إسكات شراره: CRISPR/كاس 9 الجينوم التحرير في الأسماك الكهربائية ضعيف

وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. اثنين من السلالات من الأسماك تيليوست ، العظم العظمي و siluriformes ، تطورت الكهربي في موازاة ذلك ، وخمسه السلالات من تيليوستس (جينوتيفورسيس ، mormyrids ، والأجناس astroscopus، مالتراوروس ، والزليلي) تطورت الكهربية بالتوازي. هناك درجه ضرب من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المستمدة بشكل مستقل ، والتي تشترك في العمارة الوراثية المشتركة^1،2،3.

ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست clades ، والتي تنتج والكشف عن الحقول الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية بشكل ضعيف. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء لاستشعار محيطها والتواصل⁴، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية^{1،5 ،6}، نظم ودوائر علم الأعصاب^7،8،9،10، فسيولوجيا الخلوية^11،12، الإيكولوجيا و تصغر^{13 ،14،15،16،17}، السلوك^18،19، و ماكروايفوليوشن^3،20،21 .

في الاونه الاخيره ، كان هناك انتشار الجينوم ، الناسخ ، والموارد البروتينية للأسماك الكهربائية^{1،22،23،24،25،26، 27و28}. وقد أسفر استخدام هذه الموارد بالفعل عن رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع^{1و2و3و28و29 ،30}. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية³¹.

واحده من هذه الاداات هي التي تم تطويرها مؤخرا متفاوت المسافات المتقاربة بانتظام المتناظرة القصيرة التكرارات المقترنة مع كاس 9 نوكليوداز (CRISPR/كاس 9 ، CRISPR) تقنيه. Crispr/كاس 9 هو أداه تحرير الجينوم التي دخلت استخداما واسع النطاق في كل من نموذج^32،33،34 وغير الكائنات النموذجية^35،36،37 علي حد سواء. وقد تقدمت تكنولوجيا CRISPR/كاس 9 إلى نقطه حيث يمكن للمختبر قادر علي البيولوجيا الجزيئية الاساسيه بسهوله توليد تحقيقات الجينات الخاصة تسمي الإرشاد القصير RNAs (sgRNAs) ، بتكلفه منخفضه باستخدام طريقه عدم الاستنساخ³⁸. Crispr لديه مزايا علي غيرها من الضربات القاضية/الضربة القاضية استراتيجيات, مثل مورفولينوس^39,40, النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب (talens), والزنك الاصبع نوكليسيس (zfns), التي هي مكلفه و تستغرق وقتا طويلا لتوليد كل الجينات المستهدفة.

وظائف نظام CRISPR/كاس 9 لخلق الضربات القاضية الجينات من خلال استهداف منطقه معينه من الجينوم ، من إخراج تسلسل sgRNA ، وتسبب كسر التي تقطعت بهم السبل مزدوجة. يتم الكشف عن الكسر المزدوج الذي تقطعت به السبل من قبل الخلية ويحفز أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية بتفضيل باستخدام المسار غير المتماثلة نهاية الانضمام (NHEJ). هذا المسار هو عرضه للخطا للغاية: خلال عمليه الإصلاح ، وجزيء الحمض النووي وغالبا ما تدمج الادراج أو الحذف (indels) في موقع كسر التي تقطعت بها السبل مزدوجة. هذه العوامل يمكن ان يؤدي إلى فقدان وظيفة بسبب اما (1) التحولات في اطار القراءة المفتوحة ، (2) ادراج codon توقف سابق لأوانه ، أو (3) التحولات في البنية الاساسيه الحرجة من المنتج الجيني. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم CRISPR/كاس 9 التحرير إلى الطفرات نقطه الهدف في الجينات المستهدفة باستخدام NHEJ في أنواع الأسماك الكهربائية ضعيفه. في حين ابسط وأكثر كفاءه من التقنيات الأخرى ، ومن المتوقع ان يؤدي هذا الأسلوب من الطفرات في مجموعه من السلالات الظاهرية في F₀، والذي يعزي إلى الجينات الوراثية^{41،42،43 ،44}.

اختيار الكائنات الحية
ولأغراض تيسير الدراسات المقبلة بشان الجينوم المقارن للأسماك الكهربائية الضعيفة ، هناك حاجه إلى اختيار نوع تمثيلي لكل من النماذج الرياضية والmormyrids لتطوير البروتوكول. وفي أعقاب المناقشات التي جرت خلال اجتماع 2016 الأسماك الكهربائية في مونتيفيديو ، اوروغواي ، كان هناك توافق في الآراء بين المجتمعات المحلية لاستخدام الأنواع التي يمكن تربيتها بالفعل في المختبر والتي تتوفر لديها موارد جينيه. وقد تم اختيار الأنواع التي تناسب هذه المعايير والتي تم تحديدها بالشكل المثالي لهذا النوع من الكائنات. في كلا النوعين ، من السهل تقليد العظة الطبيعية للحث علي ظروف التكاثر والحفاظ عليها في الأسر. B. gauderio، الأنواع عاريه الشكل من أمريكا الجنوبية ، لديه ميزه انخفاض متطلبات التربية: يمكن الاحتفاظ بالأسماك في كثافة عاليه نسبيا في الدبابات الصغيرة نسبيا (4 لتر). B. gauderio لديها أيضا دوران الأجيال بسرعة في ظل ظروف الأسير. تحت الظروف المختبرية ، b. gauderio يمكن ان تتطور من البيض إلى الكبار في حوالي 4 أشهر.

B. بالضغط الذاتي ، وهو نوع من الأسماك القنوميه من غرب وسط افريقيا ، والسلالات بسهوله في الأسر. B. بسهوله المتاحة من خلال التجارة حوض السمك ، وقد استخدمت علي نطاق واسع في العديد من الدراسات ، والآن لديها عدد من الموارد الجينوم المتاحة. تمتد دوره حياتهم من 1 − 3 سنوات ، اعتمادا علي الظروف المختبرية. وتعد متطلبات التربية أكثر كثافة إلى حد ما بالنسبة لهذه الأنواع ، التي تتطلب دبابات متوسطه الحجم (50 − 100 لتر) بسبب عدوانها اثناء التكاثر.

وينبغي ان تكون المختبرات التي تدرس أنواعا أخرى من الأسماك الكهربائية قادره علي تكييف هذا البروتوكول بسهوله ما دام النوع يمكن ان يولد ، ويمكن جمع أجنه الخلايا الوحيدة وتربيتها في مرحله البلوغ. ومن المرجح ان تتغير معدلات الإسكان وتربيه اليرقات والإخصاب في الأنابيب مع الأنواع الأخرى ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول كنقطه انطلاق لمحاولات تربيه في الأسماك الكهربائية الأخرى ضعيفه.

هدف الجينات المثالي لإثبات المفهوم: scn4aa
[مورلي] كهربائيه [مورميريد] و [غنوتيفورم] سمكه يلدون [الكتريك فيلد] ([الكتروجينيسيس]) ب يقيل جهاز يختص, يدعي الجهاز كهربائيه. تصريف الأعضاء الكهربائية (EODs) نتيجة لإنتاج في وقت واحد من إمكانات العمل في خلايا الجهاز الكهربائي يسمي الكتروسيتس. يتم الكشف عن EODs بواسطة مجموعه من المستقبلات الكهربية في الجلد لإنشاء صور كهربائيه عاليه الدقة لمحيط الأسماك⁴⁵. الأسماك الكهربائية ضعيفه هي أيضا قادره علي الكشف عن ملامح الموجات التخلص من الذخائر المتفجرة الخاصة بهم¹⁸ وكذلك معدلات التفريغ الخاصة بهم⁴⁶، مما يسمح eods للعمل بالاضافه إلى ذلك كاشاره الاتصالات الاجتماعية مماثله للطيور أو الضفدع النطق⁴⁷.

المكون الرئيسي للعمل توليد المحتملة في الكهرباء من كلا القنوميه وعاريه السمك الكهربائية ضعيف هو الجهد بوابات قناه الصوديوم التنقل 1.4². لاكهربائية تيليوستس التعبير عن نسختين بارالوجوس الجينات ، scn4aa و scn4ab، والترميز لقناه الصوديوم الجهد بوابات التنقل 1.4³⁰. في كل من عاريه الشكل و القنوميه الأسماك الكهربائية ضعيفه السلالات, scn4aa تطورت بسرعة وخضع العديد من البدائل الأحماض الامينيه التي تؤثر علي خصائصه الحركية⁴⁸. الأهم من ذلك ، أصبح scn4aa مجزاه في كلا السلالتين إلى الجهاز الكهربائي^2،3. التعبير المقيد نسبيا من scn4aa إلى الجهاز الكهربائي ، فضلا عن دورها الرئيسي في توليد المواد المستنفدة للأوزون ، يجعلها هدفا مثاليا لتجارب الضربة القاضية crispr/كاس 9 ، كما ان لديها الحد الأدنى من الآثار الوخيمة الضارة. لان الأسماك الكهربائية الضعيفة تبدا التفريغ أجهزتهم الكهربائية اليرقات 6 − 8 أيام بعد الإخصاب (DPF) ، واستهداف scn4aa هو مناسبه بشكل مثالي للنمط الظاهري السريع بعد الحقن المجهري الجنين.

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعه ولاية ميشيغان.

1. تحديد أهداف sgRNA

ملاحظه: يتم توفير بروتوكول للتصميم اليدوي من sgRNAs في الخطوة 1.1. وقد استخدم هذا لاختيار الهدف scn4aa . ويتم توفير بروتوكول إضافي لتيسير هذه العملية (الخطوة 1.2) باستخدام بوابه الويب الخاصة ب EFISHGENOMICS. ومن المستحسن ان المستخدمين تحديد بروتوكول 1.2 ، الذي يتميز العديد من "الشيكات" الألى لضمان النجاح في تصميم sgRNAs للأهداف المخصصة.

1. تصميم أهداف sgRNA.
   1. لتوليد sgrna دليل oligos ، فمن الأفضل لاستهداف اكسون 1 ، أو غيرها من 5 ' اكسون. ويمكن استهداف 5 ' UTR; ومع ذلك ، فمن الأفضل لاستهداف 5 ' تسلسل الترميز. الاستفادة من المعلومات الجينية هو الأفضل ، ولكن من الممكن تطوير sgRNAs ناجحه باستخدام البيانات الناسخ. ومن الأفضل الشروح المتعلقة بالحدود الفاصلة بين الداخل والاخر (البيانات الجينية) أو حدود exon/exon.
   2. يتم البحث عن متواليات الجينوم المرشح من 1.1 للتسلسلات المستهدفة المفترضة التي تتطابق مع نمط 5 '-N (18)-NGG-3 '. يمكن تنفيذ ذلك تلقائيا باستخدام برنامج تحليل تسلسل سطح المكتب أو البرامج النصية المخصصة أو من خلال الفحص اليدوي للتسلسل.
   3. يمكن إعطاء الاولويه للتسلسل باستخدام طريقه Doench et al.⁴⁹ للنشاط المستهدف. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن تقييم التسلسلات المستهدفة عن طريق البحث عن الانفجارات ضد قواعد البيانات الجينية/الناسخة للربط خارج الهدف.
   4. تاكد من انه يمكن إنشاء الإشعال PCR القياسية التي الجناح تسلسل الهدف. يجب ان تكون الإشعال 20 bp علي الأقل من جانبي موقع القطع (ثلاثه قواعد منبع سلسله NGG). ومن الناحية المثالية ، يجب ان يكون المنتج PCR 150 − 200 أزواج القاعدة (bp).
   5. تصميم اوليغمرات الاجتماع المعايير المذكورة أعلاه باستخدام القالب أدناه ، والذي يتضمن T7 المروج (5 ' من N₁₈) والمنطقة التكميلية (3 ' ن₁₈) للصلب إلى القلة المستمرة (1 ، 25): 5 '-تاتاكجاكتكاكتاتاج-n₁₈ -Gttttagagctagaaatagcaag-3 '
      ملاحظه: لا يتضمن تسلسل N₁₈ المتتالية المجاورة ل ngg protospacer عزر (بأم). لا تشمل هذا في قله العمر.
   6. تامر القلة المستمرة (الجدول 1) التي سيتم استخدامها لتوليف جميع sgRNAs ، قله المواليد لأهداف Sgrnas (الخطوة 5 ، 10) ، والإشعال PCR (الخطوة 1-1-4) كما القياسية القلة المحلية من خدمه إنتاج قله الكريات الدنيا. ويمكن ان يؤمر قله المواليد والإشعال PCR كمعيار القلة المحلية ، لا تنقيه اضافيه ضرورية.
2. تنفيذ التصميم الألى للأهداف sgRNA.
   1. باستخدام البيانات الجينية ، حدد جين هدف. ويمكن استخدام البيانات الناسخة بدلا من ذلك عندما تعرف الحدود exon/داخل. ويمكن تحديد الأهداف باستخدام بوابه EFISHGENOMICS (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). سيكون الهدف المثالي داخل اكسون 1 ؛ ومع ذلك ، الأخرى 5 ' الاكسون و 5 ' utr يمكن النظر فيها.
   2. وبمجرد التعرف علي التسلسل المستهدف ، يمكنك تحميل أداه ويب EFISHGENOMICS CRISPR المتاحة بحريه (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/). تستخدم أداه ويب هذه إصدار مخصص من خوارزميه crispor للجيل المستهدف^50،51.
   3. في المربع الخاص بالخطوة 1، ادخل اسم التسلسل وادخل تسلسل الهدف في المربع المناسب.
3. حدد الجينوم المناسب الذي يستمد التسلسل منه. في الحاضر ، تتوفر البيانات الجينية ل b. الكثيستييوس و b. gauderio. لا يلزم تسلسل الجينوم لاستخدام هذه الاداه ولكنها مفيده في تقييم الآثار غير المرغوب فيها المحتملة خارج الهدف.
4. حدد PAM المناسبة. ومن المستحسن 20 bp-NGG PAM, علي الرغم من ان هناك العديد من الزخارف بأم اضافيه للاختيار من بينها, اعتمادا علي البروتين كاس 9 المستخدمة.
5. سيتم إنشاء تقرير مع موقع تسلسل الهدف في الجينوم مع تسلسل الدليل المقترح. حدد ثلاثه أهداف مع انخفاض الآثار المتوقعة خارج الهدف ، ودرجات الدقة العالية ، ودرجات الكفاءة العالية. ويسلط الضوء علي اعلي تسلسل دليل التهديف مع الأخضر علي الجانب الأيسر. وينبغي تجنب الأصفر والأحمر تسلسل دليل المبرزة ، إذا كان ذلك ممكنا.
6. يؤدي النقر فوق التسلسلات المستهدفة المحددة إلى إنشاء تقرير CRISPOR شامل. والمعلومات الرئيسية المستمدة من هذه التقارير هي "التعبير الT7 في المختبر من تداخل القلة الكريات". من هذا التقرير ، استخراج المعلومات التالية: أوصت sgRNA oligos ، PCR الإشعال للموقع المستهدف ، والقلة المستمرة التي سيتم استخدامها لتوليف جميع Sgrna.
7. اطلب من مجموعه القلة المختارة (الخطوة 1.6) من خدمه إنتاج قله الكريات الوحيدة. ويمكن ان يؤمر قله المواليد والإشعال PCR كمعيار القلة المحلية ، لا تنقيه اضافيه ضرورية.

2. توليد sgRNA

1. اننيل اوليغمرات في أنبوب PCR: أضافه 1 μL من 100 ميكرومتر ثابته اوليغمير ، 1 μL من 100 μM sgRNA محدده القلة ، و 8 μL من النيوداز خاليه H₂س
2. اننيل اوليغمرات في ثيرموسيكلير مع البرنامج التالي: الحرارة في 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، بارده إلى 85 درجه مئوية في-2 درجه مئوية/ثانيه ، بارده إلى 25 درجه مئوية في 0.1 درجه مئوية/ثانيه ، وعقد في 4 درجه مئوية.
3. لتوليد قالب sgRNA ، أضافه 2.5 μL من المزيج dNTP (10 ملم) ، 2 μL من 10x العازلة ، 0.5 μL من الحمض النووي T4 ، و 5 μL من النيوداز خاليه H₂O إلى القلة الصلبة من الخطوة 2.2. احتضان لمده 20 دقيقه في 12 درجه مئوية.
4. تنقيه قالب باستخدام PCR تنظيف العمود في تعليمات الشركة المصنعة.
5. Elute في 20-30 μL. استخدام مقياس طيفي لتقدير التركيز والنقاء. يجب ان يكون القالب 100 – 200 نانوغرام/μL و 1.8-1.9 A_260/280.
6. تحقق من خلال هلام اجبرز عن طريق تشغيل 1-5 μL. يجب ان يكون النطاق المهيمن 120 bp. انظر الشكل 1 الف للاطلاع علي النتائج التمثيلية.
7. مخزن هلام التحقق من قالب sgRNA في-20 درجه مئوية (طويلة الأجل) أو 4 درجه مئوية (قصيرة الأجل ، 1-4 أسابيع).
8. نسخ sgRNA باستخدام T7 الحمض الريبي النيبالي النسخ عده من خلال أضافه إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL في درجه حرارة الغرفة 8 μL من المزيج dNTP (وحدات متساوية من دا ، dT ، dG ، dC) ، 2 μL من 10x العازلة (درجه حرارة الغرفة) ، 2 μL من T7 الحمض ، وخاليه من النيوداز H₂O إلى حجم إجمالي 20 μl. تدور لجمع في الجزء السفلي. احتضان لمده 2 – 4 ح عند 37 درجه مئوية.
9. أضافه 1 μL من DNase واحتضان 15 دقيقه اضافيه في 37 درجه مئوية.
   1. تنظيف sgRNA عن طريق أضافه 1 μL من الجليكوجين ، 30 μL من النيوداز خاليه H₂O ، 30 μl من 5 م خلات الأمونيوم و 180 μl من 100 ٪ etoh لكتب sgRNA. تخلط جيدا واحتضان ما لا يقل عن 20 دقيقه في-80 درجه مئوية (حتى المجمدة) أو في-20 درجه مئوية بين عشيه وضحيها. أجهزه الطرد المركزي في 4 درجه مئوية لمده 15 دقيقه في السرعة القصوى.
10. أزاله وتجاهل ماده طافي دون إزعاج بيليه ، ويغسل مع 1 مل من rnase خاليه 70 ٪ etoh المبردة في-20 درجه مئوية. تدور اضافيه 5 دقيقه في السرعة القصوى عند 4 درجه مئوية.
11. أزاله وتجاهل ماده طافي دون إزعاج بيليه ، والهواء الجاف بيليه لمده 5 دقائق.
12. أعاده التعليق في 30 μL من النيوداز-ح₂س وتحديد النقاء والغلة باستخدام الاشعه فوق البنفسجية الطيفي (الحد الأدنى لمحصول 200 Ng/μl).
13. تحقق من وجود sgRNA علي هلام خاليه من RNase. يظهر sgRNA بين 50 و 150 bp كنطاقين بسبب البنية الثانوية (الشكل 1B).
14. Aliquot إلى 3 μL وتخزين في-80 درجه مئوية.

3. التحقق من كفاءه القطع في المختبر

1. استخراج الحمض النووي الجيني من الأنواع المستهدفة باستخدام مجموعه استخراج الحمض النووي التجارية. يمكن استخدام قصاصات الزعنفة البطنية دون الحاجة إلى التضحية بالأسماك ، لان الانسجه يتم أعاده إنشائها.
2. تضخيم منطقه الحمض النووي الهدف باستخدام الإشعال مصممه كما هو موضح في الخطوات 1.6 و 1.7 باستخدام PCR القياسية. تحقق من المنتج عن طريق الكهربائي هلام. ويقترح تسلسل الجزء لضمان تضخيم المنطقة المناسبة ، ولكن ليس من الضروري. تظهر النتائج التمثيلية لقالب scn4aa في الشكل 2.
3. تنظيف جزء PCR مع المختبر الراسخ أو بروتوكول الشركة.
4. خزن الحمض النووي المضخم عند-20 درجه مئوية. النظر في فصلها إلى قسامات للحد من دورات تجميد الذوبان.
5. تحديد الكميات ووحدات التخزين المطلوبة لكل مكون. النظر في تشغيل عناصر التحكم السلبية (باستثناء اما sgRNA أو كاس 9) وعنصر تحكم إيجابي (sgRNA اختبارها سابقا ان يلتصق الهدف PCR تضخيم الحمض النووي) إذا كانت متاحه ، فضلا عن سلسله تركيز من sgRNA.
6. اعداد خليط التفاعل أدناه في الترتيب المحدد في أنبوب PCR في درجه حرارة الغرفة ، مضيفا sgRNA و كاس 9 البروتين الماضي للحصول علي أفضل النتائج: 50-100 نانوغرام من المنتج الحمض النووي PCR الهدف ، 1 μL من 10x العازلة 3 ، 1 μL من 10x بوسنيا (0.1 g/mL) ، 50-200 نانوغرام من البروتين كاس 9 (1 ملغ/مل ، 150 ng المقترحة) ، و 30-200 من نانوغرام sgRNA (100 ng المقترحة).
   1. احتضان رد الفعل في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة ثم في 65 درجه مئوية لمده 10 دقيقه لتعطيل بروتين كاس 9.
   2. تشغيل العينة بأكملها علي 2 ٪-3 ٪ هلام اجبرز (احجام الفرقة المتوقعة بين 30-200 bp) جنبا إلى جانب مع الضوابط الايجابيه والسلبية. الانقسام الناجح قد تظهر بعض المنتجات PCR ولكن سيكون أيضا اثنين من العصابات الصغيرة. وترد النتائج التمثيلية في الشكل 2.

4. الحصول علي الاجنه

ملاحظه: الحصول علي الاجنه من الأسماك الكهربائية ضعيف يمكن ان يكون تحديا. الرصد الدقيق لنوعيه المياه ، والوقت الكافي لرعاية الأسماك ، والتغذية العادية هي المفتاح لبرنامج تربيه ناجحه. يجب أولا ان تكون مشروطه الأسماك لعده أسابيع للاستنساخ⁵² كما هو موضح في الخطوة البروتوكول 4.1. وبعد ذلك ، يتم تقديم بروتوكول لزيادة التكتل الطبيعي (4.2) لاستخدامه في سلوك التفريخ الطبيعي (4.3) ، وهو بديل استحدث مؤخرا في المختبر للحصول علي الاجنه الموقوتة بدقه (4.4). البروتوكول 4.3 بنفس القدر من الفعالية ل b. الكثييسيوس و b. gauderio، وبروتوكول 4.4 متفوقة في b. gauderio.

1. تكييف
   1. الاحتفاظ بها في الأزواج/المجموعات الصغيرة (100-150 l دبابات) أو في خزانات كبيره جدا (2 الذكور و 5-6 الإناث في حوالي 475 لتر دبابة) ، لأنها تصبح عدوانيه جدا في ظل ظروف التكاثر. يجب ان يكون هناك علي الأقل 1-2 أنابيب PVC لكل سمكه لاستخدامها كملجا (الشكل 3 ا،ب).
   2. B. gauderio يمكن ان تربي في كثافة اعلي بكثير. الحفاظ علي ما يصل إلى ثمانيه افراد في خزان 100 L (2 الذكور و 6 الإناث). يجب ان يكون هناك علي الأقل 1 PVC أنبوب لكل سمكه لاستخدامها كملجا. أضافه خيوط متشابكة يزيد من التخصيب والاختباء البقع. أضافه أنابيب الطرد المركزي 50 mL مع ثقوب قطرها 1 سم حفر فيها إلى الأعلى من الخزان للسماح للبالغين تفرخ بشكل طبيعي في أنابيب (الشكل 3C).
   3. وخلال موسم التكاثر ، تغذي الديدان السوداء الطازجة اليومية التي تستكمل بالديدان الدموية المجمدة. يمكن إثراء الطعام بالفيتامينات والمكملات الغذائية ، إذا رغبت في ذلك.
   4. الأسماك المنزلية عاده في الموصليه عاليه نسبيا (300-600 μS) ، محلول متوازن pH. خلال موسم التكاثر ، وخفض تدريجيا الموصليه من قبل ما لا يقل عن نصف علي مدي 1-3 أسابيع للحث علي تجدد الغدد التناسلية والتفريخ. انخفاض الموصليه عن طريق الإضافات اليومية من التناضح العكسي (RO) المياه ، والحفاظ علي اهتمام وثيق لدرجه الحموضة عندما الموصليه منخفضه (pH < 6).
   5. ويمكن الحفاظ علي ظروف التكاثر لحوالي 3 − 5 أشهر مع تناقص إنتاج البيض مع مرور الوقت. بعد هذا الوقت ، وأعاده الأسماك إلى الموصليه العالية ببطء أكثر من 1-3 أسابيع. الحفاظ علي 3 أشهر أخرى في الموصليه عاليه قبل ان تتعرض لظروف التكاثر مره أخرى.
2. استخدام عامل التفريخ (SGnRHa + Domperidone) الحقن.
   1. تحديد الأسماك الانثويه في ظروف التكاثر التي تظهر بالفريك (الشكل 4). في b. gauderio سيكون الإناث تورم الغدد التناسلية فقط الذيليه إلى تنفيس. B. الإناث بالضغط الشديد سيكون لها بطون متورمة وتبدو جسديه عميقة (الشكل 4a). الذكور عموما ليس لديهم قضية إنتاج السائل المنوي. مهما, يفضل ذكران كبيره واجبه إلى الكبيرة عنبر حجم يجمع.
      ملاحظه: عامل التفريخ هو مزيج هرمون التجارية التي تسهل نضوج الامشاج وإحداثيات التفريخ. إذا تم حقن الأسماك مع عامل التفريخ في الماضي ، والسماح لمده > 4 أسابيع من الراحة والتغذية وافره بين الحقن. نقترح حقن ما لا يقل عن 2 ذكور و 4 – 5 إناث لضمان عدد قليل من براثن البيض والكثير من السائل المنوي.
   2. تخدير الأسماك في MS-222 (0.4 g/3 L) لبضع دقائق ، حتى الأسماك ليست قادره علي الحفاظ علي موقفها ، غير المتنقلة ، ولكن لا تزال لديها حركه المعامل (المرحلة الثانية⁵³).
   3. تزن الأسماك (ز) لحساب كميه عامل التفريخ ، (0.5 μL/g) + 0.5 μL. حسابات اضافيه 0.5 μL لأخطاء التنضيد.
   4. أضافه عامل التفريخ إلى وحدات تخزين 4x من العازلة (1x تلفزيوني أو DPBS) في أنبوب PCR وتخلط جيدا. سيصبح الحل غائما. فانه يساعد علي الاستغناء عن عامل التفريخ علي الحرارة ومن ثم استخدام ماصه لقياس الجرعة المحسوبة. عامل التفريخ لزج ، لذلك تاكد من الاستغناء عن الجرعة بأكملها وتوخي الحذر مع التنضيد.
   5. ماصه محلول الحقن علي الحرارة والتعادل في حقنه زجاجيه الدقة ، وتجنب فقاعات الهواء. ونحن نوصي 28 G ، 19-25 ملم طول ، ابره مشطوف.
   6. حقن المحلول في عضله الجذع الظهرية بمعدل سلس. دع الابره تجلس لمده 2 – 4 ثانيه ثم تزيلها. وضع الأسماك علي الفور في المياه نظام جديد للانتعاش.
   7. بعد حوالي 24 ح الاستعداد لجمع الاجنه (انظر 4.3 أو 4.4). جمع جميع المواد اللازمة بما في ذلك ما هو مطلوب لحقن الخلايا المجهرية واحده (انظر القسم 5).
3. الحصول علي الاجنه من خلال التفريخ الطبيعي.
   1. منزل عامل التفريخ-حقن البالغين (4.2) في خزانات كبيره 450 L. نسب الجنس الأكثر فعاليه وعاده ما كانت 1-2 الذكور و 3-4 الإناث مع أماكن اختباء كافيه مصنوعة من أنابيب PVC ، والركيزة من الرخام الداكن علي قاع الخزان لمنع استهلاك البيض. الرخام وعاده ما تكون أكثر اهميه ل b. بالضغط العالي من b. gauderio، الذي يفضل إيداع البيض لزجه في الشقوق أو 50 mL أنابيب الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
   2. ضع السمك في دوره الضوء العكسي لمطابقه التفريخ الليلي مع ساعات العمل المعملية العادية. باستخدام نظام أمن الصف المستهلك خارج الرف ، ومراقبه الأسماك باستخدام الاشعه تحت الحمراء الاضاءه للتقليل من الإزعاج من جهاز كمبيوتر متصل عن بعد (الشكل 3).
   3. وسوف تفرخ الأسماك تلقائيا خلال الضوء الداكن حوالي 24 ساعة بعد حقن عامل التفريخ.
   4. عند بدء التفريخ ، وجمع البيض كل ساعة في حين يحدث السلوك التفريخ. في b. بالضغط العضلي ، وجمع البيض باستخدام سيفون قطرها الصغيرة علي شبكه القطن غرامه صافي للحد من الاضرار التي لحقت البيض الطازجة. جمع البيض b. gauderio من أنابيب الطرد المركزي 50 mL أو خزان الركيزة. العمل بكفاءة مع الحد الأدنى من الإزعاج لتفريخ الأسماك باستخدام مصباح الراس مع ضوء احمر منخفض الكثافة. كما يحدث الانقسام الأول ما يقرب من 1 ح بعد الإخصاب (HPF) ، وجزء كبير من البيض تكون مناسبه لحقن ميكروخليه واحده.
   5. الشروع فورا في الحقن المجهري (انظر القسم 5).
4. ضغط الذكور للإخصاب في المختبر من b. gauderio.
   1. اعداد محلول السائل المنوي الموسع (SES) كما هو موضح في كتاب Zebrafish⁵⁴: 10 مم hepes ، 80 Mm kcl ، 45 mm كلوريد الصوديوم ، 45 mm خلات البوتاسيوم ، 0.4 Mm cacl₂، و 0.2 مم mgcl₂.
      1. استخدام ddH₂O لجلب إلى حجم وضبط درجه الحموضة إلى 7.7 مع 1 م naoh.
      2. يحفظ في الثلاجة.
      3. فلتر من خلال فلتر 0.22 μm قبل الاستخدام.
   2. تخدير الأسماك في MS-222 (0.4 g/3 L) لبضع دقائق ، حتى الأسماك ليست قادره علي الحفاظ علي موقفها ، غير المتنقلة ، ولكن لا تزال لديها حركه المعامل (المرحلة الثانية⁵³). ضع 500 μL علي الارصفه من SES في الجليد.
   3. تجفيف اليدين والأسماك جيدا ، وخصوصا حول الراس وتنفيس. وضع الجانب البطني حتى ، الامامي إلى اليسار (للافراد اليمين) في رغوة البوليسترين/حامل الإسفنج مغطاه في 222 MS--الرطب ، منشفه مبلله ورقه. وينبغي ان يكون الراس موازيا للجدول قدر الإمكان.
      ملاحظه: الخطوات 4.4.4 – 4.4.6 يجب ان يتم في أسرع وقت ممكن, والأسماك يجب ان تكون فقط من الماء لمده 30-60 s.
   4. تطبيق الضغط في الذيليه إلى اتجاه منقاري مع الضغط الخفيف الوسيط علي الغدد التناسلية نحو تنفيس. قد تطرد الأسماك النفايات. كن حذرا لتنظيف تنفيس مع مسح مهمة حساسة إذا تم طرد اي النفايات. لا تجمع النفايات مع السائل المنوي. اعتمادا علي حجم الذكور ، 10-60 μL هو شائع.
   5. باستخدام الأنابيب الصغيرة مع طرف ، وجمع بعناية السائل المنوي كما انها تقلص من الذكور في الزيادات 50 μL. وضع السائل المنوي مباشره في 500 μL الطحالب المجهرية من SES علي الجليد. قد يكون من المفيد ان يساعد باحث آخر في جمع المني بينما يضغط الآخرين. يجب استخدام السائل المنوي في أقرب وقت ممكن ، ولكن يبقي قابلا للحياة لمده 1 ساعة علي الأقل.
   6. مباشره بعد جمع ، ووضع الأسماك في المياه نظام جديد للانتعاش. يجب ان تكون الأسماك فقط من الماء لمده 30-60 s.
5. ضغط الإناث للإخصاب في المختبر من b. gauderio.
   1. تخدير الأسماك في MS-222 (0.4 g/3 L) لبضع دقائق ، حتى الأسماك ليست قادره علي الحفاظ علي موقفها ، غير المتنقلة ، ولكن لا تزال لديها حركه المعامل (المرحلة الثانية⁵³). ضع ورقه بوليتترافلوروثيني علي محطه العمل.
      ملاحظه: الأقسام 4.5.1 – 4.5.5 ينبغي ان يتم في أسرع وقت ممكن والأسماك يجب ان تكون فقط من الماء لمده 30-60 s.
   2. جفاف اليدين ، والاداات ، ورقه بوليتترافلوروثيني ، والأسماك جيدا ، وخصوصا حول الراس وتنفيس. ضعها علي الجانب الامامي مع الراس الاماميه (للافراد الأيمن).
   3. تطبيق الضغط في الذيليه إلى اتجاه منقاري مع الضغط الخفيف الوسيط علي الغدد التناسلية نحو تنفيس. قد تطرد الأسماك النفايات. كن حذرا لتنظيف تنفيس مع مسح مهمة حساسة إذا تم طرد اي النفايات. اعتمادا علي حجم الأسماك ، 20-150 البيض هو شائع. باستخدام ملعقة المغلفة بوليتترافلوروثيني/أداه بعناية جمع البيض كما انها تقلص من cloaca. انقل البيض بسرعة إلى طبق بتري صغير وغطه. تاكد من بقاء البيض جافا خلال هذه العملية. بدلا من ذلك ، بعد الضغط ، لمس كتله البيض إلى قاعده طبق بيتري صغير أو إلى ورقه بوليتترافلوروثيني كما يتم طردهم من الإناث.
   4. مباشره بعد جمع ، ووضع الأسماك في المياه نظام جديد للانتعاش.
6. أداء الإخصاب البيض للإخصاب في المختبر من b. gauderio.
   1. أضافه 100 μL من السائل المنوي مختلطة جيدا في SES (انظر الخطوة 4.4) مباشره علي كتله البيض.
   2. أضف 1 مل من مياه النظام (المصفاة من خلال فلتر 0.22 μm) واخلط جيدا لمده 30 – 60 ثانيه.
   3. أضافه 1-2 المياه نظام mL اضافيه (ترك بعض المساحة في طبق بيتري) ووضع في حاضنه. وقت قياسي من التلقيح الاصطناعي علي طبق بيتري والانتقال إلى حاضنه 29 درجه مئوية. تعيين المؤقت 50 دقيقه للتحقق من التقدم في التنمية (علي سبيل المثال ، تشكيل خليه واحده في قطب الحيوانية ، انظر الشكل 6). خلال هذا الوقت ، واعداد المواد للحقن المجهري.

5. خليه واحده ميكروحقن

1. سحب ابر الحقن المجهري قبل حقن عامل التفريخ (الخطوة 4.2) أو التفريخ الطبيعي (الخطوة 4.3). استخدام الشعرية الزجاج بوروسيليكات مع خيوط (متعاطي 1.0 mm ، والهوية 0.58 ملم ، طول 10 سم) وساحبه ابره لسحب ابر حقن مجهريه. اعداد 2 – 4 ابر لكل حقن العلاج المخطط لها.
   ملاحظه: ويفضل الابر تحميل الخلفية مع خيوط ، لان خيوط فتائل الحل نحو غيض ويزيل فقاعات. ومع ذلك ، يمكن استخدام الابر دون خيوط والتحميل الامامي يجب ان يكون اي تاثير علي النتيجة. يجب ان يكون الابره طويلة ، ولكن تفتق قوي. استخدام ابره سحب البرنامج مع المواصفات التالية كنقطه انطلاق: الحرارة = 500 ؛ سحب = 70; السرعة = 70 ؛ والوقت = 100. ويرد في الشكل 5 الفالتمثيل الشكلي لابره.
2. اعداد محلول الحقن واعداد الابره.
   1. أضافه 0.9 μL من sgRNA و 0.9 μL من انزيم كاس 9 (1 مغ/مل) إلى 0.2 μL من 10 ٪ أو 100 ٪ الفينول الأحمر (ل 1 ٪ و 10 ٪ تركيز الفينول الأحمر النهائي ، علي التوالي) في أنبوب PCR. تخلط جيدا والسماح الجلوس علي الجليد 2 − 5 دقيقه للسماح sgRNA و كاس 9 إلى المعقدة. حساب التركيز النهائي من sgRNA ، كاس 9 ، والفينول الأحمر في محلول الحقن.
      ملاحظه: إذا كان هناك مشاكل مع انسداد ابره أو قطع الكفاءة باستخدام وصفه أعلاه ، قد يكون من المفيد استخدام 1x التركيز النهائي الملح/العازلة مزيج لتحقيق الاستقرار كاس 9 ومنع انسداد ابره.
   2. استخدم طرف ماصه ميكرولودر لتحميل المحلول إلى 2 μL في ابره الحقن المجهري. طرد السائل بالقرب من الطرف قدر الإمكان.
   3. تحميل ابره في الجزئي وضبط إعدادات الضغط (تبدا مع 775 p_i، 0.1 − 0.2 s ، و 8-12 p_c).
   4. تحت النطاق ، استخدم زوج من الملقط الناعم لكسر طرف الابره بزاوية مشطوفة. كسر نحو حيث تفتق من الابره يبدا في الصلابة. فمن الأفضل لكسر أقرب إلى غيض ، واختبار حجم محلول الحقن ومن ثم كسر مزيد من الوقت إذا لزم الأمر. وينبغي ان تظل تتحمل الابره صغيره قدر الإمكان مع الحفاظ علي تفتق جامده (الشكل 5A).
   5. استخدام الزيوت المعدنية وميكرومتر لقياس حجم محلول الحقن. 1 – 2 يتم استخدام nL عاده; 0.1 ملم قطرها هو 0.5 nL.
   6. ضبط طرف الابره أو إعدادات الضغط للحصول علي حجم الحقن ضمن المواصفات.
3. تحديد النامية تخليق ملقح واعداد مرحله الحقن. اعداد مرحله الحقن. خذ طبق بيتري قطر 100 ملم. عكس أسفل ومكان تحت الأعلى مقلوب. وضع شريحة المجهر الزجاجي داخل الأعلى المقلوب. اعتمادا علي كيفيه تحميل المفصلة الخاصة بك إلى النطاق ، قد يكون الارتفاع المضاف من القاعدة المقلوبة غير ضروري.
   1. ننظر إلى البيض النامية وتحديد المخصبة المفترضة تخليق ملقح 50-60 دقيقه بعد التلقيح الاصطناعي. وسوف تبدا القطب الحيواني لتشكيل وسوف يكون هناك فائض من قطرات الدهون الصغيرة حول الصفار/الحيوانية واجهه الخلية (الشكل 6).
   2. جمع 10-20 بيضه مع اقل قدر ممكن من الماء باستخدام ماصه نقل البلاستيك (قطع غيض قليلا للسماح البيض لتمرير) ووضع علي حافه الشريحة. وسوف يكون الماء الأشرار تحت الشريحة وسحب البيض ضد الحافة.
   3. استخدم مسح المهمة الحساسة واضغط برفق علي الشريحة لأزاله الماء الزائد والسماح للبيض بالتصاق بقوة بحافه الشريحة. يجب ان يكون هناك ما يكفي من الماء فقط للحفاظ علي البيض رطبه مع الحفاظ علي القليل من الرطوبة الدائمة لتجنب حركه البيض اثناء الحقن.
4. حقن مباشره في خليه واحده.
   1. محاذاة البيض ضد الشريحة عموديا ، عمودي علي الابره تقترب (الشكل 5B).
   2. باستخدام الجزئي ، وضع الابره ضد chorion. في تقريبا 45 درجه زاوية ، ادراج الابره في chorion ، ومن ثم في خليه واحده. يمكن ان يكون مفيدا لدخول خليه واحده من خلال صفار البيض. نقل كل من مرحله الحقن مع اليد الحرة والجزئية قد توفر المزيد من السيطرة علي عمليه الحقن (الشكل 5 ب).
   3. حقن sgRNA/كاس 9/الفينول الحل الأحمر في خليه واحده. أزاله الابره بعناية. انتقل إلى البيضة التالية وكرر الخطوات 5.4.1 – 5.4.3 حتى يتم حقن جميع البيض.
   4. أزاله اي البيض مكسوره اثناء الحقن مع ملقط غرامه. استخدام 0.22 μm من المياه نظام تصفيتها في زجاجه بخ لأزاله البيض بلطف من مرحله الحقن إلى جديد 100 مم طبق بيتري القطر.
   5. كرر الخطوات 5.3.3 – 5.4.6 حتى يتم حقن جميع البيض أو طورت إلى مرحله الخليتين. احرص علي وضع حوالي 20 بيضه مخصبه مفترضه كعنصر تحكم بدون حقن لتحديد معدلات الإخصاب ونجاح الحقن. للحصول علي براثن أكبر استخدام الاجنه غير المحقونة التي تطورت إلى مرحله الخليتين ، النسبة براثن أصغر وضع جانبا البيض المخصب المفترض.
   6. بالاضافه إلى ذلك ، النظر في sgRNA/حقن التحكم عن طريق حقن 15-25 الاجنه مع كاس 9 معقده مع sgRNA ضد الجينات التي ليست موجودة في الجينوم. واوصي جين GFP لأجنه من النوع البري. تسجيل عدد من البيض والاباء والأمهات والتلقيح الاصطناعي الوقت ، والتاريخ علي كل طبق بيتري. تضمين sgRNA الهدف أو التسمية كما غير المحقونة. الانتقال إلى حاضنه 29 درجه مئوية.

6. تربيه المواشي

1. اعتني بالبيض
   1. التحقق من سلامه البيض 4 – 6 ساعات بعد الحقن.
   2. تسجيل عدد من البيض الميت ، فضلا عن اي التي هي غير المخصبة. سيعتقل البيض غير المخصب حول المرحلة الثمانية للخلايا ويكون له نمط من الخلايا في قطب الماشية (الشكل 6). اعتمادا علي عدد من البيض الميت وكميه من الحطام البيض في الماء ، وأزاله ما لا يقل عن 50 ٪-80 ٪ من المياه واستبدال مع نظام تنقيه المياه. يمكن ان يكون من المفيد فرك الجزء السفلي من طبق بيتري إذا كان فيلم الحطام الخلوي أو اشكال بيوفيلم.
   3. للأيام التالية 2 – 3 ، افحص البيض 1 – 2 × يوميا. كرر الخطوات 6.1.2 – 6.1.3 في كل مره يتم فيها فحص البويضات.
   4. بعد 2 − 3 أيام سوف يفقس اليرقات. أزاله جميع أغلفه البيض لأنها يفقس. يمكن ان تساعد الأنابيب اللطيفة علي تحرير اليرقات نصف الفقس.
2. رعاية اليرقات.
   1. افحص البيض 1 − 2x يوميا. كرر الخطوات 6.1.2 – 6.1.3 في كل مره يتم فيها فحص اليرقات.
   2. من 6 – 14 DPF ، أطعم الخل الثعابين إلى اليرقات. فائض طفيف من الطعام جيد ، لان ثعابين الخل سوف تبقي علي قيد الحياة في الطبق. أضافه الخل الثعابين في كل مره يتم فحص الطبق وتنظيفها.
   3. من 11 – 14 DPF ، أضافه 5-10 الطازجة فقست Artemia لكل اليرقات بالاضافه إلى الخل الثعابين. خلال هذا الوقت سوف تتعلم اليرقات للأكل السباحة الحرة Artemia.
   4. في 15 DPF ، نقل اليرقات إلى أكواب البيض (انظر القسم 6.2.5) في خزان مع المياه المتدفقة ، والترشيح ، والتهوية. ولا ينبغي ان يكون هناك أكثر من 25 مضغه لكل كوب. أكواب البيض هي أكواب بلاستيكية مع شبكه المعاوضه في الجزء السفلي. ويمكن أضافه طبق بتري 100 mm اعلي/أسفل إلى الجزء السفلي من كاس البيض للمساعدة في وقف الطعام من السقوط من خلال شبكه. أكواب البيض تسمح للأسماك ان تكون في حجم أكبر من المياه لأسباب نوعيه المياه ، مع الحفاظ علي مجموعات منفصلة. استمري في أضافه كل من ثعابين الخل و 15 − 30 من الفقس الطازج لكل يرقه من الأيام 15 – 18. نظيفه طبق بيتري قطعه يوميا واستخدام ماصه لأزاله الجماهير من Artemiaالقتلى.
   5. من الأيام من 18 إلى 30 ، أطعم فقط الطازجة الفقس Artemia. زيادة كميه التغذية كما ينمو السمك وإذا كان ينظر العض الذيل.
   6. بعد ما يقرب من 30 يوما ، نقل الأسماك إلى 10 لتر (2.5 غالون) الدبابات ، ما يقرب من 25 فردا لكل دبابة. تاكد من وجود الترشيح ، والتهوية ، وأماكن للاختباء. النظر في وسائط الترشيح البيولوجي أسطواني وأنابيب PVC قطرها صغيره.
   7. تغذيه الطازجة فقست Artemia والديدان السوداء من حوالي 30-45 يوما فصاعدا. الحفاظ علي التنظيف القياسي وتغيير المياه للدبابات (اي ، علي الأقل ~ 10 ٪-20 ٪ تغيير المياه لكل 1 أسبوع).
   8. بعد ~ 45 DPF ، تغذيه فقط الديدان السوداء حتى ~ 60 DPF.
   9. بعد ~ 60 DPF ، تحرك الأفواج من حوالي 15 سمكه إلى 40 لتر (10 غالون) الدبابات والبدء في إجراءات تربيه الكبار. أضافه أنابيب PVC والغزل "ممسحة" (كتله من الغزول البني مرتبطة معا حول الفلين) لإخفاء الأماكن (الشكل 3C). يجب ان تقترب الأسماك من حجم التكاثر (من 10 − 12 سم) بعد الإخصاب بعد 3 − 4 أشهر تقريبا.

7. تربيه الكبار

1. إطعام الأسماك يوميا مع ما يكفي من الديدان السوداء بحيث كميه صغيره من الديدان السوداء موجودة في التغذية القادمة. هذا التغذية الاعلانيه يسمح النمو القصوى.
2. بضع مرات في الأسبوع ، يمكن ان يكون من المفيد تكمله الدودة السوداء التغذية مع الديدان الدموية.
3. خزانات نظيفه كل 2-4 أسابيع مع 20 ٪-30 ٪ تغيير المياه. إذا كان الغزل الممسحة يحصل الكامل من بيوفيلم/الطحالب ، فرك نظيفه تحت الماء RO.

تم تحديد المواقع المستهدفة sgrna ضمن اكسون 1 من scn4aa في كل من b. gauderio و b. بالضغط الموضعي كما هو موضح في القسم 1. تم إنشاء sgRNAs كما هو موضح في القسم 2. بعد نجاح sgRNA الاختيار والتوليف (الشكل 1) ، تم اختبار الانقسام في المختبر (الشكل 2). وبعد ذلك تم اختيار ال sgRNAs التي تظهر في القطع الأنبوبي للحقن المجهري للخلايا الواحدة.

وكانت الأسماك البالغة مشروطه بالإنجاب (القسم 4.1) ، ثم تم حقنها بعامل تفريخ (القسم 4.2) ثم تقلصت (b. gauderio) لأغراض التلقيح الاصطناعي كما هو موصوف في القسم 4.4 أو سمح لها بالتكاثر بصوره طبيعيه (b. العضائيه) موصوفه في القسم 4.3. وأسفرت هذه الجهود عن أجنه أحاديه الخلية للحقن المجهري في كلا النوعين. كما هو موضح في القسم 5, 1.5 − 2.0 nL من scn4aa Sgrna/كاس 9/الفينول المركب الأحمر (65-190 Ng/Ul sgrna, 450 Ng/ul كاس 9, 1% − 10% الفينول الأحمر, التركيزات النهائية) تم حقن في مرحله خليه واحده. واستخدمت البيض من مخلب نفس الضوابط غير المحقونة. وتمت رعاية جميع الاجنه علي النحو الموصوف في المادة 6. بعد التلقيح الاصطناعي ، 40 ٪-90 ٪ من البويضات تم تخصيبها ، و 70 ٪-90 ٪ من الاجنه نجا إلى الفقس بعد الحقن.

نجا حوالي 75% من الأسماك إلى 6 − 11 DPF وكانت بعد ذلك التنميط الظاهري. ووضعت الأسماك larval في صحن بيتري 35 مم جزءا لا يتجزا من طبق أكبر مع الأقطاب الكهربائية التي تم حشدها Ag/Cl تسجيل (الشكل 7A). وكانت حركه الاجنه مقيده باستخدام 3% من القوالب المصنوعة من مياه النظام وقطعها لتناسب الجنين (الشكل 7 ب). واستخدمت غرفه التسجيل نفسها لكلا النوعين واستخدم نفس القالب الذي نشا في المقارنات بين الأنواع. وقد سجلت الاجنه في 60 s ، وهو ما يكفي للتقاط مئات المواد المستنفدة للأوزون. تم اختيار عناصر التحكم في العمر والحجم المتطابقة غير المحقونة للمقارنة. في هذه النقطة الزمنيه ، 10 ٪-30 ٪ من الاجنه علي قيد البقاء تظهر انخفاض سعة التخلص من الذخائر المتفجرة. وتم هضم الاجنه التي تظهر انخفاضا في سعة التخلص من الذخائر المتفجرة بدون عيوب شكليه واضحة والسيطرة علي الاجنه الكاملة غير المحقونة لاستخراج الحمض النووي وما تلاه من PCR لموقع scn4aa المستهدف. كان هناك في كثير من الأحيان مجموعه من الاختراق من النمط الظاهري ، مع بعض الافراد الذين لديهم انخفاض اقوي في سعة التخلص من الذخائر المتفجرة من غيرها.

بعد [بكر] ينظف ويستنسخ, انتقيت 30 + يستنسخ من كل جنين كان ل [سنجر] تسلسل. تم التعرف علي الطفرات المستحثة CRISPR/كاس 9 في b. gauderio (الشكل 8a،b) و b. الكثييسيوس (الشكل 9 ا،ب) الافراد الذين لديهم تخفيض كبير في سعة التخلص من الذخائر المتفجرة (الشكل8a والشكل 9a ، علي التوالي) ، حيث كانت الضوابط غير المحقونة تشير فقط إلى الأنماط الجينية. التصور من السعه التخلص من الذخائر المتفجرة بين المسوخ المؤكدة ("CRISPR") والعمر/حجم مطابقه الضوابط غير المحقونة أظهرت ان كلا scn4aa متحول b. الشكل10a) و b. Gauderio (الشكل 10a ) كانت الاجنه اقل بكثير سعة التخلص من الذخائر المتفجرة من الضوابط (p < 2.2 x 10-16، ويلش العينتين t-اختبار). وكان استهداف CRISPR/كاس 9 من scn4aa ناجحا في كل من b. بالضغط الحراري و b. gauderio وتوريط scn4aa في التفريغ الكهربي المبكر في اليرقات في كلا النوعين.

الشكل 1: توليف قالب sgRNA والنسخ. (ا) صوره هلام من قالب sgRNA التوليف. تتطابق التسميات مع sgRNAs مختلفه ل myod (MYO2 ، MYO1) وثلاثه sgrnas ل scn4aa (S1 − S3). بعد الصلب الاوليغمرات ، ويتم إنتاج ~ 120 bp قالب. (B) صوره هلام من النسخ sgRNA لمده ثلاثه Sgrna ل b. gauderio (bg2017) واثنين ل b. الضغط الموضعي (bb2016 ، 2017). سيظهر sgRNA كنطاقين بسبب البنية الثانوية سيكون بين 50 − 150 bp عند استخدام سلم dsDNA. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صوره الهلام التمثيلي الناجحة (sg1) والفاشلة (sg2) في اختبارات CRISPR المختبرية. يتم عرض كميه مكافئه من قالب بدون مكونات CRISPR في حاره scn4aa. لاحظ النطاقات المكررة في sg1 التي تظهر ان القطع قد حدث. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تربيه الاجهزه دبابات للأسماك الكهربائية ضعيف. (ا) تخطيطي للاعداد النموذجي لمراقبه الفيديو لاسلكيه لسلوك التفريخ. وتهدف ثلاث كاميرات CCTV المتاحة تجاريا (سوان ، وشركه) قادره علي إنتاج ضوء الاشعه تحت الحمراء في الأعلى من الماء ومتصلا مسجل فيديو رقمي (DVR). يتم مراقبه الفيديو في الوقت الحقيقي لسلوك التفريخ في غرفه مجاوره من جهاز كمبيوتر متصل بالشبكة (PC). (B) سلوك التفريخ الملتقط بمثل هذا الاعداد في b. الضغط الموضعي. (ج) اعداد تربيه نموذجيه ل b. gauderio مع أنابيب الاختباء PVC و mops الغزل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تربيه الذكور والإناث. (ا) باء-الضغط الموضعي (ب) ب. كلا النوعين هي الجنسية وتمييزها بسهوله بصريا عندما تنضج جنسيا. كل من الإناث هي البيض في هذه الصور ، وعرض البطون تورم بشكل مميز التي هي كامله من البيض الناضجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: الحقن المجهري. (ا) يجب كسر الزجاج نصائح ابره شعريه لتقديم حجم الحقن المجهري المناسبة. الطرف علي اليسار غير منقطع. يتم كسر النصائح المتوسطة واليمني مع شطبه الزاوية قليلا ليخترق chorion البيض. (B) واصطف البيض ضد شريحة زجاجيه (1 ٪-10 ٪ الفينول الأحمر هو المدرجة كمتتبع لتصور تسليم الحقن) وحقن مع الابر الشعرية الزجاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: مراحل النمو. (ا) ب. غوديريو و (ب) ب. ويفترض كل البيض المخصبة ويتم رصد التنمية إلى 24 HPF. بين 12-24 الاجنه HPF مرئية في البيض قابله للحياة ، والا البيض معرضا للتدهور. ويبدو ان العديد من الانقسامات تجري علي تنشيط البويضة ، بغض الآخر عن الإخصاب. البيض غير المخصبة تظهر أنماط غير عادية من الانقسام التي هي أكثر متناظرة بكثير في البيض المخصب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: صوره غرفه تسجيل يرقات المستخدمة في هذه الدراسة. (ا) يتم تضمين الأقطاب الكهربائية داخل sylguard ولكن تمتد إلى الصحن 35mm التي تحتوي علي الجنين مقيده عن طريق العفن 3 ٪ اغبرزت. (ب) صوره اعلي للتكبير تسلط الضوء علي حركه الجنين المقيدة بسبب الاجنه. لاحظ القطع التي يمكن ازالتها كما يتغير حجم الجنين. B. الجنين gauderio يواجه القطب الموجبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: الطفرات المستحثة من CRISPR/كاس 9 في b. gauderio. (ا) 32 تسلسل استنساخ من الحمض النووي الجيني للتحولات المستحثة بكاس 9 في scn4aa واحده مستهدفه من الاجنه من طراز F0b. gauderio (11 dpf). يتم تسطير التسلسل المرجعي مع الموقع الهدف sgRNA المميز باللون الرمادي ، وهو التسلسل الذي تم تمييزه بالأحمر ، والذي تم إبرازه في العلامة الحمراء ، وموقع القطع كاس 9 المميز ب "|". يتم إعطاء التغيير من تسلسل النوع البري المتوقع ويتم إعطاء عدد النسخ المستنسخة لكل تسلسل بين قوسين. (الاختصارات: + = الادراج ،-= الحذف ، ± = indel) يتم bolded اي تشابه تسلسل المقترنة غير CRISPR. الشكل علي غرار ما بعد Jao وآخرون60. (B)وتنباتسلسل الأحماض الامينيه من المستنسخين متسلسلة من scn4aa ضربه قاضيه b. gauderio من (A). يتم تمييز التغييرات المستحثة كاس 9 من تسلسل النوع البري باللون الأحمر ويتم إعطاء رقم التغيير المستحث بالنواة. (ج) التسجيلات الكهربائية الثانية والعشرون من خمس يرقات متطابقة الحجم ، سجلت جميعها 6 من الفئة dpf في نفس غرفه التسجيل. إعدادات الكسب متطابقة لكل الآثار. اثار باللون الأحمر هي من اليرقات b. gauderio مع الطفرات المؤكدة (فرد واحد يظهر في الشكل 8a، b أعلاه) ، اثار باللون الأسود هي من اليرقات b. gauderio غير المحقونة. وبشكل عام ، أظهرت التحرير CRISPR/كاس 9 من scn4aa انخفاض في سعة التخلص من الذخائر المتفجرة ، علي الرغم من ان التاثير كان غير متجانسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: الطفرات المستحثة من CRISPR/كاس 9 في b. الضغط الموضعي. (ا) 42 سلسله استنساخ من الحمض النووي الجيني للتحولات المستحثة كاس 9 في scn4aa واحده مستهدفه من الاجنه من طراز F0b. العضدي (11 dpf). يتم تسطير التسلسل المرجعي مع الموقع الهدف sgRNA المميز باللون الرمادي ، وهو التسلسل الذي تم تمييزه بالأحمر ، والذي تم إبرازه في العلامة الحمراء ، وموقع القطع كاس 9 المميز ب "|". يتم إعطاء التغيير من تسلسل النوع البري المتوقع ويتم إعطاء عدد النسخ المستنسخة لكل تسلسل بين قوسين. (الاختصارات: + = الادراج ،-= الحذف ، ± = indel) يتم bolded اي تشابه تسلسل المقترنة غير CRISPR. الشكل علي غرار ما بعد Jao وآخرون60. (B)وتنباتسلسل الأحماض الامينيه من المستنسخين متسلسلة من scn4aa ضربه قاضيه ب. يتم تمييز التغييرات الناجمة عن كاس 9 من تسلسل النوع البري باللون الأحمر ويتم إعطاء رقم التغيير المستحث النيوكليوتيد. (ج) عشر تسجيلات كهربائيه ثانيه من أربع يرقات متطابقة الحجم ، سجلت جميعها 10 منها في نفس غرفه التسجيل. إعدادات الكسب متطابقة لكل الآثار. الآثار باللون الأحمر هي من اليرقات b. بالضغط العالي مع الطفرات المؤكدة (فرد واحد يظهر في A، b أعلاه) ، والآثار باللون الأسود هي من اليرقات الغير محقونة ب. وبشكل عام ، أظهرت التحرير CRISPR/كاس 9 من scn4aa انخفاض في سعة التخلص من الذخائر المتفجرة ، علي الرغم من ان التاثير كان غير متجانسة. والمواد المستنفدة للأوزون المقلوبة هي من الاتجاه المتغير للأسماك اثناء التسجيل. لا يوجد فرق بين الأسماك التجريبية والضوابط علي الرغم من هذا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: قطع مربعه متوسط سعة التخلص من الذخائر المتفجرة من CRISPR والحجم غير المحقون/العمر المتطابق مع الاشقاء. (ا) سعة التخلص من الذخائر المتفجرة ليرقات ب. سجلت مع مكسب من 100 ، CRISPR n = 56 EODs من شخصين ، غير المحقونة ن = 114 EODs من ثلاثه افراد. (ب) سعة التخلص من الذخائر المتفجرة ليرقات b. gauderio في 6 dpf. سجلت مع مكسب من 500 ، CRISPR n = 34 EODs من شخصين ، غير المحقونة ن = 148 EODs من ثلاثه افراد. وكان السعه من الأسماك CRISPR اقل بكثير من الضوابط غير المحقونة (p < 2.2 x 10-16، ويلش نموذجين t-اختبار). وتم تسجيل جميع الافراد في غرفه التسجيل الموصوفة في الشكل 7. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قله الكريات الوحيدة اللازمة للبروتوكول.

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.