وقد تم تكييف فحص أدينوكليوتيد أدينين (NADH) المقترنة ATPase لفحص الإنتاجية شبه العالية من مثبطات الموسين جزيء صغير. يتم تشغيل هذا التقييم الحركي في شكل لوحة دقيقة 384 جيدا مع أحجام التفاعل الكلي من 20 ميكرولتر فقط لكل بئر. يجب أن تكون المنصة قابلة للتطبيق على أي إنزيم منتج من ADP تقريبًا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تستخدم إنزيمات ATPase الطاقة الحرة المخزنة في الأدينوسين ثلاثي الفوسفات لتحفيز مجموعة واسعة من العمليات الكيميائية الحيوية الإنجرغوية في الجسم الحي التي لن تحدث تلقائيًا. هذه البروتينات هي حاسمة أساسا لجميع جوانب الحياة الخلوية, بما في ذلك التمثيل الغذائي, انقسام الخلايا, الاستجابات للتغيرات البيئية والحركة. يصف البروتوكول المعروض هنا فحص ادرينالين أدينوكليوتيد (NADH) المقترن بـ ATPase الذي تم تكييفه مع فحص الإنتاجية شبه العالية لمثبطات ATPase جزيء صغير. وقد تم تطبيق هذا القول على عضلة القلب والهيكل العظمي myosin الثاني، وهما المحرك الجزيئي القائم على الأكتين ATPases، كدليل على المبدأ. ويقترن التحلل المائي من ATP إلى أكسدة NADH عن طريق ردود الفعل الأنزيمية في التبيّاع. أولاً، يتم تجديد ADP التي تم إنشاؤها بواسطة ATPase إلى ATP بواسطة بييوروفات كيناز (PK). PK يحفز الانتقال من فوسفونولبيروفات (PEP) إلى بيروفات في نفس الوقت. في وقت لاحق، يتم تقليل بيروفات إلى اللاكتات عن طريق اللاكتات dehydrogenase (LDH)، الذي يحفز أكسدة NADH في نفس الوقت. وبالتالي، يرتبط الانخفاض في تركيز ATP مباشرة بالانخفاض في تركيز NADH، الذي يتبعه تغيير في الفلورة الجوهرية لـ NADH. طالما PEP متاح في نظام رد الفعل، تركيز ADP لا يزال منخفضا جدا، وتجنب تثبيط إنزيم ATPase من قبل المنتج الخاص به. وعلاوة على ذلك، فإن تركيز ATP لا يزال ثابتا تقريبا، مما أسفر عن دورات زمنية خطية. ويتم رصد الفلورة باستمرار، مما يسمح بتقدير سهل لنوعية البيانات ويساعد على تصفية القطع الأثرية المحتملة (على سبيل المثال، الناشئة عن هطول الأمطار المركبأو التغيرات الحرارية).
المقدمة
Myosins هي محولات الطاقة الميكانوكيميائية التي تحلل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) لتوليد حركة الاتجاه على طول خيوط الهيكل السيتولي أكتين في eukaryotes1,2. لديهم على حد سواء هيكليا وحركيا تتكيف مع وظائفها داخل الخلايا المختلفة، مثل نقل العضيات، وتقلص العضلات أو توليد التوتر الخلوي الهيكلي1،2. يتم تمثيل عائلة الموسين الخارقة من قبل ~ 40 جينات الموسين التي تنتمي إلى ~ 12 فئات myosin متميزة في الجينوم البشري3،4. أعضاء من فصول myosin تلعب أدوارمختلفة في مجموعة متنوعة للغاية من الاضطرابات, مثل العديد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد حلول الأسهم والكواشف
- إعداد dithiothreitol (DTT) حل الأسهم عن طريق حل DTT البلورية في الماء المقطر إلى تركيز نهائي من 1000 mM. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M NaOH الحل. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد حل مخزون ATP عن طريق حل ATP البلورية في الماء المقطر إلى تركيز نهائي من 100 MM. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M NaOH الحل. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد 10X NADH العازلة التي تحتوي على 70 مل 3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك (MOPS)، 10 مل مغكل2،0.9 مليون طن إيثيلين غليكول-بيس (β-aminoethyl الأثير) -N، N، N′،N′-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA)، و 3 MM NaN3. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M NaOH الحل. يُحفظ عن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تظهر خريطة تخطيط اللوحة النموذجية المستخدمة في تجارب الفرز في الشكل 1. يتم حجز الصفوف الأولى والأخيرة لمعايرة NADH والتحكم الإيجابي (20 ميكرومتر بارا-أمينوبلبِستياتين، 0.5٪ DMSO)، على التوالي. يتم استخدام الصفوف المتبقية (B إلى O) لاختبار النشاط المثبط للمركبات. هنا، يتم إعداد خمسة عشر خطوة المسلسل 1:2 تخفيف بدءا من تركيز مركب 10 mM في DMSO ونقلها من لوحة مركب إلى لوحة تخفيض، بحيث أعلى تركيز مركب النهائي هو 50 درجة مئوية (في 0.5٪ DMSO) على لوحة تخفي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
تحسين تخطيط لوحة عن طريق تشغيل عدة لوحات مع السيطرة السلبية فقط (رد فعل ATPase مع عدم وجود مثبط). فحص النتائج بعناية لأنماط في معدلات رد الفعل. على سبيل المثال، قد تنشأ هذه من آثار الحافة و / أو العيوب في طلاء سطح الماء من لوحات "غير ملزمة". إذا لوحظ نمط، قم بتغيير نوع اللوحة و/أو تخطيط اللوحة لتقليل القطع الأثرية. على سبيل المثال، يمكن ترتيب منحنى نموذجي للجرعة والاستجابة (16 تركيزات مع ثلاثة توائم، 48 نقطة المجموع) إما في ثلاثة أعمدة أو صفين على.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات NS096833 (CAM).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 384 بئر شفة منخفضة أسود مسطحة القاع البوليسترين NBS Microplate | Corning | 3575 | |
| ATP (أدينوزين 5 & رئيس ؛ -ثلاثي فوسفات ثنائي الصوديوم ملح هيدرات) | Sigma | A7699 | |
| Aurora FRD-IB موزع | Aurora Discovery، Inc. | 00017425 | |
| Biomek NXP محطة عمل أتمتة المختبر متعدد القنوات | Beckman Coulter | A31841 | |
| Blebbistatin | AMRI | N / A | التوليف المخصص |
| BSA (ألبومين مصل البقر ، خالي من البروتياز) | Akron Biotech | AK1391 ؛ | |
| جهاز طرد مركزي 5430 R ، مبرد ، مع جهاز طرد مركزي Rotor FA-35-6-30 | Eppendorf | 022620663 | |
| 5430 ، غير مبرد ، مع Rotor A-2-MTP | Eppendorf | 022620568 | |
| DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) | ؛ سيجما | D2650 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | ماصة Sigma | D5545 | |
| E1 ClipTip متعددة القنوات؛ 384 تنسيق؛ ماصة | ثرثرو علمية | 4672010 | |
| E1 ClipTip متعددة القنوات؛ 96 تنسيق؛ 8 قنوات | Thermo | Scientific 4672080 | |
| EGTA (إيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N & prime ؛ - حمض رباعي الأسيتيك) | ؛ قارئ الألواح Sigma | E3889 | |
| EnVision 2104 متعدد التسميات | PerkinElmer | 2104-0010 | |
| Glycerol | سيجما | G2025 | |
| LDH (نازعة هيدروجين اللاكتيك من عضلة الأرانب) | سيجما | L1254 | |
| MgCl2< / sub>.6H 2< / sub>O (سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم) | ؛ سيجما | M2670 | |
| شاكر ميكروبليت | VWR 12620-926 | ||
| صفيحة دقيقة, 384 بئر, PP, حجم صغير, بئر عميق, Natural | Greiner Bio-One | 784201 | |
| MOPS (3- (N-Morpholino)حمض البروبان سلفونيك) | سيجما | M1254 | |
| الميوسين الحركي البروتين (كامل الطول) (عضلة القلب البقري) | الهيكل الخلوي | MY03 | |
| بروتين حركي الميوسين (كامل الطول) (عضلة الهيكل العظمي للأرانب) | الهيكل الخلوي | MY02 | |
| NADH (&بيتا ؛ نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد ، هيدرات ملح ثنائي الصوديوم المخفض) | Sigma | N8129 | |
| NaN3< / sub> (أزيد الصوديوم) | ؛ سيجما | 71289 | |
| هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) | ؛ مرشح بصري Sigma | S8045 | |
| CFP 470 / 24nm (انبعاث) | PerkinElmer | 2100-5850 | الباركود 240 |
| مرشح بصري Fura2 380 / 10nm (إثارة) | PerkinElmer | 2100-5390 | الباركود 112 |
| الوحدة البصرية: Beta Lactamase | PerkinElmer | 2100-4270 | الباركود 418 |
| برنامج OriginPro 2017 | OriginLab | N / A | |
| para< / em>-Aminoblebbistatin | AMRI | N / A | توليف مخصص |
| para< / EM>-Nitroblebbistatin | AMRI | N / | A توليف مخصص |
| PEP (فوسفو (إينول) ملح حادي البوتاسيوم وحمض البيروفيك) | Sigma | P7127 | |
| PK (بيروفات كيناز من عضلة الأرانب) | Sigma | P9136 | |
| مسحوق الأسيتون لعضلات الأرنب | بيل فريز بيولوجيز | 41995-2 |
المراجع
- Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Berg, J. S., Po....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
