مقالة منهجية

جيل من الأناكسولوت الشيميري مع أطراف هابلويد متحولة من خلال التطعيم الجنيني

DOI:

10.3791/60156

⸱

يناير 29, 2020

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا الهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج axolotls الوهمي مع الأطراف الأمامية haploid المستمدة من الأنسجة المانحة Cas9 المغيرة باستخدام تقنيات تطعيم الأنسجة الجنينية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك مجموعة متزايدة من التقنيات الوراثية والموارد تمكن الباحثين من استكشاف الأصول الجزيئية لقدرة بعض أنواع السلمندر، مثل الأكسولوت، على تجديد أطرافها بأكملها كبالغين. هنا ، نحدد التقنيات المستخدمة لتوليد الأكسولوتات الشيميرية مع الأطراف الأمامية haploid Cas9 المغيرة التي يمكن استخدامها لاستكشاف وظيفة الجينات ودقة تجديد الأطراف. نحن نجمع بين العديد من التقنيات الجنينية والجينية ، بما في ذلك توليد haploid عن طريق التنشيط في المختبر ، وCRISPR / Cas9 mutagenesis ، وتطعيم الأنسجة في بروتوكول واحد لإنتاج نظام فريد للفحص الوراثي haploid في كائن نموذجي للتجديد. تقلل هذه الاستراتيجية من عدد الحيوانات والمساحة والوقت اللازم للتحليل الوظيفي للجينات في تجديد الأطراف. وهذا يسمح أيضا بالتحقيق في وظائف تجديد محددة من الجينات التي قد تكون مطلوبة لعمليات أساسية أخرى، مثل تكوين الأعضاء، ومورفولوجيا الأنسجة، وغيرها من العمليات الجنينية الأساسية. الطريقة الموصوفة هنا هي منصة فريدة لإجراء الفحص الوراثي haploid في نظام نموذج الفقاريات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تاريخيا، كان تطعيم الأنسجة الجنينية في البرمائيات تقنية هامة لاستكشاف الآليات الأساسية لبيولوجيا النمو والتجدد. يمتلك الأكسولوتل، وهو نوع من السلمندر، قدرة مثيرة للإعجاب على تجديد الأنسجة والهياكل المعقدة مثل الأطراف والأعضاء بعد الإصابة أو البتر. وبالمثل، فإنها يمكن أن تتلقى، دون رفض، ترقيع الأنسجة من أفراد آخرين في مراحل الجنين، والأحداث، والكبار1،2،3. مناطق الأجنة التي تنتج هياكل كاملة مثل الأطراف والذيول والعينين والرؤوس ، والأنسجة الأكثر تحديدًا ، مثل neuroectoderm والسوميتس ، يمكن تطعيمها بين الأجنة لإنتاج الحيوانات الشيمية1،2،4،5،6. على مدى ما يقرب من قرن من الزمان ، قدمت دراسات مثل هذه الحيوانات الوهمية رؤى حاسمة في التجديد ، وتمايز الأنسجة ، والتحكم في الحجم ، ونمط1،7،8.

في العقد الماضي ، أنتجت العديد من الدراسات النسخة من الأنسجة التجدد رؤى في البرامج الوراثية الكامنة وراء تجديد السلمندر9،10،11،12،13. وقد أضافت هذه الدراسات إلى قائمة موسعة من الجينات المرشحة التي، حتى الآن، غير قابلة للتوصيف إلى حد كبير في سياق التجديد. تقنيات الطفرات المستهدفة ، مثل CRISPR / Cas ، تسمح الآن بالتحقيق في مثل هذه الجينات ، ويتم تسهيل هذه النهج الجينية إلى حد كبير من خلال التسلسل والتجميع الأخير لجينوم axolotl الكبير14،15،16.

سعينا لتطوير التقنيات التي قرنت البيولوجيا التنموية الكلاسيكية مع التكنولوجيا الوراثية الجديدة لغرض تشريح آليات التجديد. وقد وضعت أساليب لتوليد الأجنة haploid من axolotls وغيرها من السلمندر لعقود17. في حين أن هذه التقنيات قد لوحظ منذ فترة طويلة لتكون مزايا السلمندر ككائنات النموذج الجيني18، إلا أن الدراسات الجينية اللاحقة قليلة أدرجت الحيوانات الهابلويد. نحن نستخدم في تنشيط المختبر في axolotl لإنتاج الأجنة haploid التي تعمل كمتبرعين الأنسجة لتطعيم19. باستخدام الأجنة التي تحمل علامات وراثية فلورية ، ابتكرنا طرقًا موثوقة لتوليد الأطراف المشتقة بالكامل تقريبًا من أنسجة المتبرعين(الشكل 1A). من خلال الجمع بين هاتين التقنيتين ، تجاوزنا الفتك الجنيني المتأخر المرتبط بالهابلويد ، مما يسمح بإنتاج أطراف هابلويد مطورة تمامًا والمطعمة(الشكل 1B، الشكل 1B"، والشكل 2).

من خلال إجراء CRISPR / Cas بوساطة الطفرات في الأجنة haploid قبل التطعيم لإنشاء axolotls الوهمي مع أطرافها هابلويد متحولة ، قد نحقق في وظيفة الجينات على وجه التحديد في سياق تطور الأطراف وتجديدها. وهذا يسمح بإنقاذ الأطراف من الأنماط الظاهرية المتحولة الجنينية المحتملة. في حين يمكن أن تولد CRISPR / Cas microinjection الحيوانات التي هي متحولة للغاية ، فإن هذه الحيوانات عادة ما تكون فسيفساء عالية ، مع درجة ما من الاحتفاظ بأليلات النمط البري ومجموعة متنوعة من الطفرات المتميزة في المواقع المستهدفة14،20. CRISPR القائم على الطفرات في خلايا haploid يزيد من penetrance واحد أليل فقدان وظيفة الطفرات، كما أنها لا يمكن أن تكون ملثمين من قبل alleles البرية المحتفظ بها. لهذا السبب ، يتم استخدام الفحص القائم على CRISPR في خطوط الخلايا haploid بشكل متزايد للتحقيق في الأساس الوراثي للعديد من العمليات الخلوية21،22،23. من خلال الجمع بين تتبع النسب CRISPR المستندة إلى بروتوكولات تطعيم برعم الأطراف haploid ، يمكن للنهج الموصوف هنا أن يكون بمثابة منصة للشاشات الوراثية haploid في الحيوانات الحية20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة ييل (IACUC، 2017-10557) وكانت متفقة مع جميع السياسات والمبادئ التوجيهية الاتحادية التي تحكم استخدام الحيوانات الفقارية. أجريت جميع التجارب على الحيوانات على Ambystoma mexicanum (axolotls) في مرافق في جامعة ييل.

1. جيل الأجنة الديلويد

  1. الحصول على GFP + الأجنة diploid لتكون بمثابة المضيفين الكسب غير المشروع من خلال التزاوج الطبيعي باستخدام واحد أو اثنين من الآباء gfp 24.
  2. جمع البيض الديبلويد وضعت حديثا ووضعها في منخل معدني.
  3. شطف البيض جيدا مع محلول هولترريتر 40٪ (20 mM NaCl، 0.2 mM KCl، 0.8 mM NaHCO3،0.2 mM CaCl2،4 mM MgSO4،درجة الحموضة إلى 7.4).
  4. ضع البيض في محلول هولتفريتر الطازج بنسبة 40٪ وخزنه عند درجة حرارة 12 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب دائما الحصول على أجنة الدوبلويد قبل الانتقال إلى توليد الأجنة هابلويد.

2. توليد الأجنة Haploid

  1. الإناث إعداد المانحين gamete
    1. 48 ح قبل إجراء في تنشيط المختبر، وجنسة الناضجة جنسيا الأبيض أو الأبيض / RFP الإناث axolotl عن طريق الغمر في 1 ز / L HEPES العازلة MS-222 في 40٪ حل Holtfreter25.
    2. تأكد من أن يتم تم تهيأ الحيوان بالكامل بعد ما يقرب من 30 دقيقة من الغمر عن طريق قرص ذيله بقوة بين الإبهام والسبابة. لن تستجيب الحيوانات المحملة بالكامل فعليًا لأي قرصة.
    3. إعداد حل من gonadotropin المشيمي البشري (HCG) التي تحتوي على 10،000 U / مل في المالحة المعقمة.
    4. باستخدام حقنة الأنسولين 30 G، حقن 0.15 CC من قوات حرس السواحل الهايتية (1500 وحدة) في الظهرية العضلية إلى الطرف الخلفي للأنثى بزاوية 45 درجة إلى خط الوسط لتجنب ملامسة الحبل الشوكي.
    5. أعد الأنثى إلى محلول Holtfreter الطازج بنسبة 40٪ وضعها في ثلاجة 8-12 درجة مئوية.
    6. بعد 48 ساعة، أعد الأنثى إلى درجة حرارة الغرفة. وضع بعض الحجارة أو النباتات البلاستيكية في حاويتها كأسطح لوضع البيض.
      ملاحظة: الإناث حقن مع قوات حرس السواحل الهايتية سوف إيداع حالات هلام فارغة في كثير من الأحيان لعدة ساعات قبل وضع البيض.
    7. إزالة الحجارة أو النباتات البلاستيكية بعد أن بدأت الأنثى باستمرار وضع البيض.
    8. السماح للأنثى للالجلوس في خزان فارغ لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
      ملاحظة: حجب المواد للمنال لوضع البيض على سيسمح تشديد السيطرة على جمع البويضات.
  2. مجموعة من الرُمّية
    1. في حين أن وضع بويضة الأنثى متوقف ، يتم تحديد جنس GFP + axolotl الذكور الناضج جنسيًا ليكون بمثابة متبرع بالحيوانات المنوية ، كما هو الحال في الخطوة 2.1.1.
    2. وضع الذكور بولاية كاملة على ظهره على مناشف ورقية رطبة تحت المجهر تشريح.
    3. إذا كان المجرب هو اليد اليمنى، ضع طرف ماصة P1000 في قاعدة الكلوكا باليد اليمنى.
    4. ضع السبابة اليسرى وإبهام اليد اليسرى 2−3 سم على الحوض. ضغط بلطف على الحيوان أثناء تحريك الأصابع نحو الساقين الخلفيتين لطرد عينات البول المنوية.
    5. جمع كل ما يتم مسح من cloaca في أنبوب microcentrifuge الفردية. كرر هذه العملية لجمع 6 إلى 10 عينات.
    6. ماصة 5.0 μL من كل عينة على طبق بتري لفحص نوعية الحيوانات المنوية باستخدام المجهر مقلوب.
      ملاحظة: عينات الحيوانات المنوية المركزة هي لون أبيض حليبي، وعادة ما تتراوح بين 5 إلى 20 ميكرولتر، وعادة ما يتم استردادها بعد عدة، يتم استخراج عينات البول الحيوانات المنوية أعلى حجم. سوف الحيوانات المنوية جمع في الجزء السفلي من الأنابيب في عينات حجم أعلى عندما تركت دون عائق. عينات مركزة من الحيوانات المنوية صحية هي كبيرة والمتحركة وتفقد النشاط مع انخفاض تركيزها. يمكن للذكور الأصحاء إنتاج ما يصل إلى 50 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المركزة.
  3. مجموعة الإناث gamete
    1. بعد الحصول على عينة الحيوانات المنوية صحية وتأكيدها، وحقن HCG أنثى axolotl كما هو الحال في الخطوة 2.1.1.
    2. وضع الأنثى المحملة بالنساء بشكل كامل على مناشف ورقية رطبة على ظهرها.
    3. استخراج البويضات غير المخصبة من الأنثى باستخدام حركة اليد مماثلة لتلك الموجودة في الخطوة 2.2.4.
    4. جمع البيض باستخدام ملقط الرطب ونقلها إلى طبق بيتري 10 سم. علاج البيض مع الحيوانات المنوية المشععة في غضون 15 دقيقة من جمع.
  4. إعداد ألعاب الذكور وتفعيل المختبر
    1. استخدام P10 أو P20 ماصة لpipette الحيوانات المنوية صعودا وهبوطا، وكسر كتل لتشكيل تعليق متجانسة.
    2. تقريب النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة عن طريق وضع قطرة 0.5 ميكرولتر من تعليق الحيوانات المنوية غير المخفف على غطاء طبق بتري أو شريحة زجاجية والفحص بمجهر مقلوب.
    3. إضافة 9.5 ميكرولتر من 0.1x مارك تعديل حل رينغر (MMR; جدول المواد) إلى هذه العينة لجعل تخفيف الحيوانات المنوية 20x. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط.
    4. مع المجهر المقلوب، عد الحيوانات المنوية في ثلاث قطرات 1.0 ميكرولتر من aliquot 20x المخفف على غطاء طبق بتري أو مقياس الهيوكتومتر لتقدير تركيز الحيوانات المنوية من تعليق غير مخفف.
    5. إعداد الحيوانات المنوية للتشعيع عن طريق تخفيف aliquot من عينة الحيوانات المنوية الأصلية إلى حوالي 80،000 الخلايا المتحركة / مل في 0.1x MMR المعقمة.
    6. عد عدد البويضات التي تم الحصول عليها خلال الـ 15 دقيقة الماضية. أضف 0.5 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المخففة الطازجة من الخطوة 2.4.5 لكل بويضة إلى طبق بتري. استخدم طرف الماصة لنشر هذا التعليق في طبقة سميكة 1 مم.
    7. باستخدام رفع من البلاستيك، ضع العينة 4 سم من المصابيح من 254 نانومتر crosslinker. تعطيل الحيوانات المنوية وراثيا عن طريق تشعيع العينة مع 800،000 uJ/mm2.
    8. باستخدام ماصة P10، ماصة التعليق على البيض غير المخصبة، وطلاء كل بويضة مع 0.25-0.5 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المشععة. السماح للبيض للالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    9. بعد 30 دقيقة، تغمر البيض بـ 0.1x MMR. ضع البيض على الفور في حاضنة 8-10 درجة مئوية للحقن في اليوم التالي أو عند 18 درجة مئوية للحقن في غضون 7 ساعات بعد التنشيط (hpa).
    10. Dejelly haploids باستخدام ملقط حادة 30 دقيقة بعد الترطيب. ضع البيض على الفور في حاضنة 8-10 درجة مئوية للحقن في اليوم التالي أو عند 18 درجة مئوية للحقن في نفس اليوم.

3. Haploid Mutagenesis والصيانة

  1. حقن ميكروفير/كاس9
    1. تصميم sgRNAs باستخدام CRISPRscan وتوليف26،27.
    2. بالنسبة للطفرات المتعددة الطفرات، قم بإعداد مخزون من 5 sgRNAs (10 نانوغرام/ميكرولتر لكل sgRNA) وبروتين Cas9 (1 ميكروغرام/ميكرولتر). إعداد تخفيف 100 مرة من هذا المخزون (0.1 نانوغرام / ميكرولتر لكل sgRNA، 10 نانوغرام / μL Cas9) للحقن. لجين واحد، طفرة عالية التردد mutagenesis، اتبع البروتوكول المبين سابقا28.
    3. حقن الأجنة الهابلويد في مرحلة الخلية الواحدة 7 hpa إذا تم تخزينها في 18 درجة مئوية أو حقن الأجنة في اليوم التالي في مرحلة الخلية 2-8 إذا تم تخزينها في 8-10 درجة مئوية.
    4. نقل الأجنة إلى 1.0x MMR مع 20٪ من البوليسوكروز 400.
    5. إذا كانت خلية واحدة، حقن كل جنين مع قطرة 5 مل من محلول الحقن (حوالي 1/4 نصف قطر من البيضة) التي تحتوي على كتلة إجمالية من 0.5 pg/sgRNA و 50 PG Cas9 البروتين. إذا كانت متعددة الخلايا، قم بتوزيع هذه الكتلة عن طريق حقن وحدات تخزين أصغر في خلايا متعددة.
    6. السماح للأجنة للشفاء في البوليسوروز 400 لمدة لا تقل عن 4 ساعة والحد الأقصى من 18 ساعة في 18 درجة مئوية.
  2. إسكان جنين هابلويد
    1. نقل الأجنة إلى 0.1x MMR مع مضاد المضادات الحيوية.
    2. منزل كل جنين في بئر الفردية من لوحة 24 جيدا، كما أن البعض سوف يموت أو تتطور بشكل غير طبيعي. الحفاظ على 16-18 درجة مئوية. يمكن استخدام درجات حرارة أقل لإطالة أمد التطور، إذا لزم الأمر.
    3. استبدال وسائل الإعلام مع MMR الطازجة 0.1x مع مضاد المضادات الحيوية كل يومين.

4. Diploid إعداد الجنين المضيف

  1. الحفاظ على الأجنة في طلاء هلام في 12 إلى 16 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة 22 إلى 26.
  2. جمع الأجنة التي هي جاهزة للتطعيم، ووضعها داخل منخل (4 ملم حجم شبكة)، وشطف بلطف لهم مع محلول Holtfreter 40٪.
  3. نقل الأجنة إلى 0.1x MMR المعقم مرشح يحتوي على 1.5٪ التبييض لمدة تصل إلى 2 دقيقة. غمر تماما الأجنة في محلول التبييض ودوامة لهم بلطف لضمان أن طلاء هلام يجعل الاتصال الكامل مع محلول التبييض لقتل الميكروبات موجودة على الأجنة.
  4. بعد 2 دقيقة، تمييع محلول التبييض الذي يحتوي على الأجنة بحجم متساوٍ من التعقيم بالفلتر 0.1x MMR.
  5. صب بلطف الأجنة في منخل مطهر التبييض (4 مم حجم شبكة) وشطف الأجنة خمس مرات مع مرشح تعقيم 0.1x MMR.
  6. ضع الأجنة في أطباق بتري معقمة مقاس 10 سم مع 0.1x MMR مع المضادات الحيوية لإزالة الهلام (البنسلين 100 وحدة /mL ، العقدتومايسين 100 ميكروغرام / ميكرولتر ، 0.25 ميكروغرام / مل ، جنتاميسين 25 ميكروغرام / مل).
  7. تحت المجهر الفلوري، قم بإزالة معاطف الهلام وأغشية الفيتلين من أجنة GFP+ باستخدام ملقط حادة (أبعاد تلميح 0.05 × 0.01 مم2).
  8. نقل الأجنة GFP + إلى طبق بتري جديد. تقليل كمية السائل المنقولة من طبق بتري حيث كانت dejellied.
  9. شطف GFP + الأجنة المضيفة مع معقمة 0.1x MMR مع المضادات الحيوية أربع إلى ست مرات من أجل إزالة الملوثات.
  10. ضع الأجنة النظيفة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل التطعيم.
    ملاحظة: تبريد الأجنة يجعلها أكثر صلابة ونظيفة فصل mesoderm من endoderm ممكن.

5. Haploid - diploid كيميرا جيل

  1. الطبق الجراحي وإعداد وسائل الإعلام
    1. إعداد الأطباق الجراحية العقيمة التشغيل عن طريق صب autoclaved 2٪ أغاروز في 0.1x MMR في العقيمة 35 ملم سهلة قبضة بيتري الأطباق. ملء أطباق بيتري في منتصف الطريق مع agarose.
    2. بعد يبرد agarose، استخدم مشرط معقم لقطع حوض طويل بطول 25 مم مائل في الأغروز لعقد الأجنة في مكانها.
    3. ملء الطبق مع وسائل الإعلام الجراحية المعقمة (0.1x MMR مع مكافحة الميكوبلازما 2.5 ميكروغرام / مل، أمبوشوتريكسين B 0.25 ميكروغرام / مل، وسيبروفلوكساسين 10.0 ميكروغرام / مل) والتبريد في 4 درجة مئوية.
  2. إجراء تطعيم الأجنة
    1. ضع متبرعًا صحيًا واحدًا مع واحد أو اثنين من الأجنة المضيفة GFP + diploid المتطابقة مع مرحلة داخل الحوض الصغير لطبق التشغيل السابق الذي يحتوي على وسائط جراحية(الشكل 3).
      ملاحظة: قم بإجراء الإجراء على مرحلة تبريد (10 درجة مئوية أو أقل) إذا كان ذلك ممكناً.
    2. استخدام اثنين من غرامة فائقة، ملقط الأوتوكلاف (طرف مستقيم، وأبعاد تلميح 0.05 × 0.02 ملم2)لإزالة طبقات ectoderm وmesoderm من المضيف مع برعم الطرف بالقرب من المركز(الشكل 4).
      ملاحظة: منطقة ترقيع الأنسجة المستطيلة تشمل برعم الأطراف وتمتد من السوميت التاسع إلى النصف الخلفي من انتفاخ الخيشوم، حوالي 2 ملم، على طول المحور الخلفي الأمامي. على طول المحور الظهري، تمتد المنطقة المطعمة حوالي 1.5 مم، بما في ذلك السوميتس إلى ما وراء الحافة البطنية لانتفاخ الخيشوم. وتشمل المنطقة المطعمة جميع الألواح الجانبية mesoderm والأنصاف الجانبية للsomites ، دون إزعاج البطانة الكامنة. راجع الشكل 4 والفيديو المصاحب للحصول على التفاصيل.
    3. وضع جانبا الأنسجة المضيفة وإزالة ورقة الأنسجة مكافئ الحجم من المانح haploid باستخدام نفس الطرق.
    4. ضع ورقة الأنسجة المانحة haploid على المنطقة المقابلة من الجنين المتبرع.
    5. قم بتأمين الأنسجة من خلال تغطيتها بشظايا زجاجية مستطيلة مستطيلة من زجاج غلاف مجهري مسحوق والضغط عليها بلطف في جسم الجنين المضيف.
    6. اقلب جنين المانح ة الهابلويد على جانبه الآخر لحصاد برعم الأطراف للجنين المضيف الثاني. كرر الخطوات 5.2.2 من خلال 5.2.5.
    7. قم بإزالة الأنسجة المضيفة الزائدة المتبقية بعناية والجنين المتبرع به من الطبق.
    8. اترك الطعوم مع مراسي شظايا الزجاج في مكانها لمدة 60-75 دقيقة، والتحقق من كل 20 دقيقة للتأكد من أن الزجاج لم ينزلق.
    9. بعد ترقيع الأنسجة تلتزم تماما، واستخدام ملقط لتقشير ببطء قبالة المراسي شظايا الزجاج.
  3. صيانة الكيميرا
    1. نقل الأجنة المطعمة إلى وسائل جراحية جديدة والحفاظ عليها في 8-12 درجة مئوية بين عشية وضحاها للشفاء. منزل الأجنة المطعمة بشكل فردي في 12 أو 24 لوحة بئر.
    2. بعد 36-48 ساعة، قم بنقل الأجنة المطعمة إلى مضادات المضادات الحيوية المعقمة 0.1x MMR. المضادات الحيوية القوية في وسائل الإعلام الجراحية تسبب سمية في الأجنة المطعمة بعد 3 أيام.
    3. استبدل الوسائط بـ 0.1x MMR طازجة ومضادات حيوية كل 2-3 أيام.
    4. الحفاظ على الأجنة المطعمة عند 18 درجة مئوية حتى تتمكن من تغذية28.
    5. بعد 1 إلى 2 أشهر من التطوير والرعاية ، يمكن تسجيل أطراف هابلويد لنقاء الكسب غير المشروع باستخدام مجهر تشريح الفلورسنت.
      ملاحظة: إن وجود أنسجة GFP المشتقة من المضيف غير العصبي أو غير الدم في الأطراف هو مؤشر على التطعيم النجس وغالباً ما يرتبط بتطور الأطراف غير الطبيعي. وينبغي استبعاد هذه الحيوانات من مزيد من التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تمييز الأجنة الهابلويد النامية من الأجنة الدوبلويد من خلال "متلازمة haploid" النمط الظاهري29. في مرحلة الكسب غير المشروع ، تعرض الأجنة الهابلويد انحناءً انحنٍ على طول المحور الأمامي الخلفي والضميمة غير المكتملة لقابس الصفار(الشكل 3A). يمكن استخدام المجهر الفلوري لضمان خلو الأجنة الهابلويدية من التعبير عن GFP المشتق من الناحية الأبوية(الشكل 3B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في بروتوكولنا لتوليد الكيميرا haploid-diploid أن فني التشغيل يجب أن تنظر في نتائج التطعيم متسقة.

السبب الأكثر احتمالاً لفشل جيل haploid يرجع إلى ظروف التنشيط السيئة في المختبر. يجب استخدام الكميات المناسبة من الحيوانات المنوية المتحركة لتنشيط البيض. لإطالة الحركة، يجب الحفاظ على عينات الحيوانات المنوية دائما عند 4 درجة مئوية. قبل تطبيق أي عينة من الحيوانات المنوية على البويضات، تحقق من صلاحية الحيوانات المنوية باستخدام مجهر مقلوب. لا ينبغي أبدا استخدام الحيوانا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر (كاثرين روبرتس) على رعايتها لمستعمرة (أكسولوتل) تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل صندوق أبحاث الطب التجديدي للابتكارات في ولاية كونيتيكت (15RMA-YALE-09 و 15-RMB-YALE-01) ومعهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (ما بعد الدكتوراه الفردية زمالة F32HD086942).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 55 Dumont FallpsFine ScienceTools 11295-1استخدم فقط مادة Dumostar (يمكن تعقيمها)
Amphotericin BSigma AldrichA2942-20ML20 مل
مضاد حيوي مضاد للفطريات 100xThermo Fisher15240062
CiprofloxacinSigma Aldrich17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400)bioworld40600032-3Ficoll 400
GentamicinSigma AldrichG1914-250MG
حاضنة التدفئة / التبريدRevSciRS-IF-233
موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشريةMerkChorulon
Megascript T7 طقم النسخThermo FisherAM133440 تفاعلا
Miroscope Cooling StageBrook Industriesمخصصمخصص
NLS Cas9 بروتينPNAbioCP01-2004 قوارير من 50 & ميكرو ؛ ز بروتين لكل
PlasmocinInvivogenant-mpt-1مستوى العلاج
<قوي>وصفات< / قوي>
1.0x محلول مارك المعدل (MMR)0.1 م كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد كلوريد ، 1 ملي ملي MgSO4< / sub> ، 2 ملي CaCl 2< / sub> ، 0.1 ملي EDTA ، 5 ملي هيبس (درجة الحموضة 7.8) ، الرقم الهيدروجيني 7.4
محلول هولتفريتر40٪ 20 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.2 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.8 ملي مولار هيدروكلوريد الصوديوم < الفرعي >3< / > ، 0.2 ملي كلوريد المكالسيوم < الفرعي >2< / > ، 4 ملي مولار MgSO4< / sub> ، الرقم الهيدروجيني إلى 7.4

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  2. Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
  3. McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
  4. Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
  5. Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
  6. de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
  7. Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
  8. Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
  9. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
  10. Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352(2013).
  11. Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  12. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  13. Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
  14. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  15. Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548(2018).
  16. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
  17. Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
  18. Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
  19. Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  20. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
  21. Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  22. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  23. Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
  24. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  25. Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
  26. Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  28. Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
  29. Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
  30. Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
  31. Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
  32. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9 GFP

مقالات ذات صلة