Method Article

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

DOI:

10.3791/60362

⸱

October 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. اليجايليس هو النظام الرئيسي للتحليل المنهجي لمواصفات مصير الخلية والاحداث الوراثية اثناء النمو الجنيني. ويتمثل أحد التحديات في ان الاجنه تتكشف ديناميكيا علي مدي فتره تبلغ حوالي 13 ساعة ؛ وقد ادي هذا المقياس الزمني الذي دام نصف يوم إلى تقييد نطاق التجارب من خلال الحد من عدد الاجنه التي يمكن ان تكون غير محدده العمر. هنا ، ونحن وصف بروتوكول شبه عاليه الانتاجيه التي تسمح للتصوير في وقت واحد 3D الفاصل الزمني للتنمية في 80-100 الاجنه في وقت معتدل القرار ، من ما يصل إلى 14 حاله مختلفه ، في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. البروتوكول هو واضح ويمكن تنفيذها من قبل اي مختبر مع الوصول إلى المجهر مع نقطه القدرة علي الزيارة. ويتجلى الفائدة من هذا البروتوكول باستخدامه لصوره اثنين من السلالات التي بنيت خصيصا التعبير عن علامات الفلورسنت الأمثل لتصور الجوانب الرئيسية للمواصفات الجرثومية طبقه ونشاه المستنقعات. لتحليل البيانات ، تم بناء برنامج مخصص يقوم باقتصاص الاجنه الفردية من مجال عرض أوسع في جميع القناات ، والخطوات z ، والنقاط الزمنيه ، ويحفظ المتواليات لكل جنين في كومه tiff منفصلة. وهذا البرنامج ، الذي يتضمن واجهه مستخدم رسوميه سهله الاستخدام (GUI) ، يبسط معالجه البيانات عن طريق العزل ، والمعالجة المسبقة ، وتوجيه الاجنه الفردية بشكل موحد استعدادا للتصور أو التحليل الألى. كما يتم توفير ماكرو ImageJ الذي يقوم بتجميع بيانات الجنين الفردية في ملف متعدد اللوحات يعرض الحد الأقصى من الإسقاطات الفلورية وصور الحقول الساطعة لكل جنين في كل نقطه زمنيه. تم التحقق من صحة البروتوكولات والاداات الموصوفة هنا باستخدامها لتوصيف النمو الجنيني بعد ضرب 40 الجينات التنموية الموصوفة سابقا. هذا التحليل تصور الأنماط الظاهرية التنموية المشروحة سابقا وكشفت عن أخرى جديده. وباختصار ، فان هذا العمل يفصل طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه إلى جانب برنامج الاقتصاص وأداه التصور ImageJ التي ، عندما يقترن مع سلالات التعبير عن علامات الفلورسنت المعلوماتية ، يسرع إلى حد كبير التجارب لتحليل النمو الجنيني.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجنين c. ايلينيسس هو نظام نموذجي مهم لبيولوجيا الخلية الميكانيكية وتحليل مواصفات مصير الخلية والاحداث مورفوجينيتيك قياده التنمية الجنينية1,2,3,4 ،5،6،7،8،9. حتى الآن ، تم تحقيق الكثير من توصيف كل من الاحداث علي المستوي الخلوي ومواصفات مصير الخلية في الجنين باستخدام الاستبانة الزمنيه عاليه نسبيا تجارب التصوير الواحد في الوقت (اي اقتناء كل 10-100 ثانيه) من الاج....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 . اعداد الاجنه الخاصة بالتصوير شبه العالي الانتاجيه

ملاحظه: والهدف من هذا الجزء من البروتوكول هو تحميل السكان من شبه متزامنة (2 إلى 8-خليه المرحلة) c. الاجنه ، تشريح من سلالات علامة مناسبه (الشكل 2) ، إلى أسفل الزجاج 384-بئر لوحه للتصوير. ويمكن أيضا ان تعمل اشكال اللوحات الأخرى ، ولكن يفضل لوحات البئر 384 لان حجم البئر الصغير يقيد انتشار الاجنه إلى منطقه صغيره نسبيا ، مما يسهل تحديد الحقول التي تحتوي علي أجنه متعددة للتصوير بالفواصل الزمنيه. ويضمن تزامن الاجنه تقريبا ان يتم التقاط المسار الكامل للتنمية لكل من الاجنه في الحقل.

  1. اعداد 5-10 مل من 0.1 mg/mL محلول من هيد....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديا كبيرا في توصيف تاثير الاضطرابات الجزيئية علي التنمية الجنينية c. هو ان يستغرق حوالي 10 ساعة للجنين للتقدم من الانقسام الأول إلى نهاية استطاله في 20 °16. والطريقة شبه العالية الانتاجيه التي يمكن فيها لمجموعات كبيره من الاجنه ان تكون في نفس الوقت مفيده للاحداث علي هذا النطاق الزمني لأنها تسمح بتصوير حالات متعددة بالتوازي مع حجم الفرقة الكافية لكل شرط لتمكين التحليل الكمي (الشكل 1ا).

طريقه تصوير شبه عالي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا العمل مجموعه من الاداات والأساليب التي تم تطويرها لتمكين الجهود علي نطاق أوسع لتوصيف وظيفة الجينات في التنمية الجنينية في c. اليجينات. طريقتنا شبه عاليه الانتاجيه تسمح بالتصوير بالفاصل الزمني ثلاثي الابعاد للتطوير الجنيني بدقه 20 دقيقه لأجنه 80 – 100 في تجربه واحده. في حين ان هذا البروتوكول يمكن تكييفها للاستخدام مع اي سلاله علامة المرجوة (ق) ، وهذا العمل يوضح إمكانات الأسلوب باستخدام اثنين من سلالات مخصصه وضعت لرصد الاحداث اثناء الاجنه: (1) سلاله الجرثومة الجرثومية الصحفي ، والتي الانسجه المحددة المروجي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم S.D.O. من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة برعاية جامعه كاليفورنيا سان دييغو البحوث المؤسسية وجائزه التطوير الوظيفي الاكاديميه (المعاهد القومية للصحة/IRACDA K12 GM068524). وقد تم دعم كو من قبل معهد لودفيغ لأبحاث السرطان ، والذي قدم لهم أيضا تمويل الأبحاث المستخدمة لدعم هذا العمل. ونحن ممتنون لأندرو Chisholm لنصيحته في المراحل المبكرة من هذا المشروع ، رونالد بيجز للمساهمات في هذا المشروع بعد مرحله تطوير الأسلوب الاولي ، وديف جينكينس واندي Shiau للحصول علي الدعم والوصول إلى اكتشاف جزيء صغير نظام التصوير عالي المحتوي الخاص بالمجموعة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مجموعة أنبوب الشفاطDrummond Scientific2-000-000
ماصة معايرة (25 مل)Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager SoftwareYokogawa Electric Corpالمضمنة مع CV1000
أنبوب مخروطي (15 مل)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية1475-0501
CV1000 مجهريوكوجاوا إلكتريك كوربCV1000
شريحة الاكتئاب (3 آبار)Erie Scientific1520-006
مجهر تشريحنيكونSMZ-645
Eppendorf جهاز الطرد المركزي 5810REppendorf5811 07336
ImageJ / FIJIمفتوح المصدرhttps://imagej.net/Fiji
M9 BufferLab أعدhttps://openwetware.org/wiki/M9_salts
أنبوب الطرد المركزي الدقيق (1.5 مل)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية1615-5500
Microseal F-foil SealBio-RadMSF1001
NGMPlates Lab محضرhttp://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
مشرط # 15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus ، 384 Well ، F-bottom ، غلاف زجاجيقاع Greiner Bio-One781855
رباعي الميزول هيدروكلوريدسيجما ألديرشT1512-10G
ملاقط ، دومون # 3علوم المجهر الإلكتروني0109-3-PO
U-PlanApo الهدف (10 & مرات ؛ 0.4 NA)أوليمبوس1-U2B823
U-PlanApo الهدف (60 & مرات ؛ 1.35 NA)أوليمبوس1-U2B832

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans Embryonic DevelopmentSemi high throughput Imaging3D Time lapse ImagingEmbryo Cropping ProgramImageJ Visualization ToolkitFluorescent Marker StrainsConfocal MicroscopyAutomated Data AnalysisRNAi based ScreeningEmbryo Preparation Protocol

Related Articles