التلالؤ التصوير مدي الحياة من O2 مع تردد-نظام الكاميرا المستندة إلى المجال

Maria Moßhammer; Vincent  V. Scholz; Gerhard Holst; Michael Kühl; Klaus Koren

doi:10.3791/60191

مقالة منهجية

التلالؤ التصوير مدي الحياة من O₂ مع تردد-نظام الكاميرا المستندة إلى المجال

DOI:

10.3791/60191

⸱

ديسمبر 16, 2019

Maria Moßhammer^*¹ , Vincent V. Scholz^*² , Gerhard Holst³ , Michael Kühl¹^,⁴ , Klaus Koren⁵

¹Marine Biological Section, Department of Biology, University of Copenhagen, ²Center for Electromicrobiology, Aarhus University, ³PCO AG, ⁴Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, ⁵Aarhus University Centre for Water Technology, Section for Microbiology, Department of Bioscience, Aarhus University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نقدم وصفا لاستخدام الرواية ، والتردد-المجال التلالؤ كاميرا مدي الحياة لرسم الخرائط 2D O₂ التوزيعات مع رقائق الاستشعار البصرية. يتم وصف نظام الكاميرا وإجراءات تحليل الصور إلى جانب اعداد ومعايره وتطبيق رقائق الاستشعار لتصور البيئة الدقيقة O₂ في جذور النباتات المائية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن وصف طريقه لصوره الأكسجين المذاب (O₂) ، في 2d في المكانية عاليه (< 50-100 μm) والزمنيه (< 10 ق) القرار. يستخدم الأسلوب O₂ الحساسة الاناره رقائق الاستشعار (مستو أوبتوديس) في تركيبه مع نظام الكاميرا المتخصصة للتصوير العمر التلالؤ في مجال التردد. يتم اعداد أوبتوديس مستو عن طريق حل O₂-الحساسة صبغ المؤشر في البوليمر ونشر الخليط علي دعم الصلبة في سمك محدده عن طريق طلاء سكين. بعد تبخر من المذيب, وضعت أوبتودي مستو في اتصال قريبه مع العينة الفائدة-هنا يبرهن مع الجذور من النبات مائية [ ليتوريا] [اونيفلور]. التغيير الذي يعتمد علي تركيز O₂ في عمر التلالؤ لصبغه المؤشر داخل الأوبتودي المستوه يتم بواسطة المؤخر لرقاقه الحامل الشفافة وجدار حوض السمك باستخدام كاميرا خاصه. هذه الكاميرا يقيس عمر التلالؤ (μs) عن طريق التحول في زاوية المرحلة بين اشاره الاثاره التضمين واشاره الانبعاثات. هذه الطريقة متفوقة علي أساليب التصوير كثافة التلالؤ ، والاشاره مستقله عن تركيز الصبغة أو كثافة مصدر الاثاره ، ويعتمد فقط علي وقت تسوس التلالؤ ، وهو معلمه المشار اليها جوهريا. التالي ، لا حاجه إلى صبغه مرجعيه اضافيه أو وسائل أخرى للرجوع اليها. ونحن نظهر استخدام نظام التصوير المجهري O₂ لرهيزوسفيريس النباتية ، ولكن يمكن أيضا بسهوله ان يقترن نظام الكاميرا إلى المجهر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويوفر توزيع وديناميات الغازات والأيونات الذائبة في الرواسب والتربة معلومات^{أساسيه عن}العمليات البيوجيوكيميائيه مثل التنفس الميكروبي¹أو²أو فقدان الأكسجين الشعاعي من جذور النبات³^و⁴^و⁵والبيئة الكيميائية المجهرية للميكروبات⁶^و⁷^{و رهيزوسفيريس}⁵^و⁸^و⁹ ¹¹^و¹². ويمكن للنشاط البيولوجي والكيميائي في هذه البيئات المحدودة الانتشار ان يخلق تدرجات شديده من الركائز الكيميائية أو منتجات العمليات البيوجيوكيميائيه. علي وجه الخصوص ، O₂ التوافر له تاثير كبير علي العمليات البيوجيوكيميائيه التالي بيولوجيا وإيكولوجيا نظام¹³. ولذلك ، فان تحليل التركيزات O₂ في الاستبانة المكانية والزمانيه العالية له اهميه قصوى في العلوم المائية والارضيه. الاولي ، تم تطوير الكهروكيميائية والضوئية ميكرونسيرس¹⁴^،¹⁵ لقياس هذا التحلل الهامه. في وقت لاحق ، تم إدخال 2 الابعاد (2d) التصوير من O₂ مع مستو أوبتوديس¹²^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸^،¹⁹، والتي مكنت التصور والتقدير الكمي للتوزيع غير المتجانسة O₂ في التربة والرواسب.

مستو O₂ أوبتوديس تتكون من o₂-الحساسة صبغ المؤشر²⁰، الذي يذوب في البوليمر مناسبه²¹. الصبغة المؤشر هو متحمس في موجات بصريه محدده وتنبعث الضوء الأحمر تحولت علي الاسترخاء في شكل التلالؤ. في وجود O₂، يمكن لصبغ مؤشر متحمس نقل طاقتها إلى o₂ جزيء عند الاصطدام ، والذي يشار إلى الاصطدام القائم علي التلالؤ التبريد²². لذلك ، يتم تقليل كثافة التلالؤ وكذلك عمر التلالؤ مع زيادة O₂ تركيز²³. في حاله مثاليه التغيير في كثافة والعمر يتبع معادله ستيرن فولمر (المعادلة 1) باستخدام اما كثافة التلالؤ أو العمر في غياب (I₀؛ τ₀) أو وجود (i, τ) من O₂ في تركيز معين [Q]. [ستيرن-فولمر] ثابته ([ك] [_سف]) مقياس للحساسية من ال أوبتودي نحو [أو]₂; يعتمد K_SV علي المتغيرات البيئية مثل درجه الحرارة والضغط.

1 figure-introduction-1

يمكن استخدام تسجيل هذه التغييرات في التلالؤ علي رقاقه استشعار مستو مع نظام الكاميرا لتصور التغييرات المقابلة في O₂ التوزيع. في البداية ، واستخدمت بسيطه التلالؤ القائم علي كثافة O₂ التصوير¹⁸. ومع ذلك ، فان هذه المنهجية حساسة جدا للتدخلات الخارجية ، والتي تعرض للخطر موثوقيه النتائج بسبب الاضاءه غير المتجانسة ، والتقلبات في مصدر الاثاره أو الكاميرا ، فضلا عن التوزيع غير المتساوي لصبغه المؤشر داخل الأوبتودي المستو.

ويمكن التخفيف من بعض هذه القيود باستخدام الأوبتوديس المستو للتصوير الإشعاعي¹⁷^،²⁴، حيث يتم تعبئة المؤشر o₂-الحساسة في طبقه البوليمر من الأوبتودي مستو مع صبغ مرجع غير حساس ينبعث منه في نطاق طيفي مختلف عن o₂-المؤشر. واستنادا إلى صور الانبعاثات المكتسبة في إطارين طيفيين ، تقسم اشاره الانبعاثات الحساسة O₂إلى اشاره مرجعيه ، مما يولد صوره نسبه اقل عرضه للتدخلات المذكورة أعلاه⁵^و¹⁷. الأسلوب يتطلب استخدام صبغه ثانيه ، والتي من الناحية المثالية يمكن ان تكون متحمسة من قبل نفس مصدر الاثاره ، ولكن تنبعث علي طول موجي مختلف (دون تداخل طيفي كبير) ، في نافذه طيفيه أخرى من الكاميرا (علي سبيل المثال ، في قناه لون آخر من كاميرا RGB).

بدلا من ذلك ، O₂ يمكن ان تستند التصوير علي تحديد كميه التغيير الذي يعتمد علي₂في العمر التلالؤ لصبغه المؤشر ، والتي لا تتاثر الاضاءه متفاوتة أو تغاير في تركيز مؤشر²⁵. وكانت التلالؤ الاولي التي تستند إلى مدي الحياة O₂ نظم التصوير تستند إلى قياسات النطاق الزمني مع البوابة القادرة علي الجهاز المرتبط بنظام الكاميرا (CCD)²⁶، حيث يتم استخدام مصدر الاثاره نابض وتؤخذ الصور التلالؤ علي فترات زمنيه محدده داخل الاثاره أو الانبعاثات من المؤشر⁸^،²³^،²⁷. من مثل هذه الصور ، يمكن تحديد عمر التلالؤ ويرتبط بالتركيز O₂ المطابق في المعايرة. وفي وقت لاحق ، يمكن تحويل الصور مدي الحياة التلالؤ لعينه معينه الضغط علي أوبتودي مستو إلى صور للتوزيع 2D المقابلة من تركيز O₂ . وقد استخدم هذا النظام في العديد من التطبيقات علي حد سواء في المختبر وفي الموقع¹⁶^,²⁸, ولكن الكاميرا الاساسيه CCD بوابه قادره لم تعد متاحه تجاريا.

في الاونه الاخيره ، تم الإفراج عن نظام الكاميرا مدي الحياة التلالؤ مختلفه ، والتي تكتسب الصور في مجال التردد⁸. يعتمد النظام علي مصدر ضوء التضمين بشكل مستمر للاثاره. يمكن ان يكون هذا اما الموجه الحلقية أو المربعة بدلا من الاثاره النبضي ، والذي يستخدم للحصول علي صوره في المجال الزمني. ينتج هذا التشكيل في انبعاث التلالؤ التضمين من O₂ صبغ المؤشر ، والذي يتم أزاحه المرحلة من زاوية ، φ ، والذي يعتمد علي عمر التلالؤ من صبغ المؤشر (τ) (انظر المعادلة 2).

2 figure-introduction-2

التغير بين الاثاره والانبعاثات السعه (اي ما يسمي مؤشر التحوير أو العمق (السعه مقسوما علي جزء التلالؤ الثابت)) يعتمد أيضا علي عمر التلالؤ. لذلك ، من خلال تحديد تردد التشكيل المعروفة الاستشعار صوره المكمل الخاصة داخل الكاميرا قادره علي قياس عمر التلالؤ في ns إلى المدى μs كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر ⁸^،²⁹^،³⁰. ويمكن الاطلاع علي دليل عام علي مبدا العملية (باستخدام الرابط التالي https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).

في البروتوكول التالي ، ونحن نظهر استخدام نظام الكاميرا الرواية لتصوير توزيع O₂ تركيز حول جذور المياه العذبة المائية نبات littorella اونيفلورا في 2d⁹^،³¹. ونود ان نشدد علي ان هذه الطريقة لا تقتصر علي هذا التطبيق بأي حال من الأحوال. أوبتوديس حساسة للأكسجين أو جزيئات الاستشعار²⁷ في تركيبه مع طرق التصوير المختلفة وقد استخدمت في البحوث الطبية³², في بيورينتينغ³³, للضغط الحساسة الدهانات³⁴^,³⁵, أو لدراسة أنظمه التصوير الضوئي²^,³⁶^,³⁷, فقط لتسميه بضعة مجالات أخرى من التطبيق.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع مستو O₂ أوبتودي

تذوب 1.5 ملغ من الاناره O₂ المؤشر صبغ البلاتين (II)-5, 10, 15, 20-تتراكيس-(2, 3, 4, 5, 6-بينتافلورفينيل)-البورترين (pttfpp) و 100 ملغ من البوليسترين (PS) في 1 غرام من كلوروفورم للحصول علي ما يسمي ' كوكتيل الاستشعار '.
ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالكوكتيل في قارورة زجاجيه مغلقه وضيقه الغاز لبضع ساعات في الثلاجة والظلام حتى الاستخدام الإضافي.
إصلاح نظيفه وخاليه من الغبار البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) إحباط (حجم تعتمد علي التطبيق) علي لوحه زجاجيه نظيفه مع مساعده من الماء أو الايثانول (70 ٪) فيلم (الشكل 1ا).
وضع جهاز طلاء سكين تنظيف (120 μm) علي إحباط وتطبيق خط من الكوكتيل الاستشعار امام الجهاز باستخدام ماصه الزجاج (الشكل 1ب). ثم ، اسحب جهاز طلاء سكين ببطء وبشكل موحد علي إحباط PET لنشر كوكتيل بالتساوي.
ملاحظه: جميع المواد والاداات يجب تنظيفها جيدا وينبغي ان يتم تلفيق في بيئة خاليه من الغبار ، مثل غطاء الدخان ، وتدفق مقاعد البدلاء أو تحت جهاز شفط نقطه. لتجنب تغاير في إحباط الاستشعار النهائي ، ينبغي القيام بالخطوات التالية لتطبيق كوكتيل الاستشعار علي إحباط بسرعة ، كما يتبخر بسرعة كلوروفورم.
تجفيف مستو الانتهاء O₂-الحساسة أوبتودي في الهواء المحيط لمده 1 ساعة ومن ثم الإفراط في الليل في مجلس الوزراء التدفئة في 50-60 درجه مئوية ، مما ادي إلى سماكه طبقه النهائي بعد تبخر المذيبات من ~ 12 Μm. تخزين الأوبتوديس المنتجة في الظلام (علي سبيل المثال ، في ظرفورقي) حتىاستخدام آخر
ملاحظه: مستو O₂ أوبتوديس يمكن تخزينها جافه وفي الظلام لعده أشهر إلى سنوات قبل الاستخدام. وقد ثبت ان سماكه الطبقة النهائية التي تتراوح بين 1-20 ميكرون لتحقيق نتائج جيده ، مع اشاره التلالؤ كافيه وأوقات استجابه كافيه.

2. [رهيرو]-شطيرة غرفه

تنظيف اثنين من لوحات الزجاج (24.5 × 14 سم²، سمك: 4 مم) مع 96 ٪ الايثانول.
استخدام خفيفه قابل للشفاء ، الأكريليك القائم علي لاصقه فورية (انظر جدول المواد) للصق الشرائح المجهر (76 × 26 مم²، سمك: 1 ملم) علي طول حواف لوحه الزجاج الأول (اي الجانب الخلفي للغرفة) ، في حين ترك واحده طويلة حافه مفتوحة. استخدام القاطع الزجاجي لتقصير الشرائح المجهر حسب الحاجة.
تحذير: قطع الزجاج يمكن ان يسبب حواف حاده وينبغي التعامل معها بعناية.
ملاحظه: الشرائح المجهر تعمل كفواصل بين الامام والخلف ، واعتمادا علي سمك الجذور وحجم النبات ، ويمكن لصقها طبقات متعددة من الشرائح المجهر علي راس بعضها البعض.
قطع أوبتودي مستو في الشكل المطلوب وحجم لتناسب في الفضاء بين الشرائح المجهر لصقها. وضعه علي الجزء الداخلي من لوحه الزجاج الامامي مع الجانب المغلفة صعودا ، للسماح بالاتصال مع عينه من الفائدة عند الضغط ضدها.
الشريط حافه واحده من إحباط أوبتودي إلى لوحه الزجاج وأضافه بضع قطرات من مياه الصنبور في بين لوحه الزجاج وإحباط أوبتودي (الشكل 2ا). خفض ببطء إحباط علي هذه القطرات المياه مما يسمح لها لتصويب نفسها علي سطح الزجاج.
أزاله بعناية فقاعات الهواء المحاصرين في-بين أوبتودي مستو ولوحه الزجاج باستخدام الانسجه الرخوة ، مع تجنب خدش طلاء الاستشعار. امسح الصفيحة الزجاجية الجافة وألصق الحواف المتبقية من الرقاقة الأوبتوديه علي اللوحة الزجاجية (الشكل 2ب).
ملاحظه: يجب اختيار شريط مع التصاق مناسبه تحت الماء.
غربال الرواسب باستخدام حجم شبكه من 0.5 مم. ضع ملعقة من الرواسب الرطبة علي اللوحة الزجاجية الاولي (الشكل 2ج).
ملاحظه: يجب ان لا يكون حجم شبكه أكبر من نصف سمك فاصل.
توزيع الرواسب بالتساوي وضبطها إلى نفس سمك الفواصل الشريحة المجهر باستخدام لوحه زجاجيه مسطحه. تنظيف بعناية السطح العلوي من الشرائح المجهر لضمان ان اللوحة الزجاجية الثانية الأختام الغرفة بشكل صحيح.
تطبيق الشحوم السيليكون علي سطح الشريحة المجهر. تغطيه الرواسب مع فيلم ماء رقيقه ، في حين تجنب بعناية تشكيل فقاعات الهواء.
غسل بعناية تبادل لإطلاق النار واحده من يونيفلور Littorella ووضعه علي الرواسب ، مع يترك النبات الشائكة من الجانب العلوي مفتوحة (الشكل 2د).
وضع اللوحة الزجاجية الثانية ، مع أوبتودي المرفقة بها ، علي الرواسب وتطبيق ضغط لطيف لجلب الأوبتودي في اتصال وثيق مع جذور النبات والرواسب المحيطة بها.
ملاحظه: فقاعات الهواء المحاصرين في الرواسب يمكن ازالتها عن طريق أماله لوحات الزجاج في حين جمعها معا.
ربط لوحات الزجاج معا باستخدام المشابك (الشكل 2ه). جفف الحواف الخارجية بالمناديل الورقية. الحفاظ علي أوراق رطبه في جميع انحاء الجمعية بأكملها من السندويشات رهيزو (علي سبيل المثال ، من خلال أضافه متكررة من بضع قطرات من الماء).
تشديد الغرفة رهيزو ساندويتش باستخدام الشريط الكهربائي الفينيل. ختم الحواف مع الطين النمذجة الاضافه إلى ذلك الشريط لهم مع الشريط الكهربائية الفينيل (الشكل 2و).
ملاحظه: إذا كان هناك العديد من فقاعات الهواء في الرواسب ، أو الحبوب الرواسب في بين الشرائح المجهر فاصل ولوحه الزجاج الثاني ، يجب أعاده تجميعها الغرفة كما يمكن تسرب المياه المسام (كرر الخطوات 2.4-2.8).
استخدام البلاستيك مبهمه لتغطيه جذور-ساندويتش ، ولكن ترك شق في إحباط للنبات يترك لعصا بها. قطع نافذه في إحباط البلاستيك ، لذلك يمكن فتحها للتجارب التي تتكشف. إغلاق النافذة خلال أوقات التاقلم باستخدام الاربطه المطاطية (الشكل 2G) لحماية الأوبتودي من تبييض الصور في حين يتم احتضان النبات.
ملاحظه: كما ان نمو الطحالب يمكن ان تتداخل مع التركيزات O₂ تقاس ، ونحن نوصي محاولة للحد منه ، عن طريق استخدام المياه المصفاة ، والمعدات التجريبية قبل تنظيفها وأزاله الطحالب عند تشكيل.

3. الحاضنة الغرفة ساندويتش

ضع الغرفة الخاصة بالساندوتش في خزان مياه (32 × 7 × 28^سم)في وضعيه مائله قليلا لتشجيع نمو الجذور ضد الأوبتودي المستو.
ملء خزان المياه مع ما يكفي من الماء لغمر تماما يترك النبات.
إنشاء الضوء 14 ح ، 10 ح دوره الظلام للتكيف من النبات باستخدام مصباح التي تسيطر عليها الوقت. وضع حجر الهواء أو مضخة مياه في الخزان لضمان تهويه وخلط المياه (الشكل 2ح).

4-التصوير

اعداد التصوير
1. أزاله إحباط البلاستيكية التي تغطي أوبتودي مستو في غرفه جذور-ساندويتش. وضع الغرفة مع الجدار الزجاجي مع أوبتودي تستقيم ضد جدار الحوض. استخدام فاصل للضغط علي غرفه جذور-ساندويتش ضد جدار حوض السمك.
  ملاحظه: السماكة الاجماليه للجدار حوض السمك بالاضافه إلى الجدار الغرفة رهيزو ساندويتش لا ينبغي الحصول علي سميكه جدا ، ومع ذلك ، وأوصيت سمك الزجاج للجدران الزجاجية للتصوير التلالؤ مع > 1 سم ، من أجل الحد من المكانية عبر الحديث عن طريق زيادة توهين الضوء المتناثرة. من المهم ، لاستخدام نفس المواد لكلا الجدران الزجاجية (نفس المؤشر الحراري) ، من أجل تقليل تشتت الضوء في واجهه المواد. لان هذا من شانه ان يؤدي إلى صوره واضحة كذلك¹².
2. ضع الكاميرا مدي الحياة التي تعتمد علي النطاق الترددي والتي تم تجهيزها بهدف (انظر جدول المواد) امام حوض السمك ومنطقه الاهتمام (جذور النبات المائي littorella اونيفلورا، والتي هي في اتصال مباشر مع أوبتودي مستو) (الشكل 3).
  ملاحظه: قد يتم وضع الكاميرا علي حامل المعمل للسماح بضبط ارتفاع الكاميرا بسهوله. يجب وضع علامة علي موقف المختبر والحفاظ عليه ثابتا. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن تسجيل الكاميرا في حامل المعمل لتجنب الحركة العرضية للكاميرا اثناء التجربة.
3. برغي مرشح الانبعاثات مناسبه للتصوير Ptp كصبغ المؤشر (انظر جدول المواد) علي هدف الكاميرا ، لأزاله الاستدلالات من مصدر الاثاره.
  ملاحظه: مرشحات المسمار هي مثاليه ، ولكن يمكن أيضا استخدام مرشحات مربعه مع اما محول المناسبة ، أو عن طريق التسجيل الدقيق لهم إلى الهدف.
4. قم بتوصيل مصدر أثاره الصمام (انظر جدول المواد) إلى التحوير والإخراج بوابه الظلام من الكاميرا.
  ملاحظه: السابق يسلم اشاره التحوير لمصدر الضوء ، في حين ان الاخيره بإيقاف الضوء اثناء قراءه الصورة من مستشعر الصورة. قم بتوصيل مصدر الاثاره الصمام والكاميرا إلى جهاز كمبيوتر. يجب ان يتم تصغير ضوء الخلفية اثناء قراءه الصورة ، اما بسواد الغرفة بأكملها أو وضع قطعه قماش سوداء كثيفه علي كامل الاعداد. في الحالة الاخيره ، من المهم ضمان التهوية الكافية لتجنب تسخين الكاميرا.
5. إصلاح دليل الضوء في مصدر الاثاره الصمام ووضعه لتضيء بالتساوي إحباط أوبتودي مستو تغطي منطقه الاهتمام.
  ملاحظه: في استخدام مصدر الاثاره LED فمن الممكن للتبديل بين 3 المصابيح مختلفه (460 nm ، 528 nm ، 625 nm) ، وكثافة التي يمكن تعديلها عن طريق برنامج التحكم.
الإعدادات وتشغيل الكاميرا
ملاحظه: بالنسبة للتجارب الموصوفة ، استخدمنا كاميرا مدي الحياة المستندة إلى مجال التردد في تركيبه مع وحده مخصصه للتصوير مدي الحياة في حزمه البرامج المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
1. حدد الكاميرا في البرنامج الذي تم اختياره قبل الاستخدام.
  ملاحظه: البرامج وبرامج تشغيل الكاميرا تحتاج إلى تثبيت قبل التصوير بعد الإرشادات الشركات المصنعة.
2. فتح برنامج التحكم الصمام (مره أخرى مثبته قبل بدء التجربة) واختيار الصمام مناسبه (هنا: 528 nm) بواسطة تدق قباله الاستعداد. تعيين كثافة الصمام حسب الحاجة (هنا إلى 30 ٪). تاكد من تشغيل LED بواسطة TTL الخارجية; ويتم ذلك عن طريق التناظرية موقوتة ومتزامنة لل LED.
  ملاحظه: كثافة الصمام يحتاج إلى تعديلها بشكل فردي ، كما عاليه جدا الطاقة الليزر يمكن ان يؤدي إلى تسارع الصورة تبييض المؤشر أو الصبغة المرجعية.
3. التركيز علي الكاميرا وضبط فتحه الهدف يدويا (في هذه الدراسة استخدام f = 2.8).
  ملاحظه: من المهم ان تركز الكاميرا علي أوبتودي مستو وليس علي زجاج الحوض ؛ هذا يستطيع كنت ضمنت ب ياخذ صوره مع مسطره لمقياس, وركزت علي الظل من المسطرة علي ال أوبتودي, [رثر ثن] علي المسطرة حقيقية.
4. تعيين المعلمات التالية داخل لوحه التحكم الكاميرا البرنامج: مصدر التشكيل الداخلي; موجه جيبيه لإخراج الموجي ؛ أخذ العينات مرحله اضافيه (نعم); 8 عينات المرحلة ، والنظام المرحلة المعاكس ، انقر فوق A + ب قراءات ؛ تردد التحوير 5 كيلوهرتز.
  ملاحظه: تؤثر هذه المعلمات علي جوده الصورة ويمكن تغييرها إذا لزم الأمر. توفر الشركة المصنعة للكاميرا إرشادات حول المعلمات الفردية (الشركة المصنعة للكاميرا الإفراج عن المبادئ التوجيهية والتحديثات كلما تم تحديث البرنامج).
5. خذ صوره مرجعيه قبل التجارب.
  ملاحظه: يمكن القيام بذلك اما عن طريق تصوير معيار معايره (صبغه مضيئه مع عمر معروف (ns أو μs)) ، أو باستخدام الضوء المنعكس لل LED. وفي الحالة الاخيره ، يحتاج مرشح التمرير الطويل للانبعاثات إلى ازالته من الهدف ويمكن تعيين العمر المعروف إلى 1 ns.
6. اضبط وقت التعريض الضوئي في قسم المعايرة في برنامج التصوير المخصص حتى تتم قراءه إحصائيات عائد الاستثمار (في الجزء السفلي من هذه اللوحة) لصوره كثافة التلالؤ التي تم تطبيعها في نطاق 0.68-0.72.
  ملاحظه: الآن يتم إعطاء العمر المرجعي (علي سبيل المثال ، 1 ns) كادخال إلى البرنامج.
7. اضغط علي اشاره التقاط لبدء الاستحواذ علي سلسله قياس مرجعيه.
  ملاحظه: عند الانتهاء ، يتم تخزين البيانات المرجعية ويمكن اجراء قياسات الفاصل الزمني واحد أو الوقت علي عينات.
معايره O₂ أوبتودي
1. وضع قطعه من مستو O₂الحساسة أوبتودي في حوض السمك (الصغيرة) الزجاج. إصلاح أوبتودي مستو علي الجدار الزجاجي للغرفة المعايرة كما هو موضح سابقا (انظر القسم 2.3). ضع حوض السمك المعايرة امام الكاميرا. ضمان الاضاءه حتى من قبل الصمام ، فضلا عن ان أوبتودي يملا مجال الرؤية بأكمله.
  ملاحظه: يجب ان يكون أوبتودي مستو من نفس قطعه من إحباط أو مصنوعة من نفس كوكتيل الاستشعار كما إحباط المستخدمة في التجربة الفعلية.
2. ملء الحوض مع نفس الوسط السائل كما هو مستخدم في التجارب.
  ملاحظه: يمكن ان يؤثر استخدام الوسائط المختلفة للمعايرة والتجارب علي القياس ، (علي سبيل المثال ، عن طريق تغيير استجابه جهاز الاستشعار و/أو القابلية للذوبان O₂ ). التالي ، ينبغي ان يتم المعايرة في نفس الوسط ، وفي نفس درجه الحرارة مثل التجربة الفعلية. تقلبات في درجه الحرارة سوف تؤثر علي اشاره التلالؤ وينبغي تجنبها. ومع ذلك ، إذا كان لا يمكن الحفاظ علي درجه الحرارة مستقره ، يجب ان يتم التعويض درجه الحرارة عن طريق معايره أوبتودي الحساسة O₂(نقاط متعددة) في درجات حرارة مختلفه (ذات الصلة) وأعاده حساب القيم اللاحقة.
3. ضبط تركيز O₂ داخل حوض السمك المعايرة عن طريق تنظيف المياه مع الهواء/N₂ الغاز-خليط من المعروف O₂ التركيز ، وذلك باستخدام جهاز خلط الغاز. التاكد من ان المياه معايرتها جيدا مع الغاز المستخدمة-خليط عن طريق تهويه لفتره كافيه (يعتمد علي معدل تدفق وحجم الحوض).
  ملاحظه: نوصي بمراقبه مستوي O₂ في حوض السمك المعايرة مع الخارجية ، معايره o₂ الاستشعار مع التعويض درجه الحرارة (علي سبيل المثال ، باستخدام ألياف البصرية أو الكهروكيميائية o₂ الاستشعار).
4. خذ سلسله من الصور في تركيزات O₂ مختلفه في غرفه المعايرة.
  ملاحظه: يجب قياس خمسه_{تركيزات} مختلفه علي الأقل من أجل تمكين منحني مناسب لبيانات المعايرة المكتسبة. من المهم قياس في 0 hPa (الشروط السامة) ، ومن ثم توزيع القيم الأخرى عبر النطاق الديناميكي لصبغه المؤشر الخاصة بك. هنا استخدمنا Ptp كصبغ المؤشر O₂الحساسة التي تم تعبئتها في مصفوفة البوليسترين. التقطت الصور في 0, 48, 102, 156, و 207 hPa; 207 [هبا] يماثل إلى 100% هواء تشبع في ال يعطي ملوحة وضغطه.
تصوير العينة
1. وضع العينة امام الكاميرا وضمان الاضاءه حتى.
2. إيقاف الضوء توريد الإشعاع إلى المصنع (وجميع مصادر الضوء الأخرى) فقط قبل الحصول علي صوره التلالؤ مدي الحياة للمصنع. اضبط وقت الاكتساب استنادا إلى صوره الكثافة ، وتاكد من ان الاشاره ليست مشبعه بإفراط ولا ضعيفه جدا للاشاره الجيدة إلى نسبه الضوضاء (S/N) في تحديد مدي الحياة.
3. تعريض المصنع لظروف الاضاءه المختلفة (علي سبيل المثال ، الضوء/الظلام) والحصول علي مجموعه من الصور.
4. التبديل علي ضوء في الغرفة للحصول علي صوره هيكليه.
  ملاحظه: عند تشغيل ضوء الخلفية ، لن تقيس الكاميرا صوره واقعيه مدي الحياة. ومع ذلك ، تظهر الصورة شده الآن مجال العرض بأكمله كما هو معروف من خلال شبه شفاف أوبتودي.
5. التقاط صوره مع مسطره أو علي حد سواء في مجال الرؤية لتمكين التحجيم في وقت لاحق من الصور المكتسبة.

5-تحليل البيانات

يمكنك تصدير الصور التي تدوم مدي الحياة والكثافة مباشره من برنامج التصوير المخصص ، باستخدام الماكرو الذي توفره الشركة المصنعة للكاميرا.
قم باجراء المزيد من تحليل الصور باستخدام برنامج تحليل الصور المتاحة بحريه (انظر جدول المواد).
افتح صور عمر المرحلة للمعايرة في برنامج تحليل الصور وحدد متوسط الصورة بالبالكامل باستخدام وظيفة القياس. ارسم عمر القياس مقابل تركيزات O₂ المعروفة لتحديد وظيفة المعايرة (الشكل 4ا).
احسب τ₀/τ من كافة البيانات (τ₀ هو عمر المرحلة المقاسه في غياب O₂). ارسم هذه القيم مقابل تركيزات O₂ المعروفة (الشكل 4ب).
تحديد المعلمات K_sv و f من مؤامرة المعايرة ، وذلك باستخدام نموذج موقعين مبسطه للتبريد الحركي الديناميكي (المعادلة 3)³⁸^،³⁹ حيث [Q] هو تركيز O₂ . تحديد وظيفة الملاءمة في برنامج تحليل البيانات ، والذي يحدد بعد ذلك K_sv و f.

3 figure-protocol-1

فتح الصور عينه المكتسبة في برنامج تحليل الصور لتحويل اعمار الذين تتراوح أعمارهم في التركيزات O₂ ، وذلك باستخدام المعلمات المحددة ك_sv، f و τ₀.
ملاحظه: بما ان مقاربه بديله أيضا ال يكتسب معايره طور عمر قيم (شكل 4[ا]) يستطيع كنت استعملت مباشره. في هذه الحالة ، يتم استخدام التناسب الاسي باستخدام داله المنحني تناسب للمعايرة.
افتح الصورة مع المسطرة التالية في برنامج تحليل الصور وقياس مسافة معروفه باستخدام أداه القياس. قم بتعيين هذا القياس كمقياس عالمي ضمن المقياس المحدد.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كمثال تطبيق لنظام التصوير الجديد ، ونحن نظهر 2d O₂ التصوير من العينة البيولوجية المعقدة (اي ، جذور النباتات المائية littorella اونيفلورا).

أولا ، يصف الأسلوب تلفيق فيلم استشعار مستو ، ما يسمي أوبتودي مستو. وكما يتبين من الشكل 1، فان هذه الأوبتودي مصنوعة من طبقه رقيقه من المؤشر الضوئي في مصفوفة البوليمر التي تنتشر علي دعم شفاف. باتباع البروتوكول الموصوف ، يتم الحصول علي فيلم استشعار متجانسة مع سماكه موحده ، كما هو محدد من قبل الفجوة من جهاز طلاء سكين. إذا كان الأوبتودي المنتجة لديها توزيع المواد استشعار غير مكتمل (علي سبيل المثال ، ثقوب في الطلاء ، ويظهر المشارب ، أو صبغ المجاميع (وهذا يمكن تقييمها بصريا ، وبصريا مع مساعده من مصباح الاشعه فوق البنفسجية)) ، والبروتوكول يحتاج إلى تكرار وجميع المواد تحتاج إلى تنظيفها بدقه باستخدام الأسيتون.

وبمجرد ان يتم اعداد أوبتودي مستو ، يمكن جلب العينة في اتصال وثيق مع طبقه الاستشعار من الأوبتودي مستو ، كما هو مبين هنا مع الأوبتودي مستو متكاملة في غرفه جذور-ساندويتش ، حيث جذور النبات داخل مصفوفة الرواسب المحيطة يمكن وضعها في اتصال وثيق إلى الأوبتودي مستو (الشكل 2). إذا أعدت بشكل صحيح ، يجب ان تكون غرفه جذور-ساندويتش المنقولة بسهوله من حوض واحد (الحضانة) إلى أخرى (القياس). إذا لم يتم بناؤها بشكل صحيح ، قد تكون الغرفة الخاصة بالساندوتشات القابلة لتثبيت ، تفقد الرواسب أو تحتوي علي فقاعات الهواء. التالي يوصي بالفحص البصري للغرفة التي يتم فيها الساندوتش مباشره بعد التجميع.

ويتيح البروتوكول المعطي التصوير مدي الحياة القائم علي نطاق التردد للعينه في اتصال مع الأوبتودي المستو باستخدام كاميرا مدي الحياة المضيءه القائمة علي مجال التردد. مزيد من التفاصيل حول هذا النظام الكاميرا مثل وضع اكتساب الصورة والعلمية التكميلية المعادن أكسيد أشباه الموصلات (scmos) وترد خصائص الكاميرا في المنشورات الاخيره⁸^,²⁹.

الاعداد نفسه بسيط نوعا ما ويشمل فقط الكاميرا التي تتحكم في مصدر الضوء (في هذه الحالة ، مصدر أثاره الصمام) والعينة مع أوبتودي (الشكل 3). تاكد من ان جميع الأجزاء متصلة بشكل صحيح وان العينة مضيئه بتجانس. يجب تجنب ضوء الخلفية اثناء اجراء القياسات المسبقة.

قبل تصوير العينة ، يحتاج الأوبتودي إلى معايره. كما راينا في الشكل 4ا، ينخفض عمر التلالؤ المقاسه مع زيادة O₂ التركيز بعد تسوس شبه اسي. ويمكن أيضا وصف هذه العلاقة باستخدام نموذج الموقعين المبسط (الشكل 4باء والمعادلة 3). وفي المثال المحدد ، كانت المعلمات اللازمة لحساب التركيز O₂ علي النحو التالي ؛ τ₀ = 56.26 μs ، K_Sv = 0.032 hPa^-1 و f = 0.86.

يعد اجراء المعايرة أيضا طريقه مثاليه لاختبار ان النظام يعمل بشكل صحيح. إذا تم تثبيت كافة المكونات كما هو موضح هنا (أو ضمن إرشادات الشركات المصنعة) ، يجب ان تظهر العمر المقاسه نفس O₂ التبعية كما هو مبين في الشكل 4. الاضافه إلى ذلك ، لنفس المزيج من المواد الاستشعار O₂ (البوليمر والصبغة) ، يجب ان يكون قياس₀ τ في نفس النطاق (± بضعة μs) كما يقاس هنا (تتاثر أساسا من درجه الحرارة التجريبية). إذا كان غير قادر علي الحصول علي منحني معايره مماثله ، تاكد من ان كافة الخطوات التي تم اتباعها بشكل صحيح. في بعض الأحيان يتم إصلاح أوبتودي بطريق الخطا مع الجانب الحساسة التي تواجه الجدار الزجاجي بدلا من العينة ، أو الصور المكتسبة هي الإفراط في أو المكشوف.

مع معلمات المعايرة ، من الممكن تحديد تركيز O₂ عن طريق تصوير عمر التلالؤ (τ). ويتجلى هذا في الشكل 5ا ، ب، حيث كان توزيع التركيز O₂ في الغلاف من النباتات littorella اونيفلورا في الظلام وبعد التعرض للضوء إلى 500 ميكرومول الفوتونات م^-2 s^-1 ل 12 h ، علي التوالي. بسبب النشاط الضوئي للمصنع ، زاد تركيز O₂ في الجذور بعد التعرض للضوء. بالاضافه إلى صور مدي الحياة ، يمكن أيضا الحصول علي صور "هيكليه" تحت أضاءه خارجيه ، مع الحفاظ علي هندسه التصوير الثابتة. وبهذه الطريقة ، يمكن ان تكون الصور O₂ مرتبطة بشكل دقيق بالصورة الهيكلية (الشكل 5ج) أو المقاطع المتقاطعة أو المناطق ذات الاهميه. وعلي سبيل المثال ، استخرجت ملامح التركيز O₂ عبر جذر واحد من الصورة المكتسبة في الظلام والضوء ، علي التوالي (الشكل 5د).

figure-results-1
الشكل 1: تصنيع مستو O₂ أوبتودي. (ا) يتم تثبيت إحباط أليفه علي لوحه زجاجيه ويتم وضع جهاز طلاء سكين علي إحباط. (ب) يتم نشر كوكتيل المستشعر المعد علي رقائق PET كخط رفيع امام جهاز طلاء السكاكين. (ج) يتم نقل الجهاز سكين الطلاء إلى أسفل لنشر كوكتيل الاستشعار كفيلم رقيقه علي إحباط PET ، والتي بعد المذيبات التبخر النتائج في استعداد لاستخدام مستو أوبتودي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: المجلس التجمع الغرفة مع التكامل من مستو O₂ أوبتودي. (ا) يتم تثبيت أوبتودي علي واحده من لوحات زجاجيه باستخدام فيلم المياه. (B) يتم لصقها أوبتودي إلى لوحه مع الشريط الكهربائي. (ج) تملا الرواسب في اللوحة المتقابلة بالفواصل المرفقة (اي شرائح المجهر). (د) توضع جذور النبات علي الرواسب الموزعة بالتساوي. (ه) الغرفة التي تم إغلاقها وتثبيتها مؤقتا مع المشابك. (و) مغلقه بالبالكامل وتجميعها غرفه جذور-ساندويتش. (ز) لحماية الأوبتودي من التعرض الخفيف بواسطة مصباح الحضانة ولتجنب نمو الطحالب يوضع غطاء بلاستيكي فوق الغرفة المجمعة التي تضم ساندويتش. (ح) الغرفة التي تم احتضانها في حوض السمك. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: اعداد التصوير الذي يحتوي علي كاميرا مدي الحياة المضيءه التي تعتمد علي النطاق الترددي ، مع تركيز الهدف علي العينة مع الأوبتودي من الخلف عبر الحوض الشفاف وجدران الحجرات التي تحتوي علي الساندويتش. يتم وضع الدليل الضوئي لمصدر أثاره الصمام للقاء الضوء علي العينة بالتساوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: منحنيات المعايرة لمستو O₂ أوبتودي. (ا) المدةالمختلفة لتفسفر التي تقاس بتركيزات O₂ الخاصة في غرفه المعايرة المملوءة بالمياه. (ب) مؤامرة ستيرن-فولمر لبيانات المعايرة المجهزة باستخدام نموذج الموقعين المبسط للتبريد الحركي الدينامي (المعادلة 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: التصوير مدي الحياة للتوزيع O₂ في جذور النبات المائي littorella اونيفلورا. (ا) O₂ التوزيع بعد الحفاظ علي المصنع تحت الضوء لمده 12 ساعة في حوالي 500 ميكرومول الفوتونات م^-2 s^-1. (ب) O₂ التوزيع بعد الحفاظ علي النبات في الظلام ل 1 ح. (ج) الصورة الهيكلية لجذور النبات كما شوهدت من خلال الأوبتودي المستو. (د) المقطع العرضي O₂ للتركيزات (يشار إلى الموقع بالخط الأصفر في اللوحة A و B) بعد 12 ساعة في الضوء (احمر) و 1 ساعة في الظلام (اسود). تكييفها مع اذن من (كورين ، ك. ، Moßhalm ، m. ، شولز ، v. V. ، بوريموف ، اس ام ، Holst ، g. ، كوهل ، m. التلالؤ التصوير مدي الحياة من أجهزه الاستشعار الكيميائية-مقارنه بين المجال الزمني والتردد المجال أنظمه الكاميرا القائمة. كيمياء تحليليه. 91 (5), 3233-3238, doi: 10.1021/acs. analchem. 8b05869 (2019)). حقوق التاليف والنشر (2019) الجمعية الكيميائية الامريكيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، يتم تغطيه كامل تدفق العمل من اعداد أوبتودي إلى O₂ تحليل الصور. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن الحصول علي الصور الكيميائية باستخدام الرواية التي تعتمد علي النطاق الترددي المصابيح مدي الحياة التلالؤ. اعتمادا علي التطبيق ، يمكن ان تكون ملفقه أوبتوديس مستو في مختلف الاحجام وسمك طبقه من طبقه الاستشعار تتراوح بين قويه 50-100 μm أوبتوديس مستو سميكه من عده أعشار من سنتيمتر مربع لتغطيه المجهر ينزلق مع < 1 μm طبقات الاستشعار سميكه⁶^،⁴⁰. وقد تم التدليل علي إمكانات هذا الأسلوب مع تطبيق معين ، ولكن لا يقتصر فقط علي O₂ التصوير في النبات رهيزوسفيريس¹²^،²⁸.

هذه الطريقة لديها العديد من الفوائد بالمقارنة مع التلالؤ النقي القائم علي كثافة التصوير الكيميائي المستندة إلى الأساليب. التصوير مدي الحياة التلالؤ ليست ، أو علي الأقل اقل بكثير ، تتاثر الاضاءه غير المتساوية ، سماكه أوبتودي متفاوتة ، والصورة تبيض²⁵. أيضا ، هذا الأسلوب يتجنب استخدام صبغه مرجعيه اضافيه مشتركه في التصوير^{الإشعاعي 17 ،}³⁷. بالمقارنة مع أنظمه الكاميرا الأخرى القائمة علي مدي الحياة ، مثل الكاميرات ذات النطاق الزمني المستخدمة بشكل شائع ،⁸^،²⁶، يمكن لنظام الكاميرا الجديد والبروتوكول المعروض هنا ان يحقق نتائج قابله للمقارنة. وفي منشور صدر مؤخرا ، تمت مقارنه الخصائص التحليلية لهذين النظامين ، ووجد ان نظام الكاميرا مدي الحياة القائم علي الترددات القائمة علي النطاق الترددي هو علي الأقل قابل للمقارنة مع السلفة السابقة التي تستند إلى النطاق الزمني والتي توقفت⁸.

لقد قدمنا ابسط O₂ أوبتودي تتكون فقط من مؤشر في مصفوفة البوليمر. والي جانب العديد من المؤشرات الأخرى الممكنة O₂ يمكن تضمين²⁰ التي يمكن ان تستخدم إضافات ، اي عوامل نثر مثل تيو₂ أو مسحوق الماس² لزيادة اشاره الاستشعار مع الحد من الشفافية لأوبتودي. كما يمكن استخدام اصباغ اضافيه لتعزيز كثافة الاشاره عن طريق نقل الطاقة⁴¹.

لتلفيق أوبتودي مستو ، ونحن نوصي باستخدام الفجوة في جهاز طلاء سكين من 75-120 μm لتسفر عن سماكه طبقه الاستشعار النهائي من حوالي 7.5 إلى 12 ميكرومتر بعد تبخر المذيبات (حوالي 10 ٪ من الفجوة المستخدمة) ، عند استخدام الاستشعار وصفها تكوين كوكتيل. هذا هو حل وسط جيد بين كثافة الاشاره ، والتي يمكن تعديلها من قبل اعلي التحميل صبغ ، أو عن طريق اختيار المؤشرات والاصباغ المرجعية لسطوع اعلي ، ووقت الاستجابة. وتؤدي الزيادة في سماكه الطبقة إلى زيادة في وقت الاستجابة ، حيث ان الفترة الزمنيه اللازمة للتحليل للوصول إلى توازن دينامي حراري في طبقه الاستشعار مع الوسائل الاعلاميه المحيطة تزيد¹².

أوبتوديس ، كما هو موضح هنا ، تتفاعل مع التغيرات في O₂ تركيز في غضون ثوان قليله¹⁷ في حين لا تزال لديها اشاره التلالؤ قويه بما فيه الكفاية. ويمكن تحقيق الطلاء الاستشعار ultrathin مع أوقات الاستجابة الثانية الفرعية مع الطلاء الدوار⁶. إذا كان الدعم أو الجهاز طلاء سكين ليست جيده التنظيف ، فانه قد يؤدي إلى طبقات الاستشعار غير متجانسة. أيضا ، عندما الكوكتيل ليس متجانسا تماما أو تطبيقها بسرعة كبيره بعد الانتشار امام جهاز الطلاء مثل هذه النتيجة غير المرغوب فيها يمكن ملاحظتها. لذلك ، قد تحتاج إلى بعض الممارسة لاعداد الأوبتوديس الأمثل.

ويمكن استخدام هذه الطريقة لعينات الصورة التي يمكن وضعها في اتصال وثيق لأوبتودي ، مثل بعض^ال42البحرية الحيوانية ، والاغشيه البيولوجية⁶ والتربة³¹ فقط علي سبيل المثال لا الحصر. نقدم الاعداد مستقل باستخدام هدف ، ومع ذلك ، يمكن بسهوله ان يقترن الكاميرا إلى المجهر لاعلي دقه التصوير الكيميائي⁴³.

في حين ان المجال الزمني القائم علي الاناره الضوئية مدي الحياة تمكين قمع الخلفية الفلورية²⁶، وهذا هو مشكله عند استخدام نظام الكاميرا الجديدة التي تعتمد علي مجال التردد⁸. ونظرا لاكتساب الصورة المستمرة ، فان هذه الكاميرا سوف تسجل اي مضان الخلفية من العينة التي يمكن ان تكون متحمسة لل LED المحددة وتنبعث في النافذة الطيفية المحددة كما هو محدد من قبل فلتر الانبعاثات علي هدف الكاميرا. وهذا سيؤدي إلى انخفاض العمر علي ما يبدو ، التالي في قراءات كاذبه. في حال كنت تعمل مع عينات مع الفلورية الجوهرية متداخلة مع الاثاره O₂ الاستشعار والانبعاثات ، فمن الضروري لتطبيق العزلة البصرية اضافيه علي راس أوبتودي ، من خلال طلاء طبقه اضافيه تحتوي علي الكربون الأسود²^،¹⁷. وهكذا ، فقط التلالؤ المنبعثة من أوبتودي مستو سوف تصل إلى الكاميرا. من أجل التحقق من الخلفية التلالؤ صوره دون أوبتودي يمكن اتخاذها ، والتي من شانها ان تظهر بشكل حصري التلالؤ الجوهري للعينه. ومن الممكن أيضا أضافه عوامل نثر مثل تيو₂ أو مسحوق الماس²^،⁴⁴، إلى كوكتيل الاستشعار ، لزيادة كثافة التلالؤ من صبغ المؤشر. ومع ذلك ، وهذا يمكن ان يؤدي أيضا إلى أسرع تبييض الصور و TiO₂ هو الصورة المعروفة محفز ، والتي يمكن ان تضعف الثبات الضوئي لصبغه⁴¹. وهناك جانب آخر للنظر هو ضوء الخلفية. عند التصوير عمر التلالؤ ، يجب تجنب ضوء الخلفية بأكبر قدر ممكن من الكفاءة. ولذلك ، فان طريقه التصوير هذه تتطلب وضع الاعداد في بيئة مظلمة ويجب إيقاف اي مصدر ضوء خارجي مؤقتا اثناء الحصول علي الصورة.

باختصار ، التصوير مدي الحياة التلالؤ هو أسلوب التصوير الكيميائي قويه التي يمكن تكييفها مع العديد من التطبيقات المختلفة. يغطي هذا البروتوكول (انظر القسم 1-5) جميع الخطوات الاساسيه لتوليد صوره O₂ ويستخدم نظام التصوير مدي الحياة الأكثر مرونة حاليا في مجال الترددات ، والذي يمكن ان يحل محل كاميرا النطاق الزمني المتوقفة المغلقة للتصوير ثنائي الابعاد O₂ مع أوبتوديس مستو.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصاحب البلاغ غيرهارد هولست موظف في الشبكة التي تصنع نظام الكاميرا المستخدمة في هذه المادة. وساهمت الشبكة ماليا في نشر هذه المادة وفي تكاليف النفاذ المفتوح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر صوفي ليندغارد جاكوبسن (جامعه كوبنهاغن) ولارس بورغغارد بيدرسن (جامعه ارهوس) علي المساعدة التقنية. تم الحصول علي تمويل لهذه الدراسة من منحه سابير-Aude المتقدمة من صندوق البحوث المستقلة الدنمارك (الأمر الأمر-1323-00065B ؛ MK) ، منح المشاريع من صندوق البحوث المستقلة الدنمارك | العلوم الطبيعية (قوات ال8021-00308B ؛ MK) & العلوم التقنية والانتاجيه (قوات ال8022-00301B وال4184-00515B ؛ MK) ، ومؤسسه البحوث الوطنية الدنماركية (DNRF136) ، ومؤسسه بول بسبب جنسن (KK).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مضخة هواء مع حجر الهواء ومضخة المياه			أحواض السمك المحلي
Chloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
DC4 مركب سيليكون	Dow Corning GmbH	2793695
خلاط غاز	V & ouml ؛ gtlin Instruments GmbH	red-y مقياس مضغوط GCM	هذه مجرد أداة واحدة ممكنة. تقدم العديد من الشركات أجهزة خلط الغاز
الألواح الزجاجية والأحياء المائية	السمك المحلي أو متجر
ImageJ		برنامج	التصوير المتاح مجانا (imagej.nih.gov/ij/index.html)
جهاز طلاء السكاكين	BYK-GARDNER GMBH	2021	هذا قضيب فيلم رباعي الجوانب يتيح سهولة الاختلاف في سمك الفيلم. تتوفر أيضا إصدارات أخرى. نوصي بسمك الفيلم المطبق بين 75-120 ميكرو ؛ م ، مما ينتج عنه سمك طبقة مستشعر نهائي ~ 10٪ من السماكة المطبقة قبل تبخر المذيبات.
LED ، عاكس PAR38	Megaman	MM17572
LED LEDHUB	Omicon Laserage ، ألمانيا		يمكن تكوينه بمجموعة متنوعة من مصابيح LED. على سبيل المثال المعروض ، يعد مؤشر LED الأخضر (528 نانومتر) ضروريا
LOCTITE AA 3494	Henkel AG & Co. KGaA	NA	لاصق فوري قائم على الأكريليك
NIS عناصر AR Software	Nikon Inc		حزمة البرامج المستخدمة للحصول على الصور
pco.flim	PCO AG ، ألمانيا		كاميرا مدى الحياة
القائمة على مجال الترددالبلاتين (II) -5،10،15،20-tetrakis- (2،3،4،5،6-pentafluorphenyl) - البورفيرين (PtTFPP) Frontier	Scientific	PtT975	O_{2< / sub>}
البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) رقائق	Goodfellow	320-992-72	أيضا العثور على هذه الرقائق من مزودين آخرين وتعمل كدعم قوي
للبوليسترين (PS)	Sigma Aldrich	9003-53-6	مصفوفة البوليمر
Schott مرشح RG610	www.uviroptics.com		هنا يمكن الحصول على برغي 52 مم على المرشحات. تقدم مصادر أخرى مرشحات زجاجية مربعة من زجاج Schott يمكن تثبيتها أمام الهدف
الشريط الكهربائي من الفينيل	سكوتش ، Super 33 +	NA
Zeiss Makro Planar 2/100 مع Hama C لمحول نيكون	الذي يتم تسليمه مع الكاميرا		هنا يمكن أيضا استخدام أي هدف آخر مع محول إذا لم يكن الهدف يحتوي على حامل C

مخزن حوض لاجهزة الكمبيوتر byk.com مصباح مؤشر يمكن

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glud, R. N., Kühl, M., Kohls, O., Ramsing, N. B. Heterogeneity of oxygen production and consumption in a photosynthetic microbial mat as studied by planar optodes. Journal of Phycology. 35 (2), 270-279 (1999).
Moßhammer, M., Strobl, M., Kühl, M., Klimant, I., Borisov, S. M., Koren, K. Design and Application of an Optical Sensor for Simultaneous Imaging of pH and Dissolved O2 with Low Cross-Talk. ACS Sensors. 1 (6), 681-687 (2016).
Jensen, S. I., Kühl, M., Glud, R. N., Jørgensen, L. B., Priemé, A. Oxic microzones and radial oxygen loss from roots of Zostera marina. Marine Ecology Progress Series. , 49-58 (2005).
Larsen, M., Santner, J., Oburger, E., Wenzel, W. W., Glud, R. N. O2 dynamics in the rhizosphere of young rice plants (Oryza sativa L.) as studied by planar optodes. Plant and Soil. 390 (1-2), 279-292 (2015).
Brodersen, K. E., Koren, K., Moßhammer, M., Ralph, P. J., Kühl, M., Santner, J. Seagrass-Mediated Phosphorus and Iron Solubilization in Tropical Sediments. Environmental Science and Technology. 51, 14155-14163 (2017).
Kühl, M., Rickelt, L. F., Thar, R. Combined imaging of bacteria and oxygen in biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 73 (19), 6289-6295 (2007).
Sønderholm, M., et al. Tools for studying growth patterns and chemical dynamics of aggregated Pseudomonas aeruginosa exposed to different electron acceptors in an alginate bead model. npj Biofilms and Microbiomes. 3, 1-11 (2018).
Koren, K., Moßhammer, M., Scholz, V. V., Borisov, S. M., Holst, G., Kühl, M. Luminescence Lifetime Imaging of Chemical Sensors - A Comparison between Time-Domain and Frequency-Domain Based Camera Systems. Analytical Chemistry. 91 (5), 3233-3238 (2019).
Brodersen, K. E., Koren, K., Lichtenberg, M., Kühl, M. Nanoparticle-based measurements of pH and O2 dynamics in the rhizosphere of Zostera marina L.: effects of temperature elevation and light-dark transitions. Plant, Cell & Environment. 39 (7), 1619-1630 (2016).
Zhu, Q., Aller, R. C., Fan, Y. High-Performance Planar pH Fluorosensor for Two-Dimensional pH Measurements. in Marine Sediment and Water. Environmental Science & Technology. 39, 8906-8911 (2005).
Murniati, E., Gross, D., Herlina, H., Hancke, K., Glud, R. N., Lorke, A. Oxygen imaging at the sediment-water interface using lifetime-based laser induced fluorescence (τLIF) of nano-sized particles. Limnology and Oceanography: Methods. 14 (8), 506-517 (2016).
Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils - a review. Analytica Chimica Acta. , 9-42 (2015).
Glud, R. N. Oxygen dynamics of marine sediments. Marine Biology Research. 4 (4), 243-289 (2008).
Revsbech, N. P., Jorgensen, B. B., Blackburn, T. H. Oxygen in the Sea Bottom Measured with a Microelectrode. Science. 207 (4437), 1355-1356 (1980).
Klimant, I., Meyer, V., Kuhl, M. Fiberoptic oxygen microsensors, a new tool in aquatic biology. Limnology and Oceanography. 40 (6), 1159-1165 (1995).
Glud, R. N., Tengberg, A., Kühl, M., Hall, P. O. J., Klimant, I., Holst, G. An in situ instrument for planar O2 optode measurements at benthic interfaces. Limnology and Oceanography. 46 (8), 2073-2080 (2001).
Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9, 348-360 (2011).
Glud, R., Ramsing, N., Gundersen, J., Klimant, I. Planar optrodes:a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
Frederiksen, M. S., Glud, R. N. Oxygen dynamics in the rhizosphere of Zostera marina: A two-dimensional planar optode study. Limnology and Oceanography. 51 (2), 1072-1083 (2006).
Quaranta, M., Borisov, S. M., Klimant, I. Indicators for optical oxygen sensors. Bioanalytical Reviews. 4, 115-157 (2012).
Koren, K., Hutter, L., Enko, B., Pein, A., Borisov, S. M., Klimant, I. Tuning the dynamic range and sensitivity of optical oxygen-sensors by employing differently substituted polystyrene-derivatives. Sensors and Actuators B: Chemical. 176 (100), 344-350 (2013).
Borisov, S. M. Fundamentals of Quenched Phosphorescence O2 Sensing and Rational Design of Sensor Materials. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , 1, Chapter 1 1-18 (2018).
Wang, X., Wolfbeis, O. S. Optical methods for sensing and imaging oxygen: materials, spectroscopies and applications. Chemical Society Reviews. 43, 3666-3761 (2014).
Ehgartner, J., Wiltsche, H., Borisov, S. M., Mayr, T. Low cost referenced luminescent imaging of oxygen and pH with a 2-CCD colour near infrared camera. The Analyst. 139 (19), 4924(2014).
Meier, R. J., Fischer, L. H., Wolfbeis, O. S., Schäferling, M. Referenced luminescent sensing and imaging with digital color cameras: A comparative study. Sensors and Actuators B: Chemical. 177, 500-506 (2013).
Holst, G., Kohls, O., Klimant, I., König, B., Kühl, M., Richter, T. A modular luminescence lifetime imaging system for mapping oxygen distribution in biological samples. Sensors and Actuators B. 51, 163-170 (1998).
Moßhammer, M., Brodersen, K. E., Kühl, M., Koren, K. Nanoparticle- and microparticle-based luminescence imaging of chemical species and temperature in aquatic systems: a review. Microchimical Acta. , 1-28 (2019).
Koren, K., Kühl, M. CHAPTER 7. Optical O2 Sensing in Aquatic Systems and Organisms. Quenched-phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. 1, 145-174 (2018).
Chen, H., Holst, G., Gratton, E. Modulated CMOS camera for fluorescence lifetime microscopy. Microscopy Research and Technique. 78, 1075-1081 (2015).
Franke, R., Holst, G. A. Frequency-domain fluorescence lifetime imaging system (pco.flim) based on a in-pixel dual tap control CMOS image sensor. Proceedings of SPIE 93281, Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues XIII. , 1-19 (2015).
Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
Schreml, S., et al. 2D luminescence imaging of physiological wound oxygenation. Experimental dermatology. 20 (7), 550-554 (2011).
Trampe, E., et al. Functionalized Bioink with Optical Sensor Nanoparticles for O2 Imaging in 3D-Bioprinted Constructs. Advanced Functional Materials. 1804411, 1804411(2018).
Gouterman, M. Oxygen Quenching of Luminescence of Pressure Sensitive Paint for Wind Tunnel Research. Journal of Chemical Education. 74 (6), 697(1997).
Fischer, L. H., et al. Referenced dual pressure- and temperature-sensitive paint for digital color camera read out. Chemistry. 18 (49), 15706-15713 (2012).
Fabricius-Dyg, J., Mistlberger, G., Staal, M., Borisov, S. M., Klimant, I., Kühl, M. Imaging of surface O2 dynamics in corals with magnetic micro optode particles. Marine Biology. 159 (7), 1621-1631 (2012).
Koren, K., Jakobsen, S. L., Kühl, M. In-vivo imaging of O2 dynamics on coral surfaces spray-painted with sensor nanoparticles. Sensors and Actuators B: Chemical. 237, 1095-1101 (2016).
Carraway, E. R., Demas, J. N., DeGraff, B. A., Bacon, J. R. Photophysics and Photochemistry of Oxygen Sensors Based on Luminescent Transition-Metal Complexes. Analytical Chemistry. 63 (4), 337-342 (1991).
Klimant, I., Ruckruh, F., Liebsch, G., Stangelmayer, A., Wolfbeis, O. S. Fast response oxygen micro-optodes based on novel soluble ormosil glasses. Mikrochimica Acta. 131, 35-46 (1999).
Askaer, L., Elberling, B., Glud, R. N., Kühl, M., Lauritsen, F. R., Joensen, H. P. Soil heterogeneity effects on O2 distribution and CH4 emissions from wetlands: In situ and mesocosm studies with planar O2 optodes and membrane inlet mass spectrometry. Soil Biology and Biochemistry. 42 (12), 2254-2265 (2010).
Mayr, T., Borisov, S. M., Abel, T., Enko, B., Waich, K. Light Harvesting as a Simple and Versatile Way to Enhance Brightness of Luminescent Sensors. Analytical Chemistry. 81, 6541-6545 (2009).
Kühl, M., et al. Microenvironmental Ecology of the Chlorophyll b-Containing Symbiotic Cyanobacterium Prochloron in the Didemnid Ascidian Lissoclinum patella. Frontiers in microbiology. 3, 1-18 (2012).
Dalfen, I., Dmitriev, R. I., Holst, G., Klimant, I., Borisov, S. M. Background-Free Fluorescence-Decay-Time Sensing and Imaging of pH with Highly Photostable Diazaoxotriangulenium Dyes. Analytical Chemistry. 91 (1), 808-816 (2019).
Chatni, M. R., Maier, D. E., Porterfield, D. M. Evaluation of microparticle materials for enhancing the performance of fluorescence lifetime based optrodes. Sensors and Actuators B: Chemical. 141, 471-477 (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

التلالؤ التصوير مدي الحياة من O₂ مع تردد-نظام الكاميرا المستندة إلى المجال

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة