يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التزجيج الحبريه السائبة للحفاظ علي الخلايا الكبدية الاساسيه

5.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60250

⸱

أكتوبر 25, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, 2Shriners Hospitals for Children, Boston, 3Department of Surgery, University of Amsterdam

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المخطوطة طريقه الحفظ بالتبريد الخالية من الجليد للكميات الكبيرة من خلايا الكبد الفئران التي يتم فيها الاحتضان المسبق للخلايا الاوليه مع عوامل كريوبروتيكتيفي بتركيز منخفض والمزجج في قطرات كبيره.

الملخص

التزجيج هو بديل الجليد خاليه واعده لتجميد الكلاسيكية بطيئه (في حوالي 1 درجه مئوية/دقيقه) بالتبريد من العينات البيولوجية. ويتطلب التزجيج معدلات تبريد سريعة للغاية لتحقيق انتقال المياه إلى المرحلة الزجاجية مع تجنب تشكيل الجليد الضار. علي الرغم من ان مرحله ما قبل الحضانة مع وكلاء كريوبروتيكتيفي (CPA) يمكن ان تقلل من معدل التبريد الحرجة من العينات البيولوجية ، وهناك حاجه عموما إلى تركيزات عاليه لتمكين الجليد خاليه من البرد التجميد عن طريق التزجيج. ونتيجة لذلك ، فان التزجيج يعوقه التسمم ببموجب اتفاق السلام الشامل ويقتصر علي العينات الصغيرة التي يمكن تبريدها بسرعة. وقد تبين مؤخرا ان هذه القيود المتاصله يمكن التغلب عليها بواسطة التزجيج التجميعي السائب. باستخدام هذه الطريقة الجديدة ، يتم أولا احتضان الخلايا مع تركيز CPA منخفض داخل الخلايا. الاستفادة من الجفاف السريع الاسموزي ، تتركز التكلفة النسبية للاكتساب داخل الخلايا مباشره قبل التزجيج ، دون الحاجة إلى تتوازن تركيزات التكلفة الكلية السامة بالبالكامل. يتم تنفيذ الجفاف الخلوية في جهاز فلويدريك ومتكاملة مع توليد الانتاجيه العالية المستمر من قطرات كبيره الحجم التي يتم المزجج في النيتروجين السائل. هذه الطريقة الخالية من الجليد بالتبريد مع سميه الحد الأدنى للاكتساب مناسبه لكميات الخلايا الكبيرة والنتائج في زيادة القدرة علي البقاء في الكبد ووظيفة التمثيل الأيضي بالمقارنة مع الكلاسيكية بطيئه تجميد التبريد. تصف هذه المخطوطة أساليب التزجيج التجميعي الناجح للقطرة السائبة بالتفصيل.

المقدمة

فقدان القدرة علي البقاء في الخلية والتمثيل الأيضي بعد التجميد من الخلايا الكبدية لا تزال قضية رئيسيه التي تحد من التطبيقات السريرية1,2,3. الطريقة القياسية لحفظ الخلايا الكبدية هي بطيئه التجمد ، والتي يتم تنفيذها قبل احتضان الخلايا الكبدية مع CPA (ثنائي ميثيل سلفوكسيد [dmso] ، والجلوكوز ، والزلال) وتجميد معدل اللاحقة (في حوالي 1 درجه مئوية/دقيقه) درجاتالحرارة المبردة 4,5. علي الرغم من العديد من التحسينات المبلغ عنها ، وسميه CPA مع الاختلالات الاسموزي الضارة اثناء تجميد والإجهاد الميكانيكي لتشكيل الجليد لا تزال العيوب الاساسيه لبطء تجميد6،7.

[تزجيج] يقدم ميزه علي [سلو-فريز] في ان أصابه واجبه إلى جليد تشكيل يكون تماما تفاديت بمباشره طور انتقال الماء داخل الزجاج دوله6. ومع ذلك ، للوصول إلى درجه حرارة التحول الزجاج من المياه النقية (-137 درجه مئوية) ، يجب تبريد المياه بمعدلات بترتيب 1,000,000 درجه مئوية في الثانية (اي معدل التبريد الحرجة) لتجنب تشكيل الجليد فوق درجه حرارة التحول الزجاج8 . أضافه CPAs يمكن ان تخفض معدل التبريد الحرجة وزيادة درجه حرارة التحول الزجاج من الحلول المائية9. ومع ذلك ، حتى مع تركيزات تكلفه الاكتساب العالية (علي سبيل المثال ، 40 ٪ v/v dmso أو اعلي) ومع ذلك فان معدلات التبريد السريع مطلوبه لعمليه التزجيج الناجحة8،9.

وتؤدي معدلات التبريد المطلوبة وتركيزات CPA العالية إلى عيبين رئيسيين في التزجيج. أولا ، لتمكين التبريد السريع ، يجب ان تكون العينات كتله حراريه منخفضه. ثانيا ، للوصول إلى تركيزات CPA عاليه مع تجنب الاصابه الاسموزي ، يجب إدخال CPAs ببطء ومعايرتها بالبالكامل بين المقصورات داخل وخارج الخلية6. وهذا يزيد من وقت التعرض للخلايا إلى CPAs السامة. معا ، وهذا يجعل التزجيج عمليه مرهقه التي تقتصر علي عدد قليل من العينات الصغيرة الحجم (ميكروليتر) في وقت واحد. وقد اقترح التزجيج التجميعي كحل محتمل لهذه القيود. من خلال تعريض قطرات الخلايا الضئيلة الحجم (نانولتر) إلى النيتروجين السائل ، فان معدل التبريد يزداد بشكل ملحوظ ، مما يسمح بالتالي بتخفيض كبير في تركيز CPA10،11،12 و13و14. علي الرغم من ان العديد من فوات توليد القطرات عاليه التردد يمكن استخدامها في وقت واحد ، فان حجم القطيرات الصغير للغاية يحد من الانتاجيه إلى ميكروليتر في الدقيقة10، مما يمنع التزجيج الفعال للخلية الكبيرة وحدات التخزين بمقادير اعلي من معدلات المعالجة بترتيب ملليلتر في الدقيقة.

وقد تبين مؤخرا ان هذه القيود المتاصله في التزجيج يمكن التغلب عليها بواسطة التزجيج التجميعي للقطيرات السائبة15. هذه الطريقة الجديدة تعزز الجفاف الاسموزي السريع للتركيز علي تركيز CPA داخل الخلايا من 7.5 ٪ v/v جلايكول الاثيلين و DMSO السابقة مباشره التزجيج ، والقضاء علي الحاجة إلى تاخيرمن كامله من تركيزات CPA السامة. يتم اجراء الجفاف الخلوي في جهاز فلويدريك عن طريق التعرض قصيرة من خلايا الكبد إلى تركيز CPA عاليه الخلية. علي الرغم من ان هذا التعرض يسبب الجفاف الاسموزي السريع ، فانه قصير جدا لتركيز CPA عاليه لتنتشر في الخلايا. مباشره بعد الجفاف ، يتم تحميل الخلايا في قطرات التي يتم المزجج مباشره في النيتروجين السائل. هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى الاستيعاب الكامل داخل الخلايا من تركيزات CPA عاليه في حين ان تركيز CPA عاليه الخلية تمكن من التزجيج من قطرات كبيره الحجم ، مما ادي إلى كميات عاليه الانتاجيه مع الحد الأدنى من سميه CPA.

التزجيج الحبريه يحسن القدرة علي البقاء المباشر وعلي المدى الطويل بعد الحفاظ عليها ، فضلا عن المورفولوجية ووظيفة الأيض من الخلايا الكبدية الرئيسية الفئران بالمقارنة مع الحفظ الكلاسيكي بالتبريد ببطء تجميد15. تقدم هذه المخطوطة التفاصيل المنهجية للتزجيج الحبريه السائبة من خلايا كبديه الفئران الاوليه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ العزلات الكبدية الاساسيه لهذا البروتوكول من قبل نواه الموارد الخلية (CRC) في مستشفي ماساتشوستس العام ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات الامريكيه. تمت الموافقة علي بروتوكول الحيوانية (#2011N000111) من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من مستشفي ماساتشوستس العام.

1-التزجيج الحبريه السائبة

  1. اعداد حلول التزجيج.
    1. أضافه 40 ملغ من الزلال المصل البقري (بوسنيا) إلى 17.0 مل من جامعه ويسكونسن الحل (UW) لجعل الحل التزجيج 1 (V1). تصفيه معقمه الحل V1 باستخدام فلتر 0.22 μm وتخزين في 4 درجه مئوية.
      ملاحظه: UW هو الحل الحفاظ علي الجهاز المستخدمة بشكل شائع. انه يحتوي علي 50 g/l هيدروكسي ايثيل النشا ، 35.83 g/l حمض اللاكتوبيونيك ، 3.4 g/l فوسفات البوتاسيوم أحادي ، 1.23 g/l كبريتات المغنيسيوم هبت aهيدرات ، 17.83 g/l raffinose pentahydrate ، 1.34 g/l ادنودن ، 0.136 g/l الوبيورينول ، 0.992 g/l مجموع الجلوتاثيون ، 5.61 g /L هيدروكسيد البوتاسيوم ، وهيدروكسيد الصوديوم لضبط درجه الحموضة إلى 7.4.
    2. الجمع بين 7.0 مل من UW ، 6.5 mL من DMSO ، 6.5 mL من الاثيلين جلايكول (EG) ، 40 ملغ من جيش صرب الجمهورية ، و 5.48 غرام من السكروز لجعل حل التزجيج 2 (V2). تصفيه معقمه الحل V2 باستخدام فلتر 0.22 μm. تحميل 3.5 مل من محلول العقيمة المصفاة V2 في حقنه 3 مل وتخزين في 4 درجه مئوية.
      ملاحظه: لتسهيل حل CPAs ، يتم اعداد الحلول بكميات أكبر من المطلوب.
  2. اعداد جهاز التزجيج الحبريه السائبة.
    1. لاعداد ابره الخلط ، قطع أولا علي طول جانب واحد من الأكمام الرمادية الخارجية ابره خلط ، ومن ثم ثني الأكمام مفتوحة لأزاله من ابره الخلط.
    2. الشريحة 2 25 مم أنابيب السيليكون المقاطع علي مداخل الابره خلط وتامين موقفهم مع الغراء (الشكل 1ا).
    3. قطع الابره إلى طول 20 ملم (اي طول الحلزون خلط الداخلية) كما هو مبين في الشكل 1ا.
      ملاحظه: طول ابره خلط يتناسب مع مستوي الصوت داخل الابره ، التالي يمكن تغييرها للسيطرة علي وقت التعرض للخلايا الكبدية إلى حل تركيز CPA عاليه.
    4. ادخل ماخذ القطع لابره الخلط في ابره حقن 20 جرام (الشكل 1ب).
      ملاحظه: حجم ابره الحقن يؤثر علي حجم القطيرات.
    5. تعقيم الجمعية ابره خلط عن طريق التعقيم.
    6. أملا ديوار معقم بالنيتروجين السائل. تعقيم خارج ديوار مع ايزوبروبانول قبل وضع ديوار في الخلية العقيمة تدفق الخلايا الثقافة هود.
      ملاحظه: التلوث هو اعتبار مهم اثناء التعرض المباشر للقطرات إلى النيتروجين السائل. علي الرغم من عدم وجود تلوث باستخدام النيتروجين السائل غير معقم في البروتوكول الحالي ، يمكن تصفيه النيتروجين السائل أو المشع لضمان العقم إذا لزم الأمر16.
    7. ادراج قمع مع القطر الخارجي نفس القطر الداخلي لل dewar النيتروجين السائل إلى أنبوب مخروطي 50 mL لإنشاء جهاز جمع الحبريه (الشكل 1C−E).
    8. دمج جهاز تجميع القطرات في النيتروجين السائل بالضغط عليه ببطء في موضعه العمودي النهائي باستخدام ملقط كبير. تاكد من ان الأنبوب المخروطي يقع في وضع عمودي في أسفل الديوان (الشكل 1D−E).
      ملاحظه: يجب ان يبقي القمع المدرجة في ويستريح علي أنبوب مخروطي الشكل. يجب ان يكون مستوي النيتروجين السائل 1 سم تحت ارتفاع مدخل القمع ، كما هو مبين في الشكل 1د.
    9. جبل مضخة حقنه في موقف عمودي علي جدار هود ثقافة الخلية عن طريق ربط سلسله من القدمين مضخة حقنه لمسامير جاحظ من جدار الخلية الثقافة هود.
    10. ضع النيتروجين السائل ديوار مع جهاز تجميع الحبريه تحت مضخة حقنه عموديا (الشكل 1ه).
  3. قبل احتضان مع CPAs.
    1. بعد الحصول علي خلايا الكبد الفئران المعزولة الطازجة ، عد تركيز الأسهم من قبل الاستبعاد الأزرق تريبان واتخاذ 40,000,000 خلايا الكبد قابله للحياة.
      ملاحظه: التعامل مع لطيف من خلايا الكبد في تعليق أمر بالغ الاهميه لمنع موت الخلايا.
    2. الطرد المركزي في 50 x g لمده 5 دقائق دون الفرامل.
    3. يستنشق ماده طافي وأعاده التعليق علي خلايا الكبد في 3.4 مل من محلول V1.
    4. احتضان علي الجليد لمده 3 دقائق.
    5. أضافه 150 μL من DMSO و 150 μL من EG إلى خلايا الكبد وتخلط برفق.
    6. احتضان علي الجليد لمده 3 دقائق.
    7. مره أخرى ، أضافه 150 μL من DMSO و 150 μL من EG إلى خلايا الكبد وتخلط برفق.
    8. تحميل 3.5 mL في حقنه 3 مل.
  4. اجراء التزجيج.
    1. ادراج حقنه مع الخلايا الكبدية قبل احتضان والمحاقن الحل V2 علي محول مضخة حقنه.
    2. نعلق اثنين من الإناث Luer قفل خرطوم المحولات بارب إلى المحاقن والانزلاق أنابيب السيليكون من الجمعية الخلط ابره علي التجهيزات بارب (الشكل 1و).
    3. وضع التجميع بأكمله في مضخة حقنه (الشكل 1ه).
    4. ثلاث دقائق بعد الاضافه الاخيره من DMSO و EG إلى الخلايا الكبدية ، وبدء المضخة في 2 مل/دقيقه.
    5. وقف المضخة بعد ان تم أضافه جميع الخلايا الكبدية إلى النيتروجين السائل.

2. تخزين المبردة

  1. ثقب 10 ثقوب صغيره في غطاء أنبوب مخروطي 50 mL باستخدام ابره 20 G والتفاف خارج الغطاء مع فيلم مرنه ، كما هو مبين في الشكل 1ب. هذا يخلق صمام التي تمكن من الهروب من تبخر بقايا النيتروجين السائل.
  2. لجمع قطرات الخلايا الكبدية المزجج ، أولا أزاله القمع من النيتروجين السائل ديوار. بعد ذلك ، استخدم ملقط طويل لأخذ الأنبوب المخروطي الذي يحتوي علي قطرات من النيتروجين السائل ويصب ببطء النيتروجين السائل الزائد من الأنبوب المخروطي.
  3. اغلق الأنبوب المخروطي مع الغطاء المثقوب وضع الأنبوب المخروطي المغلق مباشره مع قطرات الكبد اللاذعة مره أخرى في ديوار النيتروجين السائل.
  4. نقل أنبوب مخروطي من النيتروجين السائل إلى بخار النيتروجين السائل التبريد.

3. أعاده تسخين قطرات الكبد اللاذعة

  1. اعداد حل أعاده التسخين.
    1. حل 17.13 غرام من السكروز في 100 mL من الاعلام الكبدي DMEM الثقافة لجعل حل أعاده الاحترار. تصفيه معقمه حل أعاده الاحترار باستخدام فلتر 0.22 μm ودافئه إلى 37 درجه مئوية.
  2. أعاده تسخين خلايا الكبد.
    1. اتخاذ أنبوب مخروطي مع الخلايا الكبدية المزجج من البرد ونقلها في ديوار النيتروجين السائل إلى غطاء المحرك الثقافة الخلية.
    2. تخفيف طفيفه الغطاء ووضع الأنبوب المخروطي مره أخرى في النيتروجين السائل.
    3. أضافه قطرات الكبد المزجج إلى الكاس فارغه ، أضافه علي الفور الدافئة (37 درجه مئوية) حل أعاده الاحترار ، ويحرك فورا ل 10 ثانيه.
      ملاحظه: من الضروري العمل بسرعة لتجنب التجمد اثناء أعاده التسخين. اعتمادا علي متطلبات الدراسة ، يمكن أعاده تسخين عدد قليل من جميع قطرات المزجج في ان واحد.
  3. تفريغ الحل أعاده الاحترار.
    1. تقسيم الحل أعاده الاحترار مع خلايا الكبد أكثر من 2 50 مل أنابيب مخروطيه.
    2. الطرد المركزي الأنابيب المخروطية اثنين لمده 2 دقيقه في 100 x g في 4 درجه مئوية دون الفرامل.
    3. يستنشق ماده طافي لترك حجم الكلي من 12.5 ml باستخدام علامة التخرج أنبوب مخروطي الشكل كمرجع وأضافه 12.5 ml من الجليد dmem الباردة لكل أنبوب مخروطي لتخفيف الحل أعاده الاحترار إلى 50 ٪.
    4. أعاده تعليق خلايا الكبد واحتضان علي الجليد لمده 3 دقائق.
    5. أضافه 25 مل من الجليد DMEM الباردة لكل أنبوب مخروطي لتخفيف الحل أعاده الاحترار إلى 25 ٪.
    6. الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 50 x g في 4 درجه مئوية دون الفرامل.
    7. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق خلايا الكبد في 2 مل من الثقافة المطلوبة المتوسطة للاستخدام.
      ملاحظه: يمكن استخدام طرد التدرج الكثافة لأزاله خلايا الكبد الميتة من تعليق الخلية إذا رغبت في ذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام خلايا الكبد الاوليه المعزولة الطازجة من خمسه كبد فئران مختلفه للمقارنة المباشرة للتزجيج الحبريه السائبة إلى الحجز الكلاسيكي بالتبريد باستخدام بروتوكولات التجميد البطيء البارزة المبلغ عنها في الأدبيات4، 5. باختصار ، تم تعليق خلايا الكبد في UW تستكمل مع جيش صرب البوسنيين (2.2 ملغ/مل) ، والجلوكوز (333 mM) ، و DMSO (10 ٪ v/v) والمجمدة باستخدام الفريزر معدل الخاضعة للرقابة. بعد التخزين في-196 درجه مئوية ، تم أذابه العينات في حمام الماء الدافئ. بعد كل الجلي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الحفظ بالتبريد من خلايا الكبد ببطء تجميد النتائج في انخفاض القدرة علي البقاء والتمثيل الأيضي وظيفة. يقدم التزجيج بديلا واعدا للحجز الكلاسيكي بالتبريد ، حيث يتم تجنب الاصابه بالتجمد تماما9. ومع ذلك ، مطلوب الحضانة مع CPAs لخفض معدل التبريد الحرجة8. التالي ، فان التسمم الذي تتعرض له الوحدة17 ويقتصر علي حجم العينات الصغيرة يعوق التزجيج. وفي اطار الجهود المبذولة للتغلب علي هذه القيود ، تم تطوير طريقه التزجيج التجميعي المقدمة في هذه المخطوطة للتمكين من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ المصالح المالية المتنافسة. وقد طلبات البراءات المؤقتة ذات الصلة بهذه الدراسة من قبل الاستخبارات الخاصة. الدكتور يوغون لديه مصلحه مالية في الاجهزه الحلول ، وهي شركه تركز علي تطوير الجهاز الحفاظ علي التكنولوجيا. تدار جميع اهتمامات الباحثين من قبل وزاره الصحة العامة وشركاء الرعاية الصحية وفقا لسياسات تضارب المصالح الخاصة بهم.

شكر وتقدير

التمويل من المعاهد الوطنية الامريكيه للصحة (R01DK096075, R01DK107875, و R01DK114506) ووزارة الدفاع الامريكيه (وزاره الخارجية RTRP W81XWH-17-1-0680) ومن المسلم به إلى حد كبير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BD محاقن 3 مل يمكن التخلص منها مع نصائح Luer-Lokفيشر Scientific14-823-435
دورقSigma-AldrichCLS1000-250
Belzer UW حل التخزين الباردجسر الحياةBUW-001
مصل الأبقار الألبومينSigma-AldrichA7906
Cole-Parmer أنثى Luer إلى 1/16 "شريط أنابيب شبه صلبة منخفض المستوى ، PPCole-ParmerEW-45508-12
خزان ستروج مبرد /مخطط خزان التبريد صناعاتMVE 800
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما-ألدريتشD8418
DMEM ، مسحوق ، جلوكوز عالي ، بيروفاتتقنيات الحياة12800-082
إيثيلين جلايكولسيجما ألدريتش107-21-1
ملقططويل جدافيشر ساينتفيك10-316C
فيشربراند أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية سهلة القراءة عالية السرعة - إغلاق علوي مسطحفيشر ساينتفيك06-443-18
خط الصيدStrenSOFS4-15
النيتروجين السائلAirgas7727-37-9
أنابيب السيليكون المعالجة بالبلاتين Masterflex L / S ، L / S 14Cole-ParmerEW-96410-14
نصائح المزيج ، للاستخدام مع 3HPW1Grainger3WRL7
Nalgene مسحوق البولي بروبيلين قمعThermoFisher4252-0100
إبرة 20 gaBecton Dickinson (BD)305175
Parafilm M - فيلم مرنSigma-AldrichP7793-1EA
شفرة الحلاقةفيشر Scientific12-640
ملعقةكول بارمرEW-06369-18  فلتر معقم < / u>
Steriflipسكروز فيشر ScientificSE1M179M6
(بلوري / معتمد ACS) FisherScientificS5-500
مضخة حقنةNew Era Pump Systems Inc.NE-1000
حراري قارورة منضدة حاوية النيتروجين السائلThermoFisher2122

المراجع

  1. Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
  2. Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
  3. Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
  4. Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
  5. Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
  6. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).
  7. Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
  8. Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
  9. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
  10. Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).
  11. El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
  12. Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
  13. Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530(2011).
  14. Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
  15. de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
  16. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  17. Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التزجيج الحبريه السائبة للحفاظ علي الخلايا الكبدية الاساسيه
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.