طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Summary

توضح هذه المقالة طريقه لتحميل الاجنه الضعيفة الهشة للحصول علي المجهر البؤري المطول الفاصل الزمني. هذه الطريقة منخفضه التكلفة سهله الأداء باستخدام الاطباق المجهرية العادية بالزجاج السفلي للتصوير علي اي مجهر مقلوب. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه.

Abstract

ويمكن ان يعقب ديناميات التنمية المجهر الزمني الفاصل بين الاجنه الحية المحورة وراثيا التي تعبر عن الفلورية في انسجه أو خلايا محدده. صعوبة في التصوير تطوير الجنين كله هو ان الاجنه الزرد تنمو بشكل كبير في الطول. عندما شنت علي النحو الذي تم بانتظام في 0.3-1 ٪ ذوبان منخفضه نشات ، والاجنه يفرض قيود النمو ، مما يؤدي إلى تشوات في جسم الجنين لينه. ومع ذلك ، للقيام بالمجهر الزمني الفاصل ، يجب ان يتم شل الجنين. توضح هذه المقالة طريقه تركيب طبقات لأجنه الزيبرافيش التي تقيد حركيه الاجنه مع السماح بالنمو غير المقيد. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه. لإثبات قابليه استخدام هذه الطريقة ، كان الجنين كله الاوعيه الدموية ، والخلايا العصبية وتنميه العضلات في الأسماك المحورة وراثيا لمده 55 ساعات متتالية. ويمكن استخدام هذه الطريقة المتصاعدة للتصوير سهله ومنخفضه التكلفة من الاجنه الزرد كله باستخدام المجاهر المقلوبة دون متطلبات قوالب أو المعدات الخاصة.

Introduction

ومنذ فتره طويلة كان الزبرافيش كائنا نموذجيا لعلم الاحياء التنموي ، والمجهر هو الطريقة الرئيسية لتصور التطور الجنيني. وتشمل مزايا استخدام الاجنه الزبرافيش للدراسات التنموية صغر الحجم ، والوضوح البصري ، والتطور السريع ، والخصوبة العالية للأسماك البالغة. وقد سمح الجيل من خطوط الزرد المحورة وراثيا التعبير عن الفلوري في بعض الانسجه أو الخلايا لتصور مباشر لتطوير الانسجه بطرق غير ممكنة مع أكبر الفقاري الحيوانية. الاقتران مع المجهر الزمني ، يمكن دراسة تفاصيل وديناميكيات تطور الانسجه بسهوله.

صعوبة مع التصوير التنمية الزرد هو ان الاجنه تنمو بشكل كبير في الطول; يمدد الجنين طوله أربعه أوقات ضمن الاولي 3 أيام الحياة¹. كما ان جسم الجنين المبكر لين ، ويصبح مشوها بسهوله إذا كان النمو مقيدا. ومع ذلك ، للقيام بالمجهر البؤري ، يجب ان يتم شل الجنين. للحفاظ علي الاجنه في وضع ثابت للتصوير الفاصل الزمني البؤري ، يتم تخديرها بانتظام وتركيبها في 0.3-1 ٪ منخفضه الذوبان التي نشات. هذا له ميزه السماح لبعض النمو اثناء التصوير لفتره معينه من الزمن ، في حين تقييد تحركات الجنين. يمكن ان تكون أجزاء من الجنين فعاله مثل هذا. ومع ذلك ، عند استخدام هذه الطريقة لتصوير الجنين بأكمله لفترات زمنيه طويلة ، لوحظت تشوات بسبب النمو المحدود الناجم عن الاجنه. التالي ، هناك حاجه إلى أساليب التركيب الأخرى. وقد وصف كوفمان وزملاءه بديلا لتركيب الاجنه الخفيفة للحصول علي المجهر المجهري للضوء ، مثل المجهر الضوئي الانتقائي للطائرة (SPIM) ، عن طريق تركيب الاجنه في أنابيب الاثيلين البروبيلين (إثراء) المشبعة بالفلور التي تحتوي علي تركيزات منخفضه من الاغثار أو ميثيل سيلولوز². وتنتج هذه التقنية تصورا رائعا لتولد الاجنه علي مر الزمن. ويصف شميد وآخرون تركيب ما يصل إلى سته أجنه في الأنابيب المجهرية للضوء بالورقة الخفيفة³ التي تقدم تصورا لعده أجنه في جلسة تصوير واحده. وقد استخدمت قوالب لإنشاء صفائف الاجنه لتركيب فعال لاعداد أكبر من الاجنه⁴. وقد شيدت masselkink وآخرون قوالب البلاستيك المطبوعة 3d التي يمكن استخدامها لجعل يلقي السيليكون ان الاجنه الزرد في مراحل مختلفه يمكن وضعها في ، وتمكين تصاعد في موقف ثابت للتصوير ، بما في ذلك التصوير البؤري⁵. وقد استخدمت الطباعة 3d أيضا لجعل قوالب لتحديد المواقع متسقة من الاجنه الزرد في شكل 96-بئر⁶. يتم تخصيص بعض القوالب لمراحل معينه ، وقد لا تسمح النمو غير المقيد لفترات زمنيه طويلة ، في حين ان قوالب أخرى أكثر مرونة. وفي الاونه الاخيره ، نشرت Weijts et al. تصميم وتصنيع طبق من أربعه ابار للتصوير الحي لأجنه الزيبرافيش⁷. في هذا الطبق ، يتم وضع ذيل وجذع الاجنه السمكية التخدير يدويا تحت سقف السيليكون واضحة المرفقة فقط فوق الزجاج غطاء لتشكيل جيب. ثبتت الجنين بعد ذلك في هذا موقعه بالاضافه من 0.4% [اغبرز]. هذا التصاعد يسمح للتصوير حوالي 2 مم الجزء الخلفي طويلة (الجذع والذيل) من الجنين ، وبما يصل إلى 12 الاجنه يمكن تركيبها في بئر ، وطريقه يسمح للتصوير من عينات متعددة. المثل ، قدم Hirsinger و Steventon مؤخرا طريقه حيث يتم تركيب راس السمكة في اجنشا ، في حين ان الذيل يمكن ان تنمو بحريه ، وهذا الأسلوب أيضا يسهل بكفاءة التصوير من الجذع ومنطقه الذيل من الجنين⁸.

توضح هذه المقالة طريقه متصاعدة من الطبقات لأجنه الزيبرافيش التي تقيد حركات الاجنه مع السماح بالنمو غير المقيد. مزايا هذه الطريقة المتصاعدة هي انها طريقه منخفضه التكلفة وسريعة وسهله لتحميل الاجنه من مختلف المراحل للتصوير باستخدام اي المجهر المقلوب. التركيب يسمح التصوير علي المدى الطويل من الجسم كله (الراس والجذع والذيل) اثناء تطوير الجنين. لعرض قابليه استخدام هذه الطريقة ، كان الجنين كله الاوعيه الدموية ، والخلايا العصبية وتنميه العضلات في الأسماك المحورة وراثيا. وقد أصيب اثنان من الاجنه في الدورة الواحدة ، في فترتين موجيتين ثلاثيتي الابعاد ، بالمجهر الزمني لمده 55 ساعة متتالية لتقديم أفلام عن تطور الانسجه.

Protocol

تمت الموافقة علي العمل الحيواني المعروض هنا من قبل المؤسسات المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها (Acucs) في جامعه هيوستن وجامعه إنديانا.

1-تربيه الأسماك

ملاحظه: يتطلب العمل مع نماذج فقاري بروتوكول معتمد IACUC. وينبغي ان تجري وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والدولية ذات الصلة.

1. الحفاظ علي الزرد الكبار كما هو موضح في المؤلفات المنشورة سابقا⁹.
2. في فتره ما بعد الظهر ، مكان الزرد الكبار في تربيه الدبابات. تولد الذكور إلى الإناث بنسبه 1:2.

2-اعداد الحلول

1. جعل حل الأسهم من 1 ٪ منخفضه ذوبان اجنشا في وسائل الاعلام الجنين (E3:5 مم كلوريد الصوديوم ، 0.17 mM KCl ، 0.33 mM CaCl₂، 0.33 Mm mgso₄، تعديلها لدرجه الحموضة 7.0). Aliquot حل الأسهم في أنابيب 1.5 mL وتخزينها في 4 درجه مئوية.
2. جعل حل الأسهم من 4 ٪ (ث/ف) Tricaine (MS-222) في الماء المقطر. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية في زجاجه داكنه.
   تحذير: Tricaine سامه وينبغي وزنها وحلها في غطاء الدخان.
3. جعل حل الأسهم من 20 مم ن-فينيلثيريا (PTU) في الماء المقطر. يخزن عند-20 درجه مئوية.

3-اعداد الاجنه

1. بعد التزاوج ، حصاد الاجنه في E3 في طبق بيتري واحتضانها في 26.5 درجه مئوية لحوالي 28 ساعة قبل التركيب.
   ملاحظه: هذا يبطئ تطور الاجنه بحيث تكون الاجنه تقريبا في 30 مرحله الجسيده في بداية التصوير.
2. تخدير الاجنه في 0.016-0.020 ٪ Tricaine في E3. لمنع تصبغ ، أضافه PTU إلى تركيز 200 μM.
3. ديتشوريوناتي الاجنه باستخدام ملقط تحت المجهر التشريح. باستخدام اثنين من الملقط ، وقبضه وسحب بلطف المشيماء بعيدا للإفراج عن الجنين.

4. تصاعد في اجنشا

ملاحظه: تتطلب طريقه التركيب المطورة تركيزين مختلفين من الذوبان المنخفض في E3 مع 0.02% Tricaine و PTU حسب الحاجة. ويحتوي الحل الأول علي التركيز الأمثل للنشا الذي يكون فيه التشوه والحركية عند الحد الأدنى. يتم وصف التحسين في الخطوة 5 أدناه.

1. سخن المحاليل التي نشات للطبقين (التركيز المحدد في الخطوة 5 أدناه و 1%) إلى 65 درجه مئوية. السماح لل الاغاروزها تهدئه إلى ما يقرب من 30 درجه مئوية فقط قبل المتصاعدة بحيث لا يضر الجنين من الحرارة. للتركيب ، استخدم الاطباق الزجاجية السفلية 35 مم مع الغطاء الزجاجي السفلي رقم 0. الغطاء الزجاجي المرفق بالجزء السفلي من الطبق يخلق 10 ملم الضحلة (حوالي 1.2 مم عمق) جيدا ، والتي يتم وضع الجنين.
   ملاحظه: في هذه الحالة ، كان التركيز مع اقل الحركة والتشوات بين 0.025 إلى 0.040 ٪ اجنشا.
2. ضع الجنين برفق مع أحد جوانبه الجانبية باتجاه أسفل الطبق باستخدام ماصه زجاجيه أو ماصه مجهريه. في حاله استخدام الماصة المجهرية ، اقطع الجزء الخارجي من الطرف لزيادة حجم الفتحة لتناسب الجنين (الشكل 1ا). قم بازاله اي E3 المتبقية بعناية مع الماصات المجهرية.
3. قم باضافه الحل الأول إلى البئر الصغير الذي تم إنشاؤه بواسطة الغطاء الزجاجي المرفق بالجزء السفلي من الطبق لتغطيه الجنين (الطبقة 1) (الشكل 1ب). التاكد من ان الاجثار يغطي البئر الصغيرة ولكن لن تجاوز ذلك.
4. تغطيه البئر الصغيرة بغطاء زجاجي (22 مم × 22 مم) (الشكل 1ج) لإنشاء مساحة مملوءة ضيقه مع الجنين بين نظارتي الغطاء.
5. وضع طبقه من 1 ٪ محلول اجنشا علي راس الغطاء الزجاجي في جميع انحاء الجزء السفلي من الطبق (طبقه 2) (الشكل 1د). ومع تصلب هذه الطبقة ، فانها تحمل زجاج الغطاء في مكانها.
6. ملء الجزء المتبقي من الطبق مع E3 التي تحتوي علي 0.02 ٪ Tricaine للحفاظ علي نظام رطب (طبقه 3) (الشكل 1ه).
   ملاحظه: في هذا الاعداد ، والزجاج غطاء و 1 ٪ اجنشا حماية الطبقة السفلي من الحصول علي المخفف.

5. الأمثل للحل اجنشا للطبقة 1

1. لتحديد التركيز الأمثل للطبقة 1 ، استخدم نهج بحث شبكه متعددة المقاييس. وقد نشات أجنه الجبل بتركيزات متزايدة تتراوح بين 0.01 في المائة و 1 في المائة تليها التصوير بالفواصل الزمنيه لتقييد نمو الاجنه والحركية في مجال الرؤية. تحديد التركيزات حيث كل من التشويه والحركية هي في الحد الأدنى.
2. ولتحسين تركيز الاجنه بشكل أكبر ، يتم تركيب الجنين باستخدام مجموعه أدق من تركيزات الاغثار (علي سبيل المثال ، بين 0.025 و 0.040 في المائة) اعتمادا علي التركيز الذي وجد انه الأفضل في الخطوة 5.1 (علي سبيل المثال ، 0.025 في المائة ، 0.028 في المائة ، 0.031 في المائة ، الخ).
   ملاحظه: في المختبر الخاص بنا ، كان تركيز اجنشا الأمثل حول 0.03 ٪.

6-التصوير بالفواصل الزمنيه

ملاحظه: هذه الطريقة المتصاعدة يعمل لأي المجهر المقلوب مع وظيفة الفاصل الزمني للتصوير الميدانية ومشرق التصوير.

1. أداء التصوير بالفاصل الزمني للجنين كله أو أجزاء منه لتصل إلى 55 h. لتصوير العديد من الاجنه ، استخدم محول المرحلة الذي يحتوي علي العديد من الاطباق مع جنين واحد لكل طبق. تدوير الاطباق واحدا تلو الآخر بحيث يتم وضع الاجنه تقريبا أفقيا كما تحددها العين. لنمو الجنين الأمثل والتنمية ، واستخدام مرحله المجهر مع مجموعه حاضنه في 28.5 درجه مئوية.
2. حدد هدفا منخفض التكبير في برنامج المجهر. تحت قطعه العين ، حدد موقع ومحاذاة ناعما الاجنه أفقيا عن طريق تدوير الاطباق باستخدام الاضاءه الميدانية الساطعة وتسجيل مواقعها في البرنامج. إنشاء اسم ملف لحفظ البيانات تلقائيا.
   ملاحظه: في هذه التجربة ، تم استخدام خطه apo λ 4x 0.2 NA الهدف وعلامة التبويب XY داخل نافذه الاستحواذ الثانية لتسجيل مواقع الاجنه. تم حفظ البيانات بتنسيق nd2. تم اختيار الهدف من خلال النقر علي الرموز الخاصة به في علامة التبويب Ti Pad .
3. تعيين حجم الثقب ، وسرعه المسح الضوئي ، وحجم الصورة ، والتكبير. بعد ذلك ، حدد هدف تكبير اعلي للتقاط الصور.
   ملاحظه: في هذه التجربة ، تم استخدام خطه-apo 10x 0.45 NA الهدف لتصوير الاجنه كامله ، وتم استخدام السوبر فلور 20x 0.75 NA الهدف للتصوير اعلي التكبير من أجزاء من الجنين. تم تعيين الثقب إلى 1.2 الاتحاد الافريقي (19.2 μm للعدسة 10x) ، تم تعيين سرعه المسح الضوئي لفتره السكون بكسل من 2.4 μs وتم تعيين حجم الصورة إلى 1024 x 1024 بكسل مع التكبير المسح الضوئي واحد ، وإعطاء حجم بكسل من 1.24 μm لعدسه 10x و 0.62 ميكرومتر للعدسة 20x.
4. حدد القناات لتكون مضانه. اضبط إعدادات التقاط الصور علي قناه واحده في كل مره. لكل قناه مضان ضبط قوه الليزر وكاشف الجهد العالي ، والتاكد من جمع أفضل مجموعه ديناميكية ممكنة مع تجنب التشبع والحد من التصوير الضوئي.
   ملاحظه: في هذه التجربة ، تم التصوير gfp مع قناه خضراء 488 ، (488 nm الليزر والانبعاثات بين 500 و 550 nm) ، وعروض العروض مع القناة الحمراء 561 (561 nm الليزر والانبعاثات بين 570 و 600 nm) ، وتم جمع صوره الإرسال باستخدامالليزر 561 nm وكاشف الضوء المرسلة (TD قناه)
5. لصوره الجنين كله مع الهدف 10x ، صوره عده مجالات الرؤية مع التداخل وغرزه لهم معا باستخدام البرنامج المجهر.
   ملاحظه: بما ان الاجنه سوف تنمو بشكل كبير في الحجم اثناء التصوير ، تاكد من وجود مساحة في مجال الرؤية الاماميه والخلفية للجنين. استخدم علامة التبويب الصورة الكبيرة للمسح الضوئي في نافذه الاستحواذ الثانية وحدد نمط 4 × 1 مع تراكب 10% للتقاط أربعه حقول عرض متجاورة.
6. تكوين الإعدادات للتقاط المكدسات Z باستخدام برنامج المجهر.
   ملاحظه: لان الجنين يتم تركيبه بالقرب من الجزء السفلي من الطبق الزجاجي ، فان مركزه سينتقل بعيدا عن القاع لأنه ينمو. استخدم علامة التبويب Z من نافذه الاستحواذ الثانية وحدد النطاق النسبي غير المتناظر. مع هذا الأسلوب ، يتم استخدام الطائرة التركيز الحالي كما الطائرة المرجعية وبقية الطائرات يتم توزيعها غير متماثل أعلاه واقل لتشمل الجنين كله داخل الحجم Z-كومه ، مع مساحة كافيه لحساب نمو العينة. في جميع التجارب ، تم تعيين الفاصل الزمني إلى 11 ميكرومتر والنطاق الإجمالي إلى حوالي 45 الطائرات.
7. من أجل الحفاظ علي تركيز الاجنه المتعددة اثناء التصوير بالفواصل الزمنيه طويلة الأمد ، استخدم تركيزا تلقائيا. في حاله تصوير عده أجنه ، اضبط مستويات الازاحه الفردية لكل جنين للتركيز علي الطائرة المرجعية.
   ملاحظه: في هذه التجربة ، تم استخدام نظام تثبيت التركيز القائم علي الليزر.
8. اعداد معلمات الفاصل الزمني في البرنامج المجهر والصورة لمده 55 h في حوالي 1 h فترات. في كل دوره ، والتقاط اثنين من مجموعات الاجنه بالتتابع وحفظ البيانات تلقائيا بعد كل دوره.
9. معالجه الصور باستخدام إصدار علي الخط أو خارج الخط من برنامج المجهر. وإذا كان أكثر من جنين واحد قد وضع ، فقم بإنشاء ملفات مستقله لكل جنين عن طريق تقسيم مجموعه البيانات استنادا إلى موقع التصوير. استخدم الحد الأقصى لتوقعات الكثافة أو أداه مشابهه لتحويل مجموعات بيانات الوقت ثلاثي الابعاد إلى مجموعات بيانات الوقت ثنائيه الابعاد. إنشاء ملفات الأفلام باستخدام الخيار حفظ باسم القائمة ، تحديد .avi كتنسيق الملف. حدد الخيار لا ضغط مع فواصل ms 200 لسرعه تشغيل 5 إطارات/s.
   ملاحظه: تم تقسيم مجموعه البيانات الاصليه من اثنين من الاجنه في هذه التجربة باستخدام وظيفة تقسيم المواقع في البرنامج (ملف | استيراد/تصدير | تقسيم النقاط المتعددة). تم تحويل مجموعات بيانات الوقت الثلاثية الابعاد إلى مجموعتين للبيانات الزمنيه ثنائيه الابعاد باستخدام وظيفة الحد الأقصى من الكثافة (Image | المعالجة الثانية | إنشاء الحد الأقصى كثافة الصورة الإسقاط في Z).

Results

تطوير طريقه التركيب
وكان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو تطوير تقنيه التركيب منخفضه التكلفة للتصوير بالفواصل الزمنيه للتطوير الإشعاعي لفترات طويلة من الزمن. تم تطوير أسلوب التركيب الطبقي للسماح بالنمو الكامل للجسم الجنيني الهش ، مع تقييد تحركاته. إذا كان تركيز الطبقة 1 مرتفعا جدا ، فان الاجنه ستصبح مشوه ومنحنيه (الشكل 2). وقد قلصت الاجنه المزروعة بنسبه 0.1 في المائة و 0.5 في المائة الذيول ، والزعانف المشوهة ، والرؤوس المنحنية. وعلي العكس من ذلك ، إذا كان التركيز الموضعي منخ...

Discussion

ويرد هنا طريقه متصاعدة لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة. الخطوة الأكثر اهميه بالنسبة لطريقه التركيب هي تحديد التركيز الأمثل للنشا الذي سيسمح بنمو الجنين الزبرفيش غير المقيد ، وفي الوقت نفسه إبقاء الاجنه في وضع ثابت تماما للتصوير البؤري. ونظرا لان التركيز الأمثل للاغثار ضيق جدا ، فان هذه القيمة حساسة جدا للأخطاء في قياس وزن الأثير وحجم E3 اثناء اعداد الحل. وقد يعتمد التركيز الأمثل أيضا علي درجه الحرارة ومرحله الجنين. التالي ، فان التركيز الأمثل سيحتاج إلى أعاده تحديد لكل دفعه جديده من الحلول التي نشات ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
انخفاض الذوبان الاغاروز	سيجما ألدريتش ، MO	A9414	تخزين المحلول المذاب عند 4 درجات ؛ أطباق
قاع زجاجي مقاس 35 مم مع غطاء رقم 0 وقطر 10 مم من القاع الزجاجي	MatTek Corporation ، MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich ، MO	E10521	تخزين المحلول المذاب عند 4 درجات ؛ C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich، MO	P7629	تخزين المحلول المذاب عند -20 درجة ؛ C
مايكرو غطاء زجاجي 22 × 22 مم	VWR	48366 067
Leica DMi8 مجهر مضان	Leica	NA
LAS X برنامج	Leica	NA	برنامج المجهر
DMC4500 كاميرا مجهر رقمي	Leica	NA
نيكون A1S مجهر متحد البؤر	Nikon Instruments Inc.	NA
نيكون NIS AR الإصدار 4.40	نيكون إنسترومنتس، Inc.	برنامج مجهر	NA