هنا، نقدم بروتوكولًا لتوليد بيانات نسخ عالية الجودة وواسعة النطاق لخلايا واحدة من جزر البنكرياس البشرية المعزولة باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المستندة إلى قطرات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتكون جزر البنكرياس من خلايا الغدد الصماء ذات أنماط التعبير الهرموني المميزة. تظهر خلايا الغدد الصماء اختلافات وظيفية استجابة للظروف الطبيعية والمرضية. والهدف من هذا البروتوكول هو توليد بيانات عالية الجودة وواسعة النطاق لنسخ كل نوع من خلايا الغدد الصماء باستخدام تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية القائمة على قطرات. ويمكن استخدام هذه البيانات لبناء ملف تعريف التعبير الجيني لكل نوع من خلايا الغدد الصماء في الظروف العادية أو المحددة. تتطلب العملية معالجة دقيقة، وقياس دقيق، ومراقبة صارمة للجودة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف الخطوات التفصيلية لانفصال جزر البنكرياس البشرية، والتسلسل، وتحليل البيانات. وتبين النتائج التمثيلية لنحو 000 20 خلية من خلايا الISlet البشرية المفردة التطبيق الناجح للبروتوكول.
المقدمة
جزر البنكرياس الإفراج عن هرمونات الغدد الصماء لتنظيم مستويات الجلوكوز في الدم. وتشارك خمسة أنواع خلايا الغدد الصماء، والتي تختلف وظيفيا ومورفولوجية، في هذا الدور الأساسي: α-الخلايا تنتج الجلوكاجون، بيتا خلايا الأنسولين، δ-الخلايا somatostatin، PP خلايا البنكرياس الببتيد، والخلايا الغريلين1. تحديد سمات التعبير الجيني هو نهج مفيد لتوصيف خلايا الغدد الصماء في الظروف العادية أو المحددة. تاريخيا، تم إنشاء التنميط التعبير الجيني للعد كله باستخدام microarrayوالجيل التالي RNA تسلسل 2،3،4،5،6،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تفكك الشهيالبشري
- الحصول على الجزر البشرية المعزولة من المتبرعين بأعضاء الجثث من أي من الجنسين، الذين تتراوح أعمارهم بين 15-80 سنة، دون أمراض موجودة من قبل ما لم تكن هناك حاجة إلى الجزر من الجهات المانحة ذات التركيبة السكانية المحددة لغرض الدراسة.
- بعد العزلة، وأبقى الجزر المعزولة في مرفق زراعة الأنسجة لمدة 2-3 أيام في المورد. غالباً ما يستغرق أكثر من يوم واحد لأضرار الشليس لتصبح مرئية.
- ضع الجزر في زجاجة واغمرها بالكامل في وسط جزيرة. أحضرها إلى المختبر عن طريق الشحن ة ليلاً
- الحصول على كمية مكافئة للجزيرة (IEQ) من الجزر المشحونة من مورد الجزر.
- استرداد الجزر من الشحنة في يوم وصول جزيرة. تنفيذ هذه الخطوة باس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتكون سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من ثلاث خطوات: فصل الجزر البشرية السليمة إلى تعليق خلية واحدة، والتقاط خلاياواحدة باستخدام تقنية قائمة على قطرات، وتحليل بيانات RNA-seq (الشكل 1). أولاً، تم احتضان الجزر البشرية المكتسبة بين عشية وضحاها. تم فحص الجزر سليمة تحت المجهر (الشكل2A). تم التحقق من سلامة خلايا الإسليست المنفصلة باستخدام الفلورة RNA في الموقع التهجين (RNA-FISH). وكما هو مبين في الشك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توفر تقنيات الخلايا الواحدة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة منصة جديدة لتوصيف أنواع الخلايا ودراسة التغاير الجزيئي في جزر البنكرياس البشرية. اعتمدنا بروتوكول عزل الخلايا الواحدة الدقيقة المستندة إلى قطرات صغيرة وتحليل البيانات لدراسة الجزر البشرية. بروتوكولنا أنتج بنجاح الحمض النووي الريبي تسلسل البيانات من أكثر من 20،000 خلايا جزيرة بشرية واحدة مع اختلافات صغيرة نسبيا في جودة التسلسل والآثار دفعة.
وعلى وجه الخصوص، هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول لتحقيق نتائج عالية الجودة. يجب توخي ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
جميع المؤلفين هم من الموظفين والمساهمين في شركة Regeneron للمستحضرات الصيدلانية.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 30 وميكرو ؛ مرشحات ما قبل الفصل | م Miltenyi Biotec | 130-041-407 | مصفاة خلية |
| 8 غرف شرائح | Chemometec | 102673-680 | شرائح فحص العد من Dell محلل |
| حيوي عالي الحساسية مجموعة الحمض النووي | Agilent | 5067-4626 | لألبومين |
| مصل الأبقار | QC Sigma-Aldrich | A9647 | وسائط خلية واحدة |
| الكروم خلية واحدة 3 'مكتبة & مجموعة حبة الجل v2 ، 16 rxns | 10X الجينوم | 120237 | كواشف خلية واحدة |
| الكروم أحادية الخلية A رقاقة كيت v2 ، 48 rx (6 رقائق) | 10X الجينوم | 120236 | رقائق الموائع |
| الدقيقة CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530-037 | وسائط جزيرة كاملة |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | Elution |
| buffer Eppendorf لوحة PCR مزدوجة التيك ، 96 بئر ، أزرق ، نصف تنورة | VWR | 47744-112 | لوحة مستحلب |
| مصل الأبقار الجنيني | ThermoFisher | 16000-036 | وسائط جزرية كاملة |
| الجزر البشرية | مختبرات برودو | HIR | جزر بشرية معزولة |
| L-Glutamine (200 ملم) | ThermoFisher | 25030-081 | وسائط جزرية كاملة |
| مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي Nextera (96 عينة) | Illumina | FC-121-1031 | كواشف التحضير |
| NextSeq 500/550 مجموعة عالية الإنتاج v2.5 (75 دورة) | Illumina | FC-404-2005 | تسلسل |
| البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) ThermoFisher | 15140-122 | وسائط جزيرة | |
| كاملة Qubit عالية الحساسية dsDNA Kit | تقنيات الحياة | Q32854 | لحل مراقبة الجودة |
| 18 | Chemometec | 103011-420 | عد الخلايا كاشف |
| SPRISelect كاشف | فيشر Scientific | B23318 | حبات تنقية |
| أطباق زراعة الأنسجة (10 سم) | VWR | 10861-594 | لثقافة الجزر |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | محلول تفكك الخلايا |
| Zymo DNA Clean & المكثف -5 ، 50 تفاعلا | VWR | 77001-152 | أعمدة تنظيف المكتبة |
المراجع
- Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
- Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
