مقالة منهجية

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

DOI:

10.3791/59913

⸱

يوليو 10, 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Center for RNA Biology, The Ohio State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكوللإثراء مواقع ربط الحمض النووي الريبي الذاتية أو "آثار أقدام" من RNA: البروتين (RNP) المجمعات من خلايا الثدييات. وينطوي هذا النهج على هطول يناهي الأمطار المناعية للوحدات الفرعية RNP، وبالتالي يطلق عليه اسم الترسيب المناعي للرنا جنبا إلى جنب (RIPiT).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحمض النووي الريبي المناعي الترسيب جنبا إلى جنب (RIPiT) هو وسيلة لإثراء آثار أقدام الحمض النووي الريبي من زوج من البروتينات داخل RNA: البروتين (RNP) مجمع. يستخدم RIPiT خطوتين تنقية. أولاً، يتبع الترسيب المناعي لوحدة فرعية RNP الموسومة هضم RNase معتدل وما يترتب على ذلك من عدم التنافر تقارب الإنحطاط. يسمح هطول الأمطار المناعي الثاني لوحدة فرعية أخرى RNP بإثراء مركب محدد. بعد إزالة التناطور من RNAs والبروتينات، يتم تحويل آثار أقدام الحمض النووي الريبي إلى مكتبات تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية. على عكس الأشعة فوق البنفسجية الأكثر شعبية (UV) الربط المتصالب تليها المناعيةالتر (CLIP) نهج لإثراء مواقع الربط RBP، RIPiT هو الأشعة فوق البنفسجية crosslinking مستقلة. وبالتالي RIPiT يمكن تطبيقها على العديد من البروتينات الموجودة في interactome RNA وخارجها التي هي ضرورية لتنظيم RNA ولكن لا تتصل مباشرة الحمض النووي الريبي أو الأشعة فوق البنفسجية كروسلينك سيئة إلى RNA. توفر خطوتا التنقية في RIPiT ميزة إضافية لتحديد المواقع الملزمة التي يعمل فيها بروتين الاهتمام بالشراكة مع عامل مساعد آخر. كما تعمل استراتيجية التنقية المزدوجة على تعزيز الإشارة عن طريق الحد من الخلفية. هنا، نحن نقدم إجراء خطوة حكيمة لأداء RIPiT وتوليد مكتبات تسلسل عالية الإنتاجية من آثار أقدام RNA معزولة. كما نلخص مزايا وتطبيقات RIPiT ونناقش بعض قيودها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

داخل الخلايا، يوجد الحمض النووي الريبي في مجمع مع البروتينات لتشكيل RNA: مجمعات البروتين (RNPs). يتم تجميع RNPs حول البروتينات الملزمة RNA (RBPs، تلك التي تربط مباشرة RNA) ولكن أيضا تتألف من غير RBPs (تلك التي تربط RBPs ولكن ليس RNA)، وغالبا ما تكون ديناميكية في الطبيعة. وتعمل الممارسات التجارية التقييدية وعواملها المساعدة بصورة جماعية في إطار الممارسات التجارية الوطنية من أجل تنفيذ الوظائف التنظيمية. على سبيل المثال، في مسار اضمحلال الحمض النووي الريبي (NMD) الذي يتم التوصل إلى هذا التسوس بوساطة هراء، تعترف بروتينات UPF (UPF1 وUPF2 وUPF3b) بالريبوسوم المنهي قبل الأوان. كل من البروتينات UPF يمكن ربط الحمض النووي الريبي، ولكن فقط عندما تجمع معا أن مجمع NMD نشط يبدأ في ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنشاء خطوط الخلية HEK293 مستقرة التعبير عن التتراسيكلين inducible العلم الموسومة بروتين الفائدة (POI)

  1. خلايا البذور HEK293 مع موقع إعادة تركيب فلب متكامل بشكل ملحوظ (FRT) في كثافة 10 × 104 خلايا / مل في متوسط النمو (دولبكو تعديل النسر المتوسطة [DMEM] + 10٪ مصل البقر الجنيني [FBS] + 1٪ البنسلين-ستربتوميسين [بن / العقدية]) في 6- لوحات جيدا. السماح للخلايا بالنمو بين عشية وضحاها في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 (ظروف النمو القياسية لجميع الخطوات اللاحقة).
  2. في اليوم التالي، يجب أن تكون الخلايا ~ 70٪ مترافق. وفقا لبروتوكول الكاشف transfection، transfect FRT الموقع التي تحتوي على خلايا HEK293 مع نسبة 9:1 من pcDNA5-TETO-FLAG-....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وسيؤدي نجاح RIPiT إلى هطول الأمطار المناعية لكل من البروتينات ذات الأهمية وغيرها من البروتينات المعروفة المتفاعلة، وعدم وجود بروتينات غير متفاعلة. وكما هو مُرى في الشكل 3ألف،تم الكشف عن كل من ماغوه وEIF4AIII في الإلتليل RIPiT، ولكن HNRNPA1 لم يكن (الممر 6). وبالتوازي مع ذلك، تم الكشف عن آثار أقدام الحمض النووي الريبي التي تم تنقيتها بالكامل مع مجمعات RNP عن طريق التصوير الشعاعي التلقائي (الشكل3B) أو محلل حيوي (الشكل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نناقش هنا بعض الاعتبارات الرئيسية لتنفيذ RIPiT بنجاح. وقبل كل شيء، يجب تحسين الخطوات التقديمية الفردية لتحقيق أعلى كفاءة ممكنة في كل خطوة. وقد ثبت أن كمية الخرز agarose FLAG لعدد المدخلات من الخلايا الموصوفة هنا لتكون قوية لمجموعة واسعة من البروتينات التي اختبرناها. كما أن جزءا صغيرا فقط من البروتينات الشريكة هو مشترك المناعة مع بروتين FLAG، فإن كمية الأجسام المضادة اللازمة للملكية الفكرية الثانية الفعالة عادة ما تكون منخفضة (أقل من 10 ميكروغرام). RIPiT على نطاق صغير (من لوحة واحدة 10 سم) تليها التحقق من وصمة عار الغربية.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة المعاهد القومية للصحة GM120209 (GS). يشكر المؤلفون ال [أوسوك] [جنوميكس] [كر] موارد مقدّمة لخدماته ([كّك] دعم منحة [نك] [ك] [ب30] [ك16058]).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جل التقارب المضاد للعلمسيجماA2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 & micro; CiPerkinElmerBLU502A250UC
BD محاقن يمكن التخلص منها مع أطراف Luer-Lok (200)Fisher14-823-435
Betaine 5MSigmaB0300
biotin-dATPTriLinkN-5002
biotin-dCTPPerkin ElmerNEL540001EA
Branson Sonifier ، موديل SSE-1برانسون
CircLigase IVWR76081-606ssDNA ligase I
DMEM ، ارتفاع الجلوكوزThermoFisher11995-065
عازلة تحميل الحمض النووي NEB NEB
Dynabeads Protein ALifeTech10002D
Flp-In-T-REx 293 Cell LineThermoFisherR78007
GeneRuler سلم الحمض النوويمنخفض المدىThermoScientificFERSM1203
Hygromycin BThermoFisher10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 wellBio-Rad4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea GelBio-Rad4566033
miRCAT-33 محول 5 & prime ؛ -TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3 &أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
كاشف التعداء Mirus transIT-X2MirusMIR 6004
Mth RNA ligaseNEBE2610S
PE1.0 5 & prime ؛ -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACACGGCTCTTCCGATC * T-3 & prime ؛		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
PE2.0 5 & prime ؛ -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC * T-3 & prime ؛		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
Phenol / Chloroform / Isoamyl Alcohol (25:24: 1 ، درجة الحموضة 6.7 ، 100 مل)FisherBP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x) NEBNEB # 7025
Q5 DNA PolymeraseNEBM0491S / L
RNase I ، E. coli< / em> ، 1,000 UEppicenterN6901K
عمود SPIN-XCorningCLS8160-24EA
حبات StreptavidinThermoFisher60210
Superscript III (SSIII)إنزيم النسخ العكسي18080044 ThermoScientific
SybrGoldThermoFisherS11494وصمة عار هلام الحمض النووي الذهبي
T4 Polynucleotide Kinase-2500UNEBM0201L
T4< / sub>RNL2 Tr. K227QNEBM0351S
TetracyclineSigma87128
قابل للحرارة 5 حاد ؛ التطبيق DNA / RNA LigaseNEBM0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAATTCCA-3′		أيهذا البروتوكول متوافق فقط مع منصة تسلسل Illumina
Typhoon 5 Bimolecular ImagerGE Healthcare Life Science29187191

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
  2. Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA ImmunoprecipitationRIPiT Seq MethodUV Crosslinking IndependentRNA Footprint AnalysisProtein Complex EnrichmentExon Junction ComplexHEK293 CellsFLAG Agarose BeadsMagnetic Bead ConjugationPhenol Chloroform Extraction

مقالات ذات صلة