يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحص الأجسام المضادة الحرة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز

6.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59856

⸱

يوليو 9, 2019

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of Texas at Austin

في هذه المقالة

ملخص

هنا، يتم وصف فحص الأجسام المضادة الخالية في المختبر للتحليل المباشر لنشاط ميثيل ترانسفيراز على الحمض النووي الريبي الاصطناعية أو في المختبر.

الملخص

هناك أكثر من 100 تعديلات متميزة كيميائيا من الحمض النووي الريبي، ثلثيها تتكون من ميثيلات. وقد ظهر الاهتمام بتعديلات الحمض النووي الريبي، وخاصة المثيلية، مرة أخرى بسبب الأدوار الهامة التي تقوم بها الإنزيمات التي تكتب وتمحوها في العمليات البيولوجية ذات الصلة بالمرض والسرطان. هنا، يتم توفير تحليل حساس في المختبر لتحليل دقيق لنشاط كاتب مثيلالحمض النووي الريبي على RNAs الاصطناعية أو في المختبر المنقولة. يستخدم هذا الاختبار شكل ثلاثي الجوانب من S-adenosyl-methionine، مما يؤدي إلى وضع العلامات المباشرة على الحمض النووي الريبي الميثيلي مع التريتيوم. الطاقة المنخفضة من إشعاع التريتيوم يجعل الأسلوب آمن، والأساليب الموجودة من قبل من تضخيم إشارة التريتيوم، تجعل من الممكن لتحديد وتصور الحمض النووي الريبي الميثيلي دون استخدام الأجسام المضادة، والتي هي عادة عرضة للقطع الأثرية. في حين أن هذه الطريقة مكتوبة لمثيلة الحمض النووي الريبي، عدد قليل من القرص جعله ينطبق على دراسة التعديلات الحمض النووي الريبي الأخرى التي يمكن وصفها إشعاعيا، مثل أسيتيل الحمض النووي الريبي مع 14C أسيتيل الإنزيم A. عموما، وهذا الفحص يسمح لتقييم بسرعة RNA شروط المثيلة، تثبيط مع مثبطات جزيء صغير، أو تأثير RNA أو متحولة الإنزيم، ويوفر أداة قوية للتحقق من صحة وتوسيع النتائج التي تم الحصول عليها في الخلايا.

المقدمة

الحمض النووي، الحمض النووي الريبي والبروتينات تخضع للتعديلات التي تنظم بإحكام التعبير الجيني1. ومن بين هذه التعديلات، تحدث المثيلة على جميع البوليمرات الحيوية الثلاثة. وقد تم دراسة الحمض النووي والبروتين الميثيل بشكل جيد جدا خلال العقود الثلاثة الماضية. وعلى النقيض من ذلك، لم يتجدد الاهتمام بمثيلة الحمض النووي الريبي إلا مؤخراً في ضوءالأدوار الهامة التي تلعبها البروتينات التي تكتب أو تمحو أو تربط المثيلة في التنمية والمرض 2. بالإضافة إلى وظائف معروفة في ribosomal وفيرة ونقل RNAs، مسارات مثيلة RNA تنظيم محددة رسول RNA الاستقرار3،4، الربط5 والترجمة6،7، ميرنامعالجة 8،9 والتوقف النسخي والإفراج 10،11.

هنا، يتم الإبلاغ عن طريقة بسيطة وقوية للتحقق في المختبر من نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز في إعداد مختبر البيولوجيا الجزيئية (ملخصة في الشكل1). كثير دراسات يقيّم النشاط من [رنا] [مثلترانسفيرس] كلّيّا [دوت-بلووت] مع جسم مضادّ ضدّ ال [رنا] تعديل الفائدة. ومع ذلك، لا تحقق نقطة وصمة عار من سلامة الحمض النووي الريبي عند الحضانة مع الحمض النووي الريبي methyltransferase. وهذا أمر مهم لأنه حتى التلوث الطفيف للبروتينات المؤتلفة مع النوكلورات يمكن أن يؤدي إلى تدهور جزئي للRNA ونتائج مربكة. وعلاوة على ذلك، حتى الأجسام المضادة تعديل RNA محددة للغاية يمكن التعرف على RNAs غير معدلة مع تسلسلات محددة أو هياكل. في المختبر الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز الفحص ذكرت هنا يستفيد من حقيقة أن الميثيونين S-adenosyl يمكن أن تكون tritiated على المانحة مجموعة الميثيل (الشكل1)،مما يسمح لRNA ميثيلات إلى الكشف بدقة دون استخدام الأجسام المضادة . يتم توفير التعليمات للنسخ في المختبر وتنقية نسخة من الاهتمام واختبار مثيلة من النص المذكور من قبل إنزيم الفائدة. هذه الطريقة مرنة وقوية، ويمكن تعديلها وفقا لاحتياجات أي مشروع معين. على سبيل المثال، في المختبر منقولة ونقية RNAs، توليفها كيميائيا RNAs، ولكن أيضا RNAs الخلوية يمكن استخدامها. يوفر هذا التحليل معلومات كمية في شكل حساب التلألؤ، فضلا عن المعلومات النوعية من خلال إظهار المكان الذي يعمل فيه الحمض النووي الريبي المثيلي على هلام. وهذا يمكن أن يوفر رؤية فريدة من نوعها في وظيفة ميثيل ترانسفيراز RNA، لا سيما عند استخدام RNAs الخلوية كالركيزة، كما أنه يوفر طريقة لمراقبة مباشرة حجم RNA أو RNAs التي تستهدف الميثيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. في المختبر النسخ وتنقية هلام من RNA الهدف

  1. استنساخ تسلسل الاهتمام في بلازميدات تحتوي على T7 و /أو SP6 المروجين باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي المعمول بها12 أو مجموعات.
  2. خطية قالب الحمض النووي للنسخ في المختبر
    1. تضخيم تسلسل الاهتمام من قبل PCR من بلازميد مع التمهيديات المصممة لتشمل منطقة المروج T7 من خلال إدراج، +20-30 bp المنبع والمصب كما سبق وصفه13.
    2. بدلا ً من ذلك، هضم 5 ميكروغرام من بلازميد باستخدام أنزيم تقييدي (RE) قطع الموقع متاح المصب إدراج وفقا للتعليمات المقدمة من المورد من RE.
      ملاحظة: تذكر للتحقق المزدوج من عدم قطع الإدراج بواسطة RE المحدد. اختيار RE المستخدمة في هذه الخطوة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على العائد من النص. بشكل تفضيلي، خطي مع نهاية حادة أو 5 '-المتدلية إنتاج RE لتجنب تبديل قالب من بوليميراز T7 RNA على حبلا الحمض النووي المعاكس14. حاول إعادة التجدد المختلفة إذا كانت العوائد الأولية غير كافية.
  3. تنقية الحمض النووي الناتج باستخدام مجموعة لاستخراج هلام أغاروز الحمض النووي وتنظيف. اولوت الحمض النووي مع 30 ميكرولتر من الماء.
  4. مزيج جيدا عن طريق الدوامة، pipet 1.5 € L وقياس تركيز الحمض النووي مع مطياف الحجم الدقيق.
  5. استخدام 250 نانوغرام من الحمض النووي للتحقق من جودة وحجم الحمض النووي النقي على 1٪ الأوروز جل الكهربائي في 1X TBE العازلة هاجر لمدة 1 ساعة في 4 V / سم.
  6. إذابة الكواشف المجمدة من عدة النسخ في المختبر. ضع مزيج بوليميراز T7 RNA على الجليد، والكواشف الأخرى على مُقمّن في درجة حرارة الغرفة. مباشرة بعد ذوبان كامل، تدور سريعة أنابيب rNTP لمدة 5 ق لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنابيب ووضعها على الجليد. الحفاظ على 10X رد الفعل العازلة في درجة حرارة الغرفة لتجنب هطول الأمطار.
  7. الأنابيب في أنبوب 1.5 مل المكونات التالية من رد فعل النسخ 20 ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة في الترتيب المشار إليه: 6 ميكرولتر من الماء، 2 ميكرولتر (0.1 - 1 ميكروغرام) من قالب الحمض النووي الخطي، 2 ميكرولتر من 75 مل حل ATP، 2 ميكرولتر من 75 مل GTP الحل ، 2 ميكرولتر من 75 مل CTP الحل، 2 ميكرولتر من 75 مل UTP الحل، 2 ميكرولتر من 10X رد الفعل العازلة و 2 ميكرولتر من T7 RNA بوليميراز ميكس.
    ملاحظة: بالنسبة لقالب الحمض النووي الذي ينشئه PCR، استخدم 100-200 نانوغرام من الحمض النووي؛ لقالب الحمض النووي التي تم إنشاؤها بواسطة تقييد هضم الإنزيم منبلازميد، واستخدام ~ 1 ميكروغرام.
  8. خلط الأنبوب جيدا. تدور سريعة لمدة 5 ثوان لجمع حل رد الفعل في الجزء السفلي من الأنبوب، ثم حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعة.
    ملاحظة: كل نسخة سوف يتصرف بشكل مختلف اعتمادا على قالب الحمض النووي، طوله، تسلسله أو هيكلها. تحسين ظروف النسخ في المختبر عن طريق اختبار أوقات حضانة مختلفة تصل إلى 6 ساعة. تركيزات مختلفة من قالب الحمض النووي، T7 RNA بولميراز، أو NTP؛ أو إضافة مكل إضافية2 إلى ما هو موجود في T7 RNA Polymerase ميكس.
  9. في نهاية فترة الحضانة، أضف 1 ميكرولتر من DNase I لكل 20 درجة مئوية من رد الفعل والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ برد فعل النسخ مؤقتا على الجليد حتى هلام polyacrylamide جاهزة.
  10. المضي قدما في تنقية من قبل هلام بولياكريلاميد.
    ملاحظة: بما أن الحمض النووي الريبي حساس للتلوث بدرجة الحموضة وRNase، استخدم المعدات المخصصة لRNA والكواشف الخالية من RNase.
  11. تحديد النسبة المئوية للبوليأكريلاميد للهلام اعتمادا على حجم نسخة من الفائدة: 3.5٪ ل100-2000 nt (XC: 460 nt ; BB: 100 nt)، 5٪ ل80-500 nt (XC: 260 nt ؛ BB: 65 nt), 8% ل 60-400 nt (XC: 160 nt ; BB: 45 nt), 12% ل40-200 nt (XC: 70 nt; BB: 20 nt), 15% ل 25-150 nt (XC: 60 nt ; BB: 15 nt)، و 20٪ ل6-100 nt (XC: 45 nt ; BB: 12 nt).
  12. إعداد هلام بولياكريلاميد denaturing اليوريا عن طريق الجمع بين الكواشف التالية في أنبوب مخروطي 50 مل: 9.6 غرام من اليوريا الصف الجزيئي، 2 مل من 10X TBE، س مل من 40٪ أكريلاميد: بيس أكريلاميد مزيج (29:1) والماء تصل إلى علامة 20 مل على الأنبوب ، حيث x = 20 مل / (40٪ / هلام٪ ٪ ٪
    تحذير: غالباً ما تحتوي المواد الهلامية البولي أكريلاميد على أكريلاميد غير بوليمرة وهو مادة سامة يمكن أن تنتج خطراً عند إدخالها إلى البيئة. التخلص من المواد الهلامية البولي أكريلاميد من خلال برنامج المؤسسة للنفايات الكيميائية.
  13. ميكروويف لمدة 15 s في 30٪ من الطاقة. توضع على النوتاتور لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو حتى يذوب اليوريا تماما.
  14. في حين أن خليط هلام هو الدورية، واسترداد كاسيت هلام (18 جيدا، 1 ملم سميكة؛ 13.3 × 8.7 سم (W × L))، وإزالة المشط ووضع كاسيت لالصب هلام.
  15. تدور سريعة أنبوب 50 مل لمدة 5 s لجمع هلام الحل في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة 125 ميكرولتر من 10٪ محلول بيرسولات الأمونيوم (APS). ضعيها على النوتاتور لمدة 1 دقيقة تقريبًا.
  16. إضافة 25 ميكرولتر من رباعي ميثيل الإيثيلينdiamine (TEMED) ومزيج بعناية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 5 مرات مع ماصة 25 مل تجنب فقاعات.
  17. ماصة في الجل يلقي وبعناية إدراج مشط هلام تجنب فقاعات.
  18. تشديد الختم عن طريق إضافة مقطع الموثق كبيرة على الجزء العلوي من كاسيت.
  19. السماح للجل للبلمرة لمدة 1 ساعة.
  20. بمجرد أن يتعزز الجل، قم بإزالة مشبك الموثق. أدخل الكاسيت في المربع الكهربائي. إضافة 1X TBE العازلة في خزانات أعلى وأسفل.
  21. استرداد رد فعل النسخ. إضافة الماء تصل إلى 100 درجة مئوية، ثم إضافة 100 درجة مئوية من 2X هلام تحميل المخزن المؤقت. إعداد سلم عن طريق خلط الكمية الموصى بها مع الماء إلى 10 درجة مئوية و 10 ميكرولتر من 2X هلام تحميل العازلة إلى أنبوب منفصل 1.5 مل.
  22. احتضان كل من السلم ورد فعل النسخ في المختبر في خلاط حراري في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  23. في حين أن العينات هي denaturing في 70 درجة مئوية، وإزالة بعناية المشط، وتنظيف الآبار عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا كل بئر مع ماصة P1000، وعلى الفور قبل تشغيل لمدة 10 دقيقة في 100 V.
  24. بمجرد الانتهاء من العينات denaturation 15 دقيقة في 70 درجة مئوية، وإزالة الأنابيب من خلاط حراري ووضع على الفور على الجليد.
  25. تنظيف كل بئر من هلام مرة أخرى مع ماصة P1000. تحميل 20 درجة مئوية من سلم على البئر الأول إلى اليسار، 20 درجة مئوية من عينة RNA على 10 آبار منفصلة، و 20 ميكرولتر من 1X هلام تحميل العازلة على الآبار غير المستخدمة.
  26. تشغيل هلام في 100 V لمدة 60-240 دقيقة، اعتمادا على البولي أكريلاميد٪ من هلام.
    ملاحظة: سيتم فصل الأصباغ في مخزن تحميل الجل إلى شريطين أثناء اجتيازها للجل، وشريط أزرق بطيء يهاجر بروموفينول (BB)، وشريط سماوي سريع للزلين سيانول (XC). الهجرة تقريبيّة من هذا نطاق في مختلفة% [بولكريلميد] هلام معروفة (رأيت خطوة 1.11) ويستطيع كنت استعملت أن يقدّم الهجرة ال [رنا] في الهلام.
  27. بمجرد إيقاف الجل، قم بإزالة الجل بعناية من الكاسيت.
  28. ضع الجل في صندوق نظيف يحتوي على حل من 50 مل من 1X TBE العازلة مع 50 درجة مئوية من وصمة عار هلام الحمض النووي وحضانة لمدة 5 دقائق على الروك لوصمة عار الحمض النووي الريبي.
  29. التقاط صورة الختان قبل وبعد الفرقة من هلام على نظام التصوير هلام، ويفضل استخدام الضوء الأزرق بدلا من الأشعة فوق البنفسجية عبر الإضاءة.
  30. قم باستئصال كل نطاق من الاهتمامات باستخدام طرف قطع جل خالي من النوكل. بعد كل بئر، نقل غيض التي تحتوي على شريحة هلام إلى أنبوب 1.5 مل وتدور لفترة وجيزة لجمع شريحة هلام. كرر حتى يتم جمع جميع العصابات في نفس أنبوب 1.5 مل.
  31. بمجرد جمع جميع شرائح الجل، أضف 100 لتر من المياه الخالية من النوكليس أو إلى أنبوب 1.5 مل. يُحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة تقريبًا. وهذا يسمح للRNA للخروج من شرائح هلام في الحل.
  32. بعد 48 ساعة، pipet الماء أو TE العازلة إلى أنبوب 1.5 مل جديدة. تخلص من شرائح الجل المتبقية. تنقية الحمض النووي الريبي عن طريق مجموعة تنظيف على النحو التالي.
    1. معادلة العمود تدور في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    2. إلى 100 درجة مئوية من محلول RNA في أنبوب 1.5 مل جديد من الخطوة 1.32، إضافة 350 درجة مئوية من المخزن المؤقت RLT ومزيج جيدا لمدة 2 دقيقة على nutator. تدور ل1 s في 200 × ز لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.
    3. إضافة 675 درجة مئوية من EtOH 100٪ وتخلط جيدا لمدة 2 دقيقة على nutator. تدور ل1 s في 200 × ز والمضي قدما على الفور إلى الخطوة التالية.
    4. نقل 565 درجة مئوية من الخليط على عمود تدور وتدور لمدة دقيقة واحدة في 15،000 × ز. إفراغ أنبوب جمع عن طريق الطموح.
    5. كرر الخطوة السابقة مع النصف الثاني من العينة.
    6. إضافة 500 درجة مئوية من المخزن المؤقت RPE إلى العمود وتدور لمدة دقيقة واحدة في 15،000 × ز. إفراغ أنبوب جمع عن طريق الطموح.
    7. إضافة 750 درجة مئوية من الإيثانول 80٪ إلى العمود وتدور لمدة دقيقة واحدة في 15،000 × ز. إفراغ أنبوب جمع عن طريق الطموح.
    8. ضع العمود في أنبوب جمع جديد بـ 2 مل مع فتح الغطاء وتدور عند 15000 × ز لمدة 5 دقائق.
    9. نقل العمود إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    10. إضافة 17 درجة مئوية من الماء على وسط العمود وتدور في 15،000 × ز لمدة دقيقة واحدة إلى elute. Elute مرة أخرى باستخدام آخر 17 ميكرولتر من الماء. يجب أن يكون إجمالي حجم المستردة 32 درجة مئوية.
  33. مزيج جيدا عن طريق الدوامة، pipet 1.5 € L وقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف ية الحجم الدقيق.
  34. تحقق من جودة تنقية الحمض النووي الريبي عن طريق اليوريا denaturing هلام بولياكريلاميد كما هو الحال في الخطوات 1.11-1.29.

2. في المختبر الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز الاختبار

  1. إعداد 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز في أنبوب 1.5 مل على الجليد على النحو التالي: 23 ميكرولتر من الماء، 10 ميكرولتر من 10X TBS (500 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.5؛ 1.5 M كلوريد اللون)، 2 ميكرولتر من 0.05 M EDTA، 5 ميكرولتر من 100 MM DTT ، 40 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين، 4 ميكرولتر من 58 ميكرومتر 3H-SAM، 5 ميكرولتر من 20X كوكتيل مثبط البروتياز، 1 ميكرولتر من RNaseOUT (اختياري)، 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي و 5 ميكرولتر من ميثيل ترانسفيراز.
    تحذير: المواد المشعة ثلاثية التطفل خطرة وينبغي التعامل معها فقط أثناء ارتداء القفازات، ومعطف المختبر وأي معدات الوقاية الشخصية الضرورية الأخرى. وتعتبر جميع نصائح الماصات والأنابيب التي تلامس المواد المشعة نفايات مشعة صلبة. التخلص من جميع النفايات المشعة الصلبة والسائلة وفقا لبروتوكول النفايات المشعة المعتمد ة في المختبر.
    ملاحظة: تضمين عينات التحكم دون methyltransferase وبدون الحمض النووي الريبي. قد تتطلب تركيزات الكاشف تحسين و/أو إدراج أملاح الموجبة ثنائية التكافؤ، مثل MgCl2، أو SAM غير المسمى. والنطاق الأمثل لتركيز الحمض النووي الريبي النهائي هو من 50 نم إلى 1 ميكرومتر، في حين أن تركيز ميثيل ترانسفيراز يتراوح بين 25 نم و300 نم.
  2. يُمزج المزيج جيداً عن طريق التفواث برفق على الأنبوب. تدور 5 s في 200 × ز لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان الأنبوب (ق) في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  3. تنظيف رد الفعل باستخدام تنقية العمود كما هو الحال في الخطوة 1.32.
    تحذير: كن حذراً جداً للتخلص بشكل صحيح من أي مواد مشعة، لا سيما أثناء غسيل العمود (ماصة من النفايات بدلاً من تَقَوِل النفايات من أنابيب التجميع).
  4. إجراء عدد من التلألؤ السائل
    1. إعداد رف عدد التلألؤ مع قارورة واحدة لكل عينة، قارورة واحدة لقياس الخلفية وقارورة واحدة لاختبار انتقاد. ملء قارورة مع 5 مل من حل العد التلألؤي.
    2. إضافة 10 درجة مئوية من كل عينة RNA المشعة في 1 قارورة، وتشديد الغطاء ومزيج بلطف.
    3. إعداد قارورة اختبار انتقاد. فرك مسحات القطن بدقة على جميع الأسطح والمعدات المستخدمة خلال البروتوكول. إضافة مسحات إلى قارورة مليئة 5 مل من محلول التلألؤ وتشديد الغطاء.
    4. تشغيل العينات على عداد التلألؤ على النحو التالي. فتح غطاء محرك السيارة العداد، وإدراج الرف في الجهاز وإغلاق غطاء محرك السيارة. حدد عدد حامل واحد . حدد تحديد برنامج المستخدم . حدد أو قم بإنشاء برنامج يقيسالتريتيوم (3 H) لمدة 60 s. Hit Count Rack. كرر عدد التلألؤ ثلاث مرات.
      ملاحظة: ستقوم المعدات بقياس عدد اللمعة لكل عينة وإخراج لكل من الشاشة والنسخة المطبوعة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا إذا رغبت في ذلك. يجب تجميد عينات الحمض النووي الريبي المتبقية من الخطوة 2.3 عند -80 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق.
  5. المضي قدما في التصوير التلقائي
    1. إعداد والتشغيل المسبق اليوريا denaturing هلام بولياكريلاميد كما هو الحال في الخطوات 1.11-1.20.
    2. ماصة 20 ميكرولتر من مادة الحمض النووي الريبي المشعة في أنبوب جديد 1.5 مل يحتوي على 20 ميكرولتر من 2X جل تحميل العازلة. اخلطي جيداً. إعداد السلم كما هو الحال في الخطوة 1.21. حضانة العينات في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. غسل آبار هلام مرة أخرى على الفور قبل تحميل العينة. تحميل 20 درجة مئوية من سلم أعدت، 20 ميكرولتر من العينات، و 20 ميكرولتر من 1X هلام تحميل العازلة على الممرات المتبقية. تشغيل هلام في 100 V لمدة 60-180 دقيقة، اعتمادا على نسبة بوليأكريلاميد.
    4. بمجرد انتهاء الجل من التشغيل، قم بإزالة الجل من الكاسيت وضعه في صندوق يحتوي على 50 مل من 1x TBE العازلة مع 5 ميكرولتر من وصمة عار هلام الحمض النووي فائقة الحساسية.
    5. حضانة لمدة 5 دقائق على الروك لوصمة عار الحمض النووي الريبي.
    6. خذ الجل بعناية من الصندوق وضعه على جهاز الأشعة فوق البنفسجية من نظام التصوير هلام مع الآبار حتى وسلم على اليسار.
    7. تركيز الكاميرا على هلام، تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية ومن ثم التقاط صورة للهلام عن طريق تعريض من 50 مللي ثانية إلى 1 ثانية اعتمادا على شدة الإشارة.
    8. قم بإيقاف تشغيل التعرض للأشعة فوق البنفسجية، واحفظ الصورة كملف Tiff.
    9. ضع الجل مرة أخرى في المربع. إزالة TBE. إصلاح هلام مع 50 مل من إصلاح الحل (50٪ الميثانول، 10٪ حمض الخليك، 40٪ المياه النقية جدا) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك.
    10. حرك الجل برفق مرة أخرى إلى صندوق أسود جديد يحتوي على 25 مل من محلول تعزيز التصوير الشعاعي التلقائي. في غياب مربع أسود، وتغطية مربع مع رقائق الألومنيوم لحماية الحل من الضوء.
    11. حضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك.
    12. رفع بلطف هلام ووضعها وجها إلى أسفل على ورقة من البلاستيك التفاف مع الآبار حتى وسلم على الجانب الأيمن. وضع ورقتين من ورقة الكروماتوغرافيا على الجزء الخلفي من هلام. قم بقلب المكدس بأكمله بلطف.
    13. سخني مجفف الجل مسبقاً إلى 80 درجة مئوية. العودة إلى الغطاء البلاستيك على مجفف هلام. إدراج التفاف، هلام والكروماتوغرافيا كومة الورق تحت الغطاء البلاستيك ونقل الغطاء البلاستيك مرة أخرى إلى أسفل لإنشاء ختم.
    14. يجف لمدة 1 ساعة عند 80 درجة مئوية في مجفف الجل.
    15. قم بإيقاف مجفف الجل وإزالة المكدس برفق. قم بإزالة اللف والورق اللوني الثاني. الشريط ورقة الكروماتوغرافيا المتبقية مع هلام المجففة في كاسيت autoradiogram.
    16. أضف ورقة واحدة من فيلم التصوير الشعاعي التلقائي في الغرفة المظلمة.
    17. وضع كاسيت في -80 درجة مئوية وتطوير الفيلم بعد 1 ساعة إلى 4 أسابيع اعتمادا على كثافة الإشارة، والتي يمكن الحكم عليها على أساس عدد التلألؤ قياسها سابقا: 1-4 أسابيع ل 250-1000 cpm، 24 ساعة إلى 1 أسبوع ل 1،000-10،000 كب م و 1 ساعة إلى 24 ساعة ل > 10،000 cp م.
    18. بمجرد تطوير الفيلم، ضع الفيلم على رأس الكاسيت ووضع علامة بعناية مع علامة مختبر حواف 4 من هلام، كل بئر، وموقف الأصباغ XC وBB.
    19. امسح الفيلم بالمسح الضوئي بدقة 300 أو 600 بكسل لكل بوصة واحفظ الصورة كملف Tiff.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

رد فعل النسخ في المختبر
الشكل 2 يمثّل [ا] شوط نموذجيّة من [إينترو فيترو] نسخ ردّ فعل مع ال [ت7] [رنا] [بولمرس] من ال [7سك] [سنرنا], أيّ يكون نسبيّا قصيرة (331 [نت]) وجدّا ينظّم [رنا]. كما هو مبين في تلك الصورة الخام، هناك العديد من العصابات غير المرغوب فيها، على حد سواء أقصر وأطول من 7SK، وربما الناجمة عن بدء النسخ العشوائي أو أحداث الإنهاء. وبسبب هذا، تنقية هلام بعد رد فعل النسخ في المختبر من المهم الحصول على عينة RNA نظيفة كما هو مبين في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، يتم الإبلاغ عن طريقة بسيطة وقوية للتحقق في المختبر من نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز نحو نسخ محددة. ويستفيد الفحص من حقيقة أن الميثيونين S-adenosyl يمكن أن يكون tritiated على المانحة مجموعة الميثيل (الشكل1)،مما يسمح لRNA ميثيلات إلى الكشف بدقة دون استخدام الأجسام المضادة. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن هذا التقييم لا يمكن أن تشير إلى أي بقايا أو مجموعة كيميائية هو ميثيلات من قبل الإنزيم. ولتحديد أو التحقق من أن بقايا معينة قد طُرِّمت، يمكن استخدام أساليب أخرى مثل تحليل الطفرات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور تورجا كانتي ديبناث على مساعدته في شركة ChemDraw. ويدعم البحوث في مختبر Xhemalçe من قبل وزارة الدفاع - برنامج البحوث الطبية الموجهة من الكونغرس - جائزة اختراق سرطان الثدي (W81XWH-16-1-0352)، NIH منحة R01 GM127802 والأموال الناشئة من معهد الخلوية والخلوية البيولوجيا الجزيئية وكلية العلوم الطبيعية في جامعة تكساس في أوستن، الولايات المتحدة الأمريكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 نقطة أساس سلم الحمض النوويInvitrogen10821-01510 نقطة أساس DNA سلم كيت.
10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS)   ؛N / AN / Aلجل بولي أكريلاميد تغيير طبيعة اليوريا (ل 10 مل ، قم بإذابة 1 جم في 8 مل من ماء مللي كيو ؛ اضبط الحجم على 10 مل بماء مللي كيو ؛ قم بتصفية المحلول باستخدام حقنة 10 مل مجهزة ب 0.45 & micro ؛ مرشح م).
10X TBE BufferN / AN / Aلجل بولي أكريلاميد تغيير طبيعة اليوريا (لمدة 1 لتر ، أضف 108 جم من Tris Base ، و 55 جم من حمض البوريك إلى أسطوانة مع شريط تحريك ؛ أضف 800 مل من الماء المقطر واتركه يذوب ؛ أضف 40 مل من 0.5 M Na2EDTA (درجة الحموضة 8.0) ؛ اضبط الحجم إلى 1 لتر بماء milliQ ؛ قم بتصفية المحلول باستخدام 0.22 & micro ؛ مرشح م).
10 × تيرابايتN / AN / Aللحصول على 1 لتر ، أضف 60.5 جم من Tris Base ، و 87.6 جم من كلوريد الصوديوم إلى أسطوانة بقضيب تقليب ؛ أضف 800 مل من الماء المقطر واتركها تذوب ؛ اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز ؛ اضبط الحجم على 1 لتر بماء milliQ ؛ قم بتصفية المحلول باستخدام 0.22 & micro ؛ مرشح م. 
أكريلاميد: Bis-Acrylamide 29: 1 (40٪ محلول / الرحلان الكهربائي) ، Fisher BioReagentsFisherBP1408-1لتغيير طبيعة اليوريا جل بولي أكريلاميد.
أدينوسيل-ل-ميثيونين, S- [ميثيل-3H]; (سام [3 ح])بيركين إلمرNET155V250UCلمثيلة الحمض النووي الريبي في المختبر ؛ التركيز = 1.0 ملي Ci / مل ؛ نشاط محدد = 17.1 Ci / mmol ؛ المولارية =
(1.0 Ci / L) / (83.2 Ci / mmol) = 0.0584 مليمول / لتر = 58.4 µ ؛ M.   ؛   عند استلام أنبوب 3H-SAM المجمد ، قم بإذابة الثلج عند 4 درجات ؛ C ، جعل 20 & micro ؛ L aliquots ، وتجميدها عند -30 درجة مئوية. لا تقم أبدا بإعادة تجميد وإعادة استخدام حصة مستخدمة جزئيا.
أمرشام هايبر كاسيت التصوير الشعاعي الذاتي كاسيتGE HealthcareRPN11649للتعرض لهلام الأشعة الذاتية.
Amersham Hyperfilm MPHealthcare 28906846للتعرض لجل التصويري الذاتي.
عداد الوميضبيكمانLS6500لعدد التلألؤ السائل.
نظام الرحلان الكهربائي الأفقي الصغير BioradBiorad1704466نظام الرحلان الكهربائي الأفقي الصغير.
أقراص كوكتيل مثبطات البروتياز الخالية من EDTARoche Applied Science4693159001للحصول على محلول 20X ، قم بإذابة قرص واحد في 0.525 مل من الماء الخالي من النوكلياز.
Criterion CellBiorad345-9902RNase كاسيت فارغ مجاني لهلام بولي أكريلاميد.
معيار الكاسيت الفارغةBiorad1656001خلية الرحلان الكهربائي العمودي بتنسيق متوسط.
الطيف الضوئي DeNovix DS-11 مقياس الطيف الضوئي ذو الحجم الصغيرDeNovixDS-11-Sلقياس تركيز الحمض النووي والحمض النووي الريبي.
Ecoscint OriginalNational DiagnosticsLS-271لعدد التلألؤ السائل.
قوارير فيشربراند 7 مل HDPE تلألؤفيشر03-337-1لعدد التلألؤ السائل.
محسن التصوير الشعاعي الذاتي سريع المفعول Fluoro-HanceRPI CORP112600للمعالجة المسبقة لهلام الأشعة الذاتية.
جل مجففBiorad1651745لتجفيف الجل.
Gel Loading Buffer IIAmbionAM8547لتحميل الحمض النووي الريبي في تغيير طبيعة هلام اليوريا بولي أكريلاميد (التركيب: 95٪ فورماميد ، 18 ملي مولار EDTA ، و 0.025٪ SDS ، زيلين سيانول ، وبروموفينول أزرق).
نصائح استئصال الجل القابل للتصرف GeneCatcherشركة GelNC9431993لإزالة العصابات من المواد الهلامية الاغاروز والبولي أكريلاميد.
Megascript KitAmbionAM1333للنسخ في المختبر مع T7 RNA polymerase. 
Perfectwestern Extralarge ContainerGenhunter CorporationNC9226382 (شفاف) / NC9965364 (أسود)صندوق تلطيخ جل.
pRZAddgene# 27663البلازميد لإنتاج نصوص في المختبر بنهايات متجانسة
Qiagen RNeasy MinElute CleanupQiagen74204لتنظيف الحمض النووي الريبي ، استخدم البروتوكول المعدل الوارد في البروتوكول.
طقم استخراج جل QIAquick (50)مجموعة Qiagen28704لاستخراج الجل وتنظيف جزء dsDNA المستخدم في النسخ في المختبر.
ساران بريميوم بلاستيك التفافسارانراب أمازونلتجفيف الجل.
SYBR GoldInvitrogenS11494صبغة هلام الحمض النووي فائقة الحساسية.
SYBR SafeInvitrogenS33102صبغة هلام الحمض النووي.
TESigma93283-100ML10 ملي Tris-HCl ، 1 ملي مولار ثنائي الصوديوم EDTA ، درجة الحموضة 8.0
TEMEDFisher110-18-9لتغيير طبيعة اليوريا جل بولي أكريلاميد.
خلاط حراري مع أنابيب SMARTBLOCK 24X 1.5 ملeppendorf5382000023 / 5361000038لحضانة أنابيب 1.5 مل للتحكم في درجة الحرارة.
تقنياتالحياة لمجموعة الاستنساخ TOPO TAللاستنساخ السريع ل Taq polymerase & ndash ؛ تضخيم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى نواقل تحتوي على محفزات T7 و / أو SP6 لنسخ الحمض النووي الريبي في المختبر.
TURBO DNase (2 U & frasl ؛ ومايكرو. L)AmbionAM2238لإزالة الحمض النووي من تفاعلات النسخ في المختبر.
اليورياسيجما51456-500 جراملجل بولي أكريلاميد تغيير طبيعة اليوريا.
ورق Whatman 3MMGE Healthcare3030-154ورق كروماتوغرافيا لتجفيف الجل.
GE من مقياس مجموعات

المراجع

  1. Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
  2. Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).
  3. Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
  4. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  5. Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
  6. Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
  7. Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
  8. Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
  9. Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
  10. Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
  11. Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
  13. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).
  14. Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
  15. Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
  16. Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
  17. Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).
  18. Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
  19. Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
  20. Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RNA RNA
فحص الأجسام المضادة الحرة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.