هنا ، يتم تقديم بروتوكول لإنتاج والخلفية CRISPR/كاس 9 الجينوم الأسماك الكهربائية ضربه قاضيه. المبينة بالتفصيل هي البيولوجيا الجزيئية المطلوبة ، وتربيه ، ومتطلبات تربيه لكل من عاريه القدمين والفطريات ، وتقنيات الحقن لإنتاج كاس 9 المستحثة اليرقات F0 .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إسكات شراره: CRISPR/كاس 9 الجينوم التحرير في الأسماك الكهربائية ضعيف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. هناك درجه مذهله من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المشتقة بشكل مستقل ، والتي تشترك في الهندسة الوراثية المشتركة. ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست التوثيق التي تنتج والكشف عن المجالات الكهربائية الضعيفة وتسمي الأسماك الكهربائية ضئيله. في السنوات 50 منذ اكتشاف ان الأسماك الكهربائية ضعيف استخدام الكهرباء للشعور محيطها والتواصل ، وقد اكتسبت مجتمع متنام من العلماء رؤى هائله في تطور التنمية والنظم والدوائر علم الأعصاب ، فسيولوجيا الخلوية ، والإيكولوجيا ، والبيولوجيا التطورية ، والسلوك. وفي الاونه الاخيره ، كان هناك تكاثر في الموارد الجينية للأسماك الكهربائية. وقد يسر استخدام هذه الموارد بالفعل رؤى هامه فيما يتعلق بالصلة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في هذه الأنواع. ومن العقبات الرئيسية التي تحول دون دمج بيانات الجينوم مع البيانات الظاهرية للأسماك الكهربائية الضعيفة نقص حالي في أدوات الجينوم الوظيفية. نحن الإبلاغ هنا بروتوكول كامل لأداء CRISPR/كاس 9 الطفرات التي تستخدم أليات إصلاح الحمض النووي الذاتية في الأسماك الكهربائية ضعيف. ونحن نثبت ان هذا البروتوكول هو نفس القدر من الفعالية في كل من الأنواع القنوميه بالضغط البري والضرب بالضغط العضلي الخاص gauderio باستخدام crispr/كاس 9 لاستهداف indels ونقطه الطفرات في اكسون الأول من قناه الصوديوم الجينات scn4aa. باستخدام هذا البروتوكول ، تم الحصول علي الاجنه من كلا النوعين والتنميط الجيني للتاكد من ان الطفرات المتوقعة في أول اكسون من قناه الصوديوم scn4aa كانت موجودة. تم تاكيد النمط الظاهري نجاح ضربه الخروج مع التسجيلات التي تظهر انخفاض الجهاز الكهربائية التفريغ السعه بالمقارنة مع الضوابط المتطابقة حجم غير المحقونة.
المقدمة
وقد تغيرت الكهرباء والتوليد الكهربائي في التاريخ التطوري من الفقاريات. اثنين من السلالات من الأسماك تيليوست ، العظم العظمي و siluriformes ، تطورت الكهربي في موازاة ذلك ، وخمسه السلالات من تيليوستس (جينوتيفورسيس ، mormyrids ، والأجناس astroscopus، مالتراوروس ، والزليلي) تطورت الكهربية بالتوازي. هناك درجه ضرب من التقارب في هذه الأنماط الظاهرية المستمدة بشكل مستقل ، والتي تشترك في العمارة الوراثية المشتركة1،2،3.
ولعل هذا هو أفضل مثال من قبل العديد من الميزات المتقاربة من عاريات والmormyrids ، وهما الأنواع الغنية تيليست clade....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعه ولاية ميشيغان.
1. تحديد أهداف sgRNA
ملاحظه: يتم توفير بروتوكول للتصميم اليدوي من sgRNAs في الخطوة 1.1. وقد استخدم هذا لاختيار الهدف scn4aa . ويتم توفير بروتوكول إضافي لتيسير هذه العملية (الخطوة 1.2) باستخدام بوابه الويب الخاصة ب EFISHGENOMICS. ومن المستحسن ان المستخدمين تحديد بروتوكول 1.2 ، الذي يتميز العديد من "الشيكات" الألى لضمان النجاح في تصميم sgRNAs للأهداف المخصصة.
- تصميم أهداف sgRNA.
- لتوليد sgrna دليل oligos ، فمن الأفضل لاستهداف اكسون 1 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تحديد المواقع المستهدفة sgrna ضمن اكسون 1 من scn4aa في كل من b. gauderio و b. بالضغط الموضعي كما هو موضح في القسم 1. تم إنشاء sgRNAs كما هو موضح في القسم 2. بعد نجاح sgRNA الاختيار والتوليف (الشكل 1) ، تم اختبار الانقسام في المختبر (الشكل 2). وبعد ذلك تم اختيار ال sgRNAs التي تظهر في القطع الأنبوبي للحقن المجهري للخلايا الواحدة.
وكانت الأسماك البالغة مشروطه بالإنجاب (القسم 4.1) ، ثم تم حقنها بعامل تفريخ (.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ان الثراء الظاهري للأسماك الكهربائية الضعيفة ، إلى جانب الانتشار الأخير لموارد الجينوم ، يحفز الحاجة القوية للأدوات الجينية الوظيفية في نموذج السمك الكهربائي الضعيف. هذا النظام جذاب بشكل خاص بسبب التطور المتقارب للعديد من الصفات الظاهرية في السلالات المتوازية من الأسماك ، والتي يتم الاحتفاظ بها بسهوله في المختبر.
البروتوكول الموصوف هنا يوضح فعاليه تقنيه CRISPR/كاس 9 في السلالات من الأسماك الكهربائية الضعيفة التي تطورت بالكهرباء والكهرباء بالتوازي ، التالي يمثل خطوه رئيسيه لهذا النموذج الوعد ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
ويعترف المؤلفون بالجهود البطولية التي بذلتها مونيكا لوكاس ، وكاثرين شو ، وريان تايلور ، وجاريد تومسون ، ونيكول روبيهرود ، وهوب هيلي للمساعدة في تربيه الأسماك ، وجمع البيانات ، وتطوير البروتوكولات المبكرة. ونود أيضا ان نشكر المستعرضين الثلاثة علي اقتراحاتهم المقدمة إلى المخطوطة. ونحن نعتقد ان المنتج النهائي لتكون ذات نوعيه أفضل بعد معالجه تعليقاتهم. وقد تم تمويل هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم #1644965 و#1455405 إلى JRG ، ومنحه المدير الخاص لمجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية إلى VLS.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 20 مجم / مل من الحمض النووي الريبي الصف Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 نقطة أساس سلم الحمض النووي | NEB | N3236L | |
| زجاج البورسليكات الشعري مع خيوط | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (OD 1.0 مم ، معرف 0.58 مم ، طول 10 سم) بروتين |
| Cas9 مع NLS ؛ 1 مجم / مل | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & مجموعة المناديل | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader أطراف الماصة | فيشر Scientific | 10289651 | |
| حقنة هاميلتون | Fisher Scientific | 14-824-654 | يشار إليها باسم "حقنة زجاجية دقيقة" في بروتوكول |
| Kimwipe | Fisher Scientific | يشار إلى 06-666 | باسم "مسح المهام الدقيقة" في البروتوكول |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | المستخدمة في اختبار الانقسام في المختبر |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel الولايات المتحدة الأمريكية | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | يشار إليه باسم "عامل التفريخ" في البروتوكول |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | المشار إليه باسم "اللدائن الحرارية" في البروتوكول |
| مجتذب الماصة | WPI | SU-P97 | sutter العلامة التجارية |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| إبرة قابلة لإعادة الاستخدام - تتطلب التخصيص | فيشر Scientific | 7803-02 | تخصيص إلى 0.7 بوصة طويلة ؛ نمط النقطة 4 والزاوية 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | استخدم مع المخزن المؤقت 10x NEB المضمن |
| الأدوات المطلية بالتفلون | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | يشار إليها باسم "polytetrafluoroethene" في البروتوكول |
المراجع
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
