مقالة منهجية

تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس

11.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59876

⸱

سبتمبر 12, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Virology, School of Systems Biology, George Mason University, 2American Type Culture Collection (ATCC), 3ATCC Cell Systems, 4Ceres Nanosciences, Inc, 5Department of Immunology and Nano-medicine, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يعزل هذا البروتوكول الحويصلات خارج الخلية (EVs) بعيدا ً عن virions ذات الكفاءة العالية والغلة من خلال دمج هطول الأمطار EV، وكثافة تدرج ultracentrifugation، والتقاط الجسيمات للسماح لسير عمل مبسط والحد من بدء متطلبات الحجم، مما أدى إلى الاستعدادات القابلة للاستنساخ لاستخدامها في جميع البحوث EV.

الملخص

واحدة من العقبات الرئيسية في مجال أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV) اليوم هو القدرة على تحقيق الاستعدادات EV تنقية في إعداد العدوى الفيروسية. والمقصود من الطريقة المعروضة عزل المركبات الكهربائية بعيدا عن virions (أي فيروس نقص المناعة البشرية-1)، مما يسمح بكفاءة أعلى وغلة أعلى بالمقارنة مع الأساليب التقليدية فائقة التثخاف. بروتوكولنا يحتوي على ثلاث خطوات: هطول الأمطار EV، فصل تدرج الكثافة، والتقاط الجسيمات. يمكن تشغيل الاختبارات النهائية (أي اللطخة الغربية، وPCR) مباشرة بعد التقاط الجسيمات. هذه الطريقة مفيدة على طرق العزل الأخرى (أي ultracentrifugation) كما أنه يسمح لاستخدام الحد الأدنى من وحدات التخزين الأولية. وعلاوة على ذلك، فهو أكثر سهولة للمستخدم من أساليب عزل EV البديلة التي تتطلب خطوات متعددة فائقة التثاقل. ومع ذلك، فإن الطريقة المعروضة محدودة في نطاق اختبارات EV الوظيفية حيث أنه من الصعب أن elute EVs سليمة من جزيئاتنا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة مصممة خصيصاً لتهيئة بيئة قائمة على البحوث بحتة ولن تكون مجدية تجارياً.

المقدمة

تركز البحث حول الحويصلات خارج الخلية (EVs)، وعلى وجه التحديد exosomes، وهو نوع من EV تتراوح بين 30-120 نانومتر وتتميز بوجود ثلاثة علامات تيتراسبانين CD81، CD9، وCD63، وقد شكلت إلى حد كبير من خلال تطوير أساليب لعزل و تنقية الحويصلات من الفائدة. وقد أعيقت القدرة على تشريح الآليات المتعددة الأوجه بسبب التقنيات المعقدة والمستهلكة للوقت التي تولد عينات تتألف من مجموعة غير متجانسة من الحويصلات المتولدة عبر مسارات مختلفة مع مجموعة واسعة من المحتويات والأحجام، و الكثافه. في حين أن هذه مسألة لجميع البحوث EV تقريبا، فإنه من أهمية خاصة عند دراسة المركبات الكهربائية في سياق العدوى الفيروسية، كما virions والجسيمات الشبيهة بالفيروس (VLPs) يمكن أن تكون مماثلة في القطر إلى الحويصلات ذات الأهمية. فعلى سبيل المثال، يبلغ قطر فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) حوالي 100 نانومتر، وهو تقريبا نفس حجم العديد من أنواع المركبات الكهربائية. لهذا السبب، قمنا بتصميم سير عمل عزل EV جديد لمعالجة هذه المشكلات.

المعيار الذهبي الحالي لعزل EV هو فائق التحامل. هذه التقنية تستفيد من مختلف الكثافات الحويصلة، مما يسمح للحويصلات أن تكون مفصولة بالطرد المركزي مع الترسيب التفاضلي للجسيمات ذات الكثافة العالية مقابل جزيئات الكثافة المنخفضة في كل مرحلة 1،2. وهناك عدة خطوات الطرد المركزي منخفضة السرعة مطلوبة لإزالة الخلايا السليمة (300-400 × ز لمدة 10 دقائق)، وحطام الخلايا (~ 2000 × ز لمدة 10 دقائق)، والهيئات المبرمجة / الحويصلات الكبيرة (~ 10،000 × ز لمدة 10 دقائق). ويلي عمليات التنقية الأولية هذه عمليات الإزالة الفائقة السرعة العالية (000 100-000 200 x ز لمدة 1.5-2 ساعة) إلى المركبات الكهربائية للرواسب. يتم تنفيذ خطوات غسل لمزيد من ضمان نقاء EV، ومع ذلك، وهذا يؤدي إلى خفض عدد المركبات الكهربائية المعزولة، وبالتالي خفض العائد الإجمالي 3،4. كما أن فائدة هذه الطريقة محدودة بسبب متطلبات عدد كبير من الخلايا (حوالي 1 × 108) وحجم عينة كبير (> 100 مل) لتحقيق نتائج كافية.

ولمعالجة الشواغل المتزايدة، أصبح هطول الأمطار من الحويصلات مع البوليمرات المائية تقنية مفيدة في السنوات الأخيرة. البولي ايثيلين غليكول (PEG)، أو غيرها من الكواشف هطول الأمطار ذات الصلة، يسمح للمستخدم لسحب أسفل الحويصلات، والفيروسات، والبروتين أو البروتين الحمض النووي الريبي المجاميع داخل عينة ببساطة عن طريق احتضان العينة مع الكواشف من الاختيار، تليها واحدة منخفضة السرعة الطرد المركزي1،2،5. لقد أبلغنا سابقا أن استخدام PEG أو الأساليب ذات الصلة لتسريع المركبات الكهربائية بالمقارنة مع نتائج ultracentrifugation التقليدية في عائد أعلى بكثير6. هذه الاستراتيجية سريعة وسهلة، لا تتطلب معدات إضافية باهظة الثمن، ويمكن تطويرها بسهولة، ويحتفظ هيكل EV. ومع ذلك، ونظرا لطبيعة منحرفة من هذه الطريقة، والعينات الناتجة تحتوي على مجموعة متنوعة من المنتجات بما في ذلك البروتينات الحرة، ومجمعات البروتين، ومجموعة من المركبات الكهربائية، وبالتالي تتطلب المزيد من تنقية للحصول على السكانالمطلوب1 ،2،7،8.

وللتغلب على عدم تجانس المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها من مختلف أساليب هطول الأمطار، يُستخدم تدرج الكثافة الفائق (DG) لفصل الجسيمات على نحو أفضل استناداً إلى كثافتها. يتم تنفيذ هذه الطريقة باستخدام تدرج تدريجي باستخدام وسيط تدرج الكثافة، مثل iodixanol أو السكروز، والذي يسمح لفصل المركبات الكهربائية من البروتينات، ومجمعات البروتين، وجزيئات تشبه الفيروس أو الفيروس (VLPs). ومن المهم ملاحظة أنه في حين كان يعتقد في وقت من الأوقات أن المديرية العامة سمحت بفصل أكثر دقة بين التجمعات السكانية الفرعية للEV، فمن المعروف الآن أن الأحجام والكثافات من الحويصلات المختلفة يمكن أن تتداخل. على سبيل المثال، من المعروف أن exosomes لديها كثافات التعويم من 1.08-1.22 غرام / مل9،في حين أن الحويصلات المعزولة من غولجي (COPI+ أو clathrin+) لديها كثافات من 1.05-1.12 غرام / مل وتلك من الشبكية endoplasmic (COPII+ ) الرواسب في 1.18-1.25 غرام / مل1،2،3،4،9. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المرء يرغب في مقارنة الكسور الخارجية مع الكسور التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية، وهذا قد يصبح أكثر صعوبة اعتمادا على كثافة الفيروس من الفائدة - هناك فيروسات أخرى غير فيروس نقص المناعة البشرية-1 التي من المرجح أن توازن في نفس الكثافات والكسور الإيجابية الخارجية2.

وأخيرا، فإن إثراء الإعدادية EV للتصور المصب والاختبارات الوظيفية أمر حيوي لبحوث EV. استخدام الجسيمات النانوية التي تثري EV، وعلى وجه التحديد، جزيئات هيدروجيل متعددة الوظائف التي تتراوح بين 700-800 نانومتر في القطر، هي خطوة حاسمة في تحقيق الإعدادية EV المركزة. أنها تمتلك طعم العطرية تقارب عالية التي مغلفة بقذيفة غرب مسامية غرب المنال لتعزيز الانتقائية. وتشمل الجسيمات النانوية المستخدمة في هذه الدراسة إعدادين متميزين مع طعوم أساسية مختلفة (رد الفعل الأحمر 120 NT80؛ وCibacron Blue F3GA NT82) التي أظهرت زيادة التقاط المركبات الكهربائية من مختلف الكواشف والسوائل الحيوية (انظر جدول المواد )6،10،11،12،13،14،15. الجسيمات توفر سهولة إثراء المركبات الكهربائية من العديد من المواد بدءا بما في ذلك كسور iodixanol، supernatant ثقافة الخلية، فضلا عن السوائل الحيوية المريض مثل البلازما، المصل، السوائل الشوكية الدماغية (CSF)، والبول6،13 .

الطريقة المعروضة هنا يحسن كفاءة تقنيات تنقية EV الحالية من خلال الجمع بين العديد من التكنولوجيات; EV هطول الأمطار، كثافة التدرج ultracentrifugation، والتقاط الجسيمات، لتبسيط سير العمل، والحد من متطلبات العينة، وزيادة العائد للحصول على عينة EV أكثر تجانسا للاستخدام في جميع البحوث EV. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في التحقيق في المركبات الكهربائية ومحتوياتها خلال العدوى الفيروسية كما أنه يتضمن خطوة ترشيح 0.22 ميكرومتر لاستبعاد الحويصلات الكبيرة وغير المرغوب فيها وVLPs والفصل بين مجموع السكان EV على أساس الكثافة إلى فعالية عزل المركبات الكهربائية من virions.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الترشيح وهطول الأمطار من الحويصلات خارج الخلية (EVs)

  1. لإعداد الثقافة الفائقة من الخلايا المصابة أو المنقولة (أي خطوط الخلايا و/أو الخلايا الأولية)، والثقافة حوالي 10 مل من الخلايا المتأخرة لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ثاني أكسيد الكربون في وسط الثقافة المناسبة (أي RPMI أو DMEM مع 10٪ من البقر الجنيني المصل [FBS]).
    ملاحظة: يجب أن تكون جميع الكواشف المتوسطة الثقافة خالية من المركبات الكهربائية، ويمكن شراؤها إما (انظر جدول المواد)أو أعدت في المنزل عن طريق ما قبل ultracentrifugation المصل في 100،000 × ز لمدة 90 دقيقة. وقد نجح هذا البروتوكول لعدة خطوط الخلايا الشائعة الاستخدام بما في ذلك: CEM، Jurkat، 293T، U937 (خطوط غير مصابة)، U1، J1.1، ACH2، HUT102، MT-2 (HIV-1 وHTLV-1 خطوط المصابة)، والخلايا المتحولة متعددة، والخلايا الرئيسية والخلايا T (كلاهما المصابة وغير المصابة)؛ ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لأي نوع خلية، بما في ذلك تلك التي تتطلب وسائط متخصصة أو ظروف الثقافة. قد تحتاج كثافة الخلايا إلى تحسين أنواع الخلايا المختلفة. من المستحسن أن يتم استخدام أعلى كثافة مع الحد الأدنى من موت الخلايا بعد 5 أيام.
  2. طرد مركزي الثقافة في 3000 × ز لمدة 5 دقائق إلى خلايا بيليه وتجاهل بيليه.
  3. تصفية supernatant الثقافة باستخدام مرشح معقمة 0.22 م وجمع filtrate في أنبوب نظيفة.
  4. إضافة حجم متساو من الكاشف الترسيب PEG (نسبة 1:1) إلى supernatant تصفيتها. عكس أنبوب عدة مرات لضمان خليط متجانس.
    ملاحظة: لا دوامة.
  5. يحضن خليط في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (O / N).
  6. خليط الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لإنتاج بيليه EV غير متجانسة.
    ملاحظة: EV بيليه يجب أن تظهر بيضاء أو بيضاء في اللون.
  7. تجاهل ثقافة EV المنضبة.
  8. إعادة تعليق بيليه EV في 150-300 درجة مئوية من 1X الفوسفات المخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS) والحفاظ على الجليد.

2. بناء تدرج الكثافة

  1. مزيج iodixanol كثافة التدرج المتوسطة مع 1X PBS لخلق 11 مختلفة 1 مل كسور الكثافة من 6 إلى 18٪ iodixanol في 1.2٪ زيادات في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة منفصلة كما هو مبين في الشكل 1A.
  2. دوامة كل أنبوب لخلط.
  3. كسور كثافة الطبقة في أنبوب فائق الطاردة للتأرجح تم تنظيفه مسبقًا وجافًا بدءًا من #18 الكسر وانتهاءً #6 الكسر كما هو موضح في الشكل 1B.
    ملاحظة: وينبغي تطهير جميع الأنابيب باستخدام رذاذ التبييض 10٪ تليها البخاخة 3X مع الماء منزوع الأيونات وغسل نهائي من المياه المعقمة منزوعة الأيونات قبل تحميل الكسور التدرج.
  4. أضف بيليه EV المعلق (300 درجة مئوية) إلى الجزء العلوي من التدرج الطبقات في أنبوب الطاردالفائق.
  5. فائق الطرد المركزي في 100،00 × غرام في 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  6. قم بإزالة الكسور التي تعمل بمليون لتر بعناية من أنبوب الطاردة للطرد المركزي فائقة ونقل كل كسر إلى أنابيب مركزية جديدة.

3. إثراء كسور EV uusing الجسيمات النانوية

  1. إنشاء الطين 30٪ من الجسيمات النانوية باستخدام كميات متساوية من NT80، NT82، و 1X PBS.
    ملاحظة: وينبغي أن يكون الخليط دوامة قبل استخدامها لضمان التجانس.
  2. إضافة 30 درجة مئوية من الطين إلى كل أنبوب الطرد المركزي الصغير التي تحتوي على كسور الكثافة والماصة / عكس لهم عدة مرات لخلط.
  3. تدوير EV-إثراء الجسيمات النانوية التي تحتوي على كثافة كسر أنابيب الطرد المركزي الصغيرة O / N في 4 درجة مئوية في حوالي 20 دورة في الدقيقة.
  4. أنابيب الطرد المركزي الكثافة الكسر microcentrifuge في 20،000 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
  5. تجاهل السائل وغسل EV بيليه مرتين مع 1X PBS.
    ملاحظة: يمكن تجميد كريات الجسيمات النانوية عند -20 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لمختلف الاختبارات النهائية (أي PCR، ووصمة عار غربية، وقياس الطيف الكتلي، وغيرها من الاختبارات).

4. التحضير الموصى بها من الجسيمات النانوية بيليه لتجارب المصب

  1. لعزل الحمض النووي الريبي
    1. إعادة تعليق بيليه في 50 درجة مئوية من المياه المزيلة الأيونات الأوتوكلاف المعالجة مع 0.001٪ ثنائي إيثيل البيروكربونات (DEPC) تصفيتها من خلال مرشح 0.2 م وعزل الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للطقم.
  2. لجل الكهربائي
    1. إعادة تعليق بيليه مباشرة في 15 درجة مئوية من العازلة Laemmli.
    2. عينة الحرارة 3X في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق دوامة بلطف وتدور بين كل دورة الحرارة.
    3. عينة الطرد المركزي ل15 s في 20،000 × ز وتحميل جميع المواد eluted مباشرة على هلام.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، حدد كمية الجسيمات المحملة على الجل وتشغيل الجل في 100 فولت لضمان احتواء أي جزيئات متبقية إلى الآبار.
  3. لهضم التربسين
    1. إعادة تعليق بيليه في 20 درجة مئوية من اليوريا قبل الألكلة وtrypsinization العينة. يمكن أن تُوَرِّب الجسيمات النانوية بواسطة 14,000 x g centrifugation في RT لمدة 10 دقائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ارتفاع الأمطار في الأمطار إلى ارتفاع ويزيد من العائد على المركبات الكهربائية
نهجنا الجمع بين عزل EV هو أكثر كفاءة بكثير من حيث الانتعاش EV بالمقارنة مع ultracentrifugation التقليدية، كما يتضح من انخفاض 90٪ في حجم المواد الأولية المطلوبة. Ultracentrifugation، المعيار الذهبي الحالي في عزل EV، يتطلب ما يقرب من 100 مل من الثقافة الفائقة لإنتاج الإعدادية EV كافية لتجارب المصب، في حين أن بروتوكولنا الجديد يتطلب فقط 10 مل. وقد أمكن تحقيق هذا الانخفاض من خلال استخدام كاشف هطول...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تسمح الطريقة الموضحة بتعزيز عائد EV وفصل الفيروس عن المركبات الكهربائية باستخدام نهج مركب للعزل. يمكن تصفية كميات كبيرة نسبيا من المواد الأولية (أي الخلية الفائقة) قبل عزل EV عن طريق هطول الأمطار، وفصل DG، وإثراء الجسيمات النانوية، مما يؤدي إلى حجم نهائي قدره ~ 30 درجة مئوية، مما يسمح للاستخدام الفوري في مجموعة متنوعة من المصب الاختبارات. استخدام إثراء الجسيمات النانوية ضروري، بالمقارنة مع ultracentrifugation التقليدية، وقد ثبت هذه الجسيمات النانوية إثراء EV لالتقاط الحويصلات أكثر كفاءة، مما أسفر عن أكبر من أو يساوي كمية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

B.L. هو التابعة لسيريس Nanosciences المؤتمر الوطني العراقي التي تنتج الكواشف و / أو الأدوات المستخدمة في هذه المقالة. ولا يعلن جميع المؤلفين الآخرين عن أي تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

نود أن نشكر جميع أعضاء مختبر كاشانشي، وخاصة جوين كوكس. وقد تم دعم هذا العمل بمنح المعاهد الوطنية للصحة (AI078859، AI074410، AI127351-01، AI043894، وNS099029 إلى F.K.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CEM CD4 + < / sup> الخلايا برنامجكاشف الإيدز NIH117CEM
DPBS بدون Ca و Mg (1x)الجودة البيولوجية114-057-101
ExoMAX Opti-EnhancerSystems BiosciencesEXOMAX24A-1كاشف ترسيب
PEG مستنفد الإكسوسومFBS Thermo Fisher ScientificA2720801
مصل الأبقار الجنينيمصل الذروةPS-FB3مصل
فيروس نقص المناعة البشرية -1 مصابا بخلايا U937 برنامجكاشف المعاهد الوطنية للصحة الإيدز165U1
مرشح حقنة نالجيني 0.2 & م SFCAThermo Scientific723-2520
Nanotrap (NT80)Ceres NanosciencesCN1030أحمر تفاعلي 120 نواة
Nanotrap (NT82)Ceres NanosciencesCN2010Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 UltracentrifugeBeckman CoulterA94471
OptiPrep Density Gradient متوسطSigma-AldrichD1556-250mLIodixanol
SW 41 Ti دوار دلو متأرجحبيكمان كولتر331362
أنبوب فائق الوضوح ، 14 مم × 89 مم344059بيكمان
كولتر

المراجع

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653(2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139(2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765(2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24(2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132(2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542(2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695(2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396(2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, Clifton, N.J. 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169(2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362(2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156(2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PEG PCR 1 HIV 1

مقالات ذات صلة