai, L. Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics. Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).
  13. Uauy, C., et al. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC Plant Biology. 9 (1), 115(2009).
  14. Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat. Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).
  15. Li, G., et al. The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies. The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).
  16. Jiao, Y., et al. A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses. The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).
  17. Krasileva, K. V., et al. Uncovering hidden variation in polyploid wheat. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268(2017).
  18. Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).
  19. Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).
  20. Wu, J. -L., et al. Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics. Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).
  21. Feldman, M., Levy, A. A. Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat. Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).
  22. Comai, L. The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).
  23. Guo, H., et al. Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  24. Rakszegi, M., et al. Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program. Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).
  25. Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. Tilling by Sequencing. Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TILLING EMS Cel 1 PCR

مقالات ذات صلة