مقالة منهجية

التحليل الخلوي للحمض النووي الثنائي الميكروي والتدفق المضخم للخلايا من Formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه المولية

DOI:

10.3791/60366

⸱

أكتوبر 20, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Experimental Medicine, McGill University, 2Department of Human Genetics, McGill University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, McGill University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشامات الوراثية هي حالات الحمل البشري غير الطبيعية مع المسببات غير المتجانسة التي يمكن تصنيفها وفقا لخصائصها المورفولوجية ومساهمه الوالدين في الجينوم المولي. وفي هذا الصدد ، توصف بالتفصيل البروتوكولات المتعلقة بالتنميط الجيني للحمض النووي المتعدد الميكروي وتدفق الخلايا الخلوية من فورمالين-الانسجه المولية الثابتة من البارافين ، إلى جانب تفسير النتائج وتكاملها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلد hydatidiform (HM) هو الحمل البشري غير طبيعيه تتميز الانتشار المفرط تروفوبلاستيك والتنمية الجنينية غير طبيعيه. هناك نوعان من HM استنادا إلى التقييم المورفولوجية المجهرية ، كامله HM (اليه تبادل أليات) وجزئيه HM (PHM). ويمكن تقسيمها بشكل أكبر علي أساس مساهمه الوالدين في الجينوم المولي. هذا التوصيف لل HM ، من خلال تحليلات المورفولوجية والنمط الجيني ، هو أمر حاسم لأداره المرضي والفهم الأساسي لهذه الامراض المثيرة للاهتمام. ومن الموثق جيدا ان التحليل المورفولوجية لصاحبه الجلالة يخضع لتقلبات واسعه بين المراقبين وليس كافيا من تلقاء نفسه لتصنيفها بدقه في اليه تبادل أليات و PHM وتمييزها عن الإجهاض المائي غير المولي. يتم اجراء تحليل التنميط الجيني في الغالب علي الحمض النووي والانسجه من فورمالين-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من المنتجات (FFPE) من الحمل ، والتي لديها اقل من الجودة المثلي ، التالي قد يؤدي إلى استنتاجات خاطئه. في هذه المقالة ، يتم توفير بروتوكولات مفصله للتحليل الجيني متعدد الخلايا وتحليلات التدفق الخلوي للانسجه المولية FFPE ، جنبا إلى جنب مع تفسير نتائج هذه الأساليب ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والتكامل مع التقييم المورفولوجية ، p57KIP2 مناعي ، والتهجين في الموقع (FISH) للوصول إلى تشخيص صحيح وقوي. وفي هذا الصدد ، يتقاسم المؤلفون الأساليب والدروس المستفادة في السنوات العشر الماضية من تحليل ما يقرب من 400 منتجا من الحمل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والخلد الورم (HM) هو الحمل البشري غير طبيعيه تتميز النمو الجنيني غير طبيعي ، فرط انتشار تروفوبلاست ، وانحطاط هيدروبيك من الزغب المشيميه (CV). تاريخيا ، كانت HM تنقسم إلى نوعين ، كامله HM (اليه تبادل أليات) وجزئيه HM (PHM) استنادا فقط علي التقييم المورفولوجية1. ومع ذلك ، فقد تبين ان التقييم المورفولوجية وحده لا يكفي لتصنيف HM في النوعين الفرعيين (اليه تبادل أليات و phm) وتمييزها عن الإجهاض غير المولي2،3،4.

لان اليه تبادل أليات و PHM لها ميول مختلفه إلى الأورام الخبيثة ، ولذلك فمن المهم ان تحدد بدقه نوع النمط الجيني من HM لتوفير المتابعة المناسبة والاداره للمرضي. ونتيجة لذلك ، تم في العقود الماضية وضع وتطوير عده منهجيات لغرض تحديد مساهمه الوالدين في الانسجه المولية والتوصل إلى تصنيف صحيح لصاحبه الجلالة. وتشمل هذه تحليل النمط الحقيقي ، وتعدد الكروموسومات النطاقات ، البشرية مستضد الكريات البيضاء (هلا) الكتابة المصلية ، وتقييد طول الجزء المتعدد الاشكال ، وعدد متغير من تكرار ترادفي ، التنميط الجيني الميكروي ، والتدفق الخلوي ، و p57 KIP2 مناعي. وقد سمح هذا التقسيم الدقيق لمفاهيم HM استنادا إلى مساهمه الوالدين في الجينوم الخاصة بهم ، علي النحو التالي: اليه تبادل البيانات ، والتي هي أحاديه اللون andropermic أو مضاعف التشتت اندروجيني ، و phm ، والتي هي triploid ، التشتت في 99 ٪ و أحاديه الميكروفون في 1 ٪ من الحالات5،6،7،8. وعلاوة علي ذلك ، هناك نوع آخر من النمط الجيني من HM التي ظهرت في العقدين الماضيين ، وهو ثنائي اللون ثنائيه اللون. وهذه الاخيره متكررة في معظمها وقد تؤثر علي فرد واحد من افراد الاسره (الحالات البسيطة) أو علي ما لا يقل عن فردين من الاسره (الحالات العائلية). هذه الشامات مضاعف ثنائي الطور غالبا ما تسببها طفرات متنحي في NLRP7 أو KHDC3L في المرضي9,10,11,12. Diploid ثنائي الطور HM في المرضي الذين يعانون من طفرات متنحي في NLRP7 يمكن تشخيصها بأنها اليه تبادل أليات أو phm عن طريق التحليل المورفولوجية وهذا يبدو ان تترافق مع شده الطفرات في المرضي13,14. بالاضافه إلى تصنيف HM وفقا لأنماطها الجينية ، سمح إدخال واستخدام العديد من أساليب التنميط الجيني بالتمييز بين مختلف الكيانات المولية من الإجهاض غير المولي ، مثل التصاميم ثنائيه اللون أخرى أنواع التصاميم5,15. هذه المفاهيم قد يكون لها بعض الانتشار تروفوبلاست والشكل الخسيس الشاذة التي تحاكي ، إلى حد ما ، بعض الميزات المورفولوجية من HM.

الغرض من هذه المادة هو توفير بروتوكولات مفصله لتعدد النماذج الجينية وتدفق الخلوية من formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه (FFPE) ، وتحليلات شامله لنتائج هذه الأساليب وتكاملها مع أساليب أخرى التشخيص الصحيح والقاطع للانسجه المولية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق مجلس المراجعة المؤسسية في مكغيل علي هذه الدراسة البحثية. وقدم جميع المرضي موافقه خطيه للمشاركة في الدراسة والحصول علي منتجات FFPE من الحمل (POCs) استردادها من أقسام الامراض المختلفة.

ملاحظه: في حين ان هناك العديد من الطرق لتحديد النظام الجيني واللوني بواسطة قياس التدفق الخلوي ، فان البروتوكولات المقدمة هنا تصف طريقه واحده للتحليل باستخدام منصة واحده لكل منهما.

1-التنميط الجيني

  1. اختيار أفضل كتله FFPE
    1. لكل منتج ffpe من الحمل (المركز) ، واعداد المقاطع الملونة 4 μm-سميكه و يوزين (H & E) الملطخة كما هو موضح في الأقسام 1.2 و 1.3 ، واحد لكل كتله المتاحة ، للتقييم المورفولوجية عن طريق المجهر.
    2. باستخدام الشرائح H & E والمجهر الضوئي ، حدد كتله ffpe التي لديها أكبر كميه من الزغب المشيميه (cv) ، وإذا كان ذلك ممكنا ، الكتلة التي لديها CV منفصلة عن ، وليس المخلوطة مع ، انسجه الام.
  2. اجتزاء
    1. ضع الكتلة المختارة علي الجليد لمده 15 دقيقه لتسهيل العملية.
    2. ضبط ميكروتومي لخفض المقاطع التي هي 4 ميكرون سميكه للتقييم المورفولوجية المجهرية و 10 ميكرون سميكه لاستخراج الحمض النووي.
    3. وضع كتله الباردة في ميكروتومي وقطع مقطع واحد من كل كتله ل H & E تلطيخ و 10 − 30 أقسام من الكتلة المختارة ، اعتمادا علي كميه السيرة الذاتية في كتله ، لاستخراج الحمض النووي.
      ملاحظه: للكتل التي هي كامله من السيرة الذاتية ، 10 أقسام كافيه لاستخراج الحمض النووي. إذا كان حوالي 10 ٪ فقط من كتله يحتوي علي السيرة الذاتية بينما الباقي هي انسجه الام ، ثم 20 − 30 الأقسام مطلوبه لضمان كميات كافيه من الحمض النووي.
    4. باستخدام ملقط ، نقل كل قسم إلى 45 درجه مئوية حمام المياه. التقط القسم من حمام المياه مع شريحة مشحونة بشكل إيجابي (جدول المواد) التي سبق وسمها برقم تعريف العينة باستخدام قلم رصاص.
    5. ضع الشرائح التي تحتوي علي الأقسام في فرن عند 65 درجه مئوية للسماح للأقسام بالانضمام إلى الشرائح. الحفاظ علي الشرائح ل H & E في الفرن لمده 25 دقيقه. الحفاظ علي الشرائح لاستخراج الحمض النووي في الفرن لمده 20 دقيقه.
      ملاحظه: وقت الحضانة أقصر يجعل الانسجه اقل قليلا ملتصقة الشرائح التالي يسهل أزاله انسجه الام.
  3. H & تلطيخ
    1. السماح للشرائح لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة (10 دقيقه).
    2. اعداد كاشف
      1. اعداد ايوسين Y حل العمل (0.25%) وفقا للجدول 1. يخلط جيدا ويخزن في درجه حرارة الغرفة.
      2. اعداد العمل الحل الهيلوكسيلين عن طريق تمييع حل الأسهم من هيتوكوكسيلين 5x في الماء (اي ، مزيج 80 mL من الماء مع 20 مل من الهيوكسيلين).
        ملاحظه: التفاف حل الأسهم من الهيلوكسيلين في إحباط للتخزين.
    3. اعداد الجرار تلطيخ مع الكواشف الصحيحة تحت غطاء الدخان وفقا للجدول 2.
    4. قم باجراء تلطيخ H & E عن طريق دمج الشرائح في الجرار تلطيخ المناسبة للفترة الزمنيه الصحيحة وفقا للجدول 2.
    5. جبل الأقسام 4 μm للتحليل المورفولوجية مع تصاعد المتوسطة و كوفيرسليب مع الزجاج الشفتين (جدول المواد).
      ملاحظه: لا ينبغي ان تكون الأقسام 10 μm لتنميط الجينات الشفاه.
    6. ترك المقاطع 10 μm تحت غطاء الدخان لمده لا تقل عن 3 ساعات من أجل الروائح السامة أكسلين لتبديد.
      تحذير: جميع الخطوات تلطيخ تحتاج إلى ان يتم تنفيذها تحت غطاء الدخان. المنتجات اكسيلين تحتاج إلى ان تبقي تحت غطاء محرك السيارة في جميع الأوقات لان الروائح اكسيلين هي سامه. وعلاوة علي ذلك ، تحتاج إلى التخلص من اكسيلين و الهيلوكسيلين في حاويات خاصه. وبمجرد امتلاء هذه الحاويات ، فانها تحتاج إلى التخلص منها علي النحو الموصي به من قبل منظمه سلامه المختبر.
كاشفكميه
حل أسهم ايزين Y (1%)250 مل
80 ٪ الايثانول750 مل
حمض الخليك الجليدي (مركز)5 مل

الجدول 1: ايوسين Y حل العمل (0.25%) اعداد.

الكاشف المستخدمة (100 mL لكل بن)مده
1) اكسيلين5 دقائق
2) اكسيلين5 دقائق
3) 100 ٪ الايثانول2 دقيقه
4) 95 ٪ الايثانول2 دقيقه
5) 70 ٪ الايثانول2 دقيقه
6) 50 ٪ الايثانول2 دقيقه
7) الماء المقطر5 دقائق
8) الهيلوكسيلين4 دقائق
9) الماء المقطر5 دقائق
10) ايوسين1 دقيقه
11) 95 ٪ الايثانول5 دقائق
12) 100 ٪ الايثانول5 دقائق
13) اكسيلين5 دقائق
14) اكسيلين5 دقائق

الجدول 2: الكواشف والمدد الخاصة ببروتوكول التلطيخ H & E.

  1. عزل السيرة الذاتية
    1. تحت المجسم الفراغي الخفيف ، استخدم ملقط وقطع صغيره من مناديل مبلله بالماء (جدول المواد) لكشط الانسجه الاموميه غير المرغوب فيها من H & E-الملون 10 μm أقسام سميكه.
      ملاحظه: الهدف النهائي هو الحفاظ علي اي شيء ولكن السيرة الذاتية أو اغشيه الجنين (عند الحاضر) علي الشرائح التالي لأزاله جميع الانسجه الأخرى. قد تحتاج هذه الخطوة الكثير من الوقت والصبر ، اعتمادا علي كتله ، كما انه يتطلب اهتماما دقيقا للتفاصيل.
    2. يجب علي الشخص الثاني التحقق من الشرائح بعد التنظيف للتاكد من خلوها من انسجه الام.
    3. التقاط صور للشرائح التي تم تنظيفها أو توثيق ما يلي للمساعدة في تفسير البيانات: 1) ما إذا كان من الصعب تنظيف الانسجه ، النزفية ، أو نظيفه جدا ، 2) عدد الأقسام المستخدمة ، و 3) الكمية التقريبية من الانسجه المنظفة.
      ملاحظه: يقدم الشكل 1 مثالا علي شريحة سهله التنظيف. بالنسبة للكتلة التي تحتوي علي تقريبا هذا المبلغ من السيرة الذاتية ، 10 أقسام كافيه لاستخراج الحمض النووي. الشريحة في الشكل 2 لديها عدد قليل جدا من السيرة الذاتية التي تتداخل مع انسجه الام ، مما يجعل من الصعب جدا وتستغرق وقتا طويلا لتنظيف. بالنسبة للكتلة التي تحتوي علي تقريبا هذا المبلغ من السيرة الذاتية ، هناك حاجه إلى 30 قسما لاستخراج الحمض النووي.
    4. جمع السيرة الذاتية باستخدام قطعه مبلله صغيره من مناديل ورقيه. باستخدام ملقط ، المسيل للدموع قطعه صغيره من مناديل مبلله ورقه واستخدامها لجمع السيرة الذاتية.
    5. وضع قطعه من المناديل الورقية مع السيرة الذاتية المرفقة في أنبوب 1.5 مل الموسومة.
    6. تقليل كميه المناديل الورقية المستخدمة في هذه الخطوة لان الكثير قد تسد عمود استخراج الحمض النووي التالي تقليل الكمية النهائية من الحمض النووي الذي تم جمعه. في المتوسط ، وتهدف إلى استخدام اقل من سبع قطع صغيره من مناديل ورقيه لكل عينه. إذا لم يكن ذلك ممكنا بسبب وجود كميات كبيره من السيرة الذاتية ، وتقسيم العينة بين اثنين من أنابيب لتسهيل استخراج.

figure-protocol-1
الشكل 1: الشريحة التمثيلية للنمط الجيني. الأعلى: الشريحة التي تحتاج إلى "تنظيف" لتصبح خاليه من انسجه الام. أسفل: نفس الشريحة المعروضة بعد ان تم تنظيفه والآن يحتوي علي اي شيء ولكن السيرة الذاتية لاستخراج الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-2
الشكل 2: الشريحة التمثيلية للنمط الجيني. الأعلى: الشريحة التي تحتاج إلى "تنظيف" لتصبح خاليه من انسجه الام. أسفل: نفس الشريحة المعروضة بعد ان تم تنظيفه والآن يحتوي علي اي شيء ولكن السيرة الذاتية لاستخراج الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

  1. اتبع بروتوكول استخراج الحمض النووي من مجموعه FFPE (جدول المواد) لاجراء استخراج الحمض النووي.
    ملاحظه: بعض مجموعات يوصي باستخدام 15 − 20 μL من العازلة التملص للهلاك النهائي. من الخبرة ، والتملص مع 15 μL من المخزن المؤقت الشطف يعمل بشكل جيد لمعظم العينات. قد يتم اعداد المخففات من الحمض النووي المخزون حسب الحاجة.
  1. التحديد الكمي للحمض النووي
    1. باستخدام جهاز المختبر الطيفي ، وتحميل 1 μL من الحمض النووي وقياس الامتصاص في 260 نانومتر للقياس الكمي.
    2. تحميل 1 μL من الحمض النووي علي 2 ٪ هلام اجنشا وتشغيل الكهربائي هلام في الجهد من 80 − 100 V للتقييم النوعي.
    3. استنادا إلى نتائج الخطوات ال1.6.1ه وال1.6.2ه ، اختر حجم الحمض النووي الذي سيتم استخدامه في مكبر الصوت المتعدد التكرار القصير الترادفي (STR) لتفاعل البلمره المتسلسل (PCR). تهدف إلى استخدام الحد الأدنى من 1000 ng من الحمض النووي في التضخيم PCR الذي يلي.
      ملاحظه: الشكل 3 يوضح أمثله تمثيليه من الهلام مع تركيزات الحمض النووي (استنادا إلى نتائج الطيف الطيفي) ، وحجم محلول الحمض النووي التي يوصي بها لمتعددة شارع PCR الذي يلي.

figure-protocol-3
الشكل 3: هلام تمثيلي لتحديد كميه الحمض النووي. وتشمل تركيزات كل حمض نووي ، كما تقاس باستخدام مقياس طيفي ، والكميات المستخدمة لمتعدد PCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

  1. التضخيم PCR
    1. أداء التنميط الجيني الميكروي الفلوري باستخدام نظام متعددالاستعمالات (جدول المواد).
    2. استخدام الشروط PCR المبينة في الشكل 4 لتضخيم pcr باستخدام متعددة STR النظام (جدول المواد).
      ملاحظه: وتستخدم الإشعال التالية في هذا النظام STR متعددة: D18S51 ، D21S11 ، TH01 ، D3S1358 ، بنتا E ، FGA ، TPOX ، D8S1179 ، vWA ، Amelogenin ، CSF1PO ، D16S539 ، D7S820 ، D13S317 ، D5S818 ، وبنتا د.

figure-protocol-4
الشكل 4: شروط دوره PCR لنظام الإرسال المتعدد STR. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

  1. حل المنتجات PCR بالكهربي الشعرية.
    1. تعليق 1 μL من كل عينه تضخيمها في 0.5 μL من الممر القياسي الداخلي لنظام تعدد الإرسال و 9.5 μL من formamide عاليه الأيونات (جدول المواد).
    2. قم بتشغيل العينات من خلال أداه الكهربي الشعرية (جدول المواد) باستخدام مصفوفة فصل مناسبه (جدول المواد) للاداه ومجموعه صبغ نظام تعدد الإرسال.
  1. تحليل البيانات
    1. تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل جزء من الحمض النووي ومقارنه الاللات الخاصة بالجينات الابويه لتحديد أصلها.
    2. قم باعداد معيار الحجم.
      ملاحظه: وهذا يسمح للبرنامج للتعرف علي السلم الذي يستخدم في متعددة STR النظام ، وتعيين باسيبيرس إلى الرموز علي أساس السلم. الخطوات التالية هي لبرنامج واحد محدد (جدول المواد) ولكن قد تكون مساعده لاعداد أنواع أخرى من البرامج أيضا.
      1. افتح البرنامج. انقر علي بدء مشروع جديد ثم علي معيار حجم جديد.
      2. إعطاء الحجم القياسي للاسم (علي سبيل المثال ، ABI_600).
      3. في المربع المسمي ادخل التعريف القياسي للحجم الجديد: ادخل ما يلي: 60 ، 80 ، 100 ، 120 ، 140 ، 160 ، 180 ، 200 ، 225 ، 250 ، 275 ، 300 ، 325 ، 350 ، 375 ، 400 ، 425 ، 450 ، 475 ، 500 ، 550 ، 600. ثم انقر علي أضافه حجم (s).
        ملاحظه: ستظهر الأرقام التي تم إدخالها تحت المربع الموجود علي اليمين ، والذي يسمي " التعريف القياسي للحجم الحالي " (انظر الشكل 5).
      4. انقر علي حفظ.
    3. لاستيراد وتحليل ملف ، انقر فوق أضافه ملفات، واختر ملف fsa ليتم تحليلها. انقر علي أضافه الملفات المحددة ثم علي OK. ثم اتبع الخطوات التالية:
      1. حدد موقع العمود القياسي للحجم واختر ABI_600 (أو أيهما اعطي الاسم إلى معيار الحجم).
      2. تحت أسلوب التحليل، انقر علي تغيير الحجم الافتراضي-الحزب التقدمي الواحد ثم انقر علي زر تحليل الخضراء.
      3. الملف جاهز الآن للعرض. اضبط خيارات العرض لعرض البيانات حسب الرغبة.
    4. استكشاف الأعطال وإصلاحها-طريقه التحليل
      ملاحظه: قد يفشل البرنامج في بعض الأحيان في تحديد القمم ومحاذاتها بشكل صحيح. يحدث هذا عندما تكون القمم اما منخفضه جدا أو مرتفعه جدا. يمكن تصحيح طريقتي التحليل التالية لهذا ويجب ان يحاكم قبل ان يتم أعاده اختبار العينة.
      1. طريقه التحليل 1 لقمم عاليه:
        1. انقر علي طريقه التحليل الجديدة واسمها قمم عاليه (أو اسم آخر وفقا لتفضيل شخصي).
        2. انقر علي نطاق ثم علي نطاق جزئي للتحليل والتحجيم. ثم اكتب في 100 لنقطه البداية وحجم البدء.
        3. بالنسبة لنقطه الإيقاف، ادخل 10,000. بالنسبة لحجم الإيقاف، ادخل 1000.
        4. ثم انقر علي مرتفعات الذروة الحد الأدنى وتغيير الأرقام بحيث عتبه الذروة للألوان كما يلي: الأزرق: 50. اللون الأخضر: 50. اصفر: 20; الأحمر: 100. البرتقالي: 5000.
        5. احفظ طريقه التحليل الجديدة.
      2. طريقه التحليل 2 لقمم منخفضه:
        1. انقر علي أسلوب تحليل جديد واسمه قمم منخفضه (أو اسم آخر وفقا لتفضيل شخصي).
        2. انقر علي نطاق ثم علي نطاق جزئي للتحليل والتحجيم. ثم اكتب في 100 لنقطه البداية وحجم البدء.
        3. بالنسبة لنقطه الإيقاف، ادخل 10,000. بالنسبة لحجم الإيقاف، ادخل 1000.
        4. ثم انقر علي علامات الجودة وتغيير نطاق التمرير بحيث يقرا من 0.5 إلى 1. تغيير نطاق جوده منخفضه بحيث يقرا من 0.0 إلى 0.0. تغيير تفترض خطيه إلى ما يلي: من (bp) 100.0 إلى (bp) 800.0.
        5. احفظ طريقه التحليل الجديدة.
          ملاحظه: فمن الممكن الآن لأعاده تحليل ملف عن طريق اختيار قمم منخفضه أو قمم عاليه تحت أسلوب التحليل ومن ثم النقر علي زر تحليل الخضراء.

figure-protocol-5
الشكل 5: لقطه شاشه تبين حجم محرر القياسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

2. تدفق الخلوي

  1. اختيار كتله FFPE المثالي
    1. باستخدام الشرائح H & E والمجهر الضوئي ، حدد كتله FFPE التي لديها حوالي 50 − 70 ٪ من الانسجه التي تتكون من السيرة الذاتية.
      ملاحظه: الشكل 6 مثال تمثيلي لكتله مناسبه لتحليل التدفق الخلوي ، كما انه يتكون من تقريبا 50 ٪ CV (النصف الأيمن من القسم) و 50 ٪ انسجه الام (النصف الأيسر). ووجود انسجه الام أمر مهم لأنها تشكل مراقبه داخلية لذروه الديبلويد.
    2. للكتل التي لا تملك القدر المثالي من السيرة الذاتية ، إثراء لcv كما يتم تنفيذ العملية. للقيام بذلك ، وتحديد الجانب من المقاطع قطع حديثا يحتوي علي المزيد من السيرة الذاتية وفقا لشريحة H & E المقابلة. واستنادا إلى ذلك ، استخدم شفره لقطع النصف الآخر الذي يحتاج إلى التخلص منه من أجل إثراء السيرة الذاتية.
      ملاحظه: يظهر الشكل 7 كتله ليس لديها السيرة الذاتية الكافية لتحليل تدفق الخلوي. لكتل مثل هذا واحد ، والأقسام تحتاج إلى ان تقطع بحيث يتم التخلص من النصف الذي يحتوي علي السيرة الذاتية اقل من أجل زيادة كميات السيرة الذاتية فيما يتعلق انسجه الام ، كما هو مبين في الشكل. تاكد من قطع المزيد من المقاطع لتعويض ما يتم تجاهله.

figure-protocol-6
الشكل 6: القسم H &Amp; E الذي يمثل الكتلة التي تعتبر مثاليه لقياس التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-7
الشكل 7: القسم H &Amp; E الذي يمثل كتله أكثر صعوبة لقياس التدفق الخلوي. يوضح هذا القسم H & E الممثل انه يجب استخدام النصف السفلي فقط من هذا القسم لتحليل التدفق الخلوي ، بهدف إثراء السيرة الذاتية. المنطقة المحددة ، المسمية "CV" ، تتكون في الغالب من السيرة الذاتية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

  1. اجتزاء
    1. ترك كتل علي الجليد لمده 15 دقيقه لتسهيل العملية.
    2. باستخدام أفضل كتله FFPE ممكن ، وقطع أربعه أقسام التي هي 50 μm سميكه (أو مقاطع سميكه 2 100 μm) باستخدام ميكروتومي.
      ملاحظه: لقياس التدفق الخلوي فمن الأفضل ان يكون أكثر سمكا المقاطع.
    3. في حاله ان كتله FFPE مثاليه غير متوفرة ، تهدف إلى الحفاظ علي نسبه السيرة الذاتية إلى انسجه الام مع ذلك. علي سبيل المثال ، إذا كان 30 ٪ فقط من كتله تتكون من السيرة الذاتية في حين ان بقية لديها انسجه الام ، ثم أزاله ما لا يقل عن نصف القسم الذي يحتوي علي انسجه الام واستخدام المزيد من الأقسام للتعويض (انظر الشكل 7).
    4. وضع المقاطع في الموسومة 15 مل أنابيب.
      ملاحظه: تاكد من الشريط علي التسميات لان الكواشف العضوية المستخدمة في الخطوة التالية يمكن حل وأزاله الحبر.
  2. تدفق الخلوية بروتوكول من الانسجه FFPE
    1. المغادرون والجفاف
      1. قم باجراء الغسيل التالي (الجدول 3) تحت غطاء الدخان.
      2. ملء أنبوب 15 مل مع 6 مل من كاشف المناسبة ، وفقا للترتيب المقدمة في الجدول 3 ، ترك الأقسام في الكواشف لمده كل منهما ، ثم أزاله الكاشف باستخدام شفط فراغ وماصه الزجاج باستور.
      3. بين كل خطوه ، تراجع ماصه باستور الاولي في 70 ٪ الايثانول ، ثم في الماء المقطر ، ومن ثم المضي قدما إلى الخطوة التالية.
      4. كن حذرا جدا لا لأزاله قطع من الانسجه جنبا إلى جنب مع كاشف. أماله أنبوب 15 مل إلى زاوية 60 درجه لتسهيل شفط كاشف السائل دون انسجه الرسم.
        تحذير: تحتوي السوائل المهملة علي اكسيلين وينبغي التخلص منها في حاويات نفايات اكسيلين.
    2. اعداد الحلول
      1. اعداد الحل سيترات عن طريق حل 2 غرام من حمض الستريك في 1 لتر من الماء المقطر مزدوجة. جلب الأس الهيدروجيني إلى 6. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
      2. اعداد البيبسين حل عن طريق تذويب 0.01 غرام من البيبسين في 2 مل من 9 أجزاء لكل الف كلوريد الصوديوم ، pH 1.64. هذا لعينه واحده.
        تحذير: البيبسين سامه ويمكن بسهوله تفريق وتصبح المحمولة جوا. ارتداء قناع عند التعامل مع البيبسين في شكل مسحوق ويمسح كل منطقه العمل بعد استخدامه.
      3. بروبيديوم يوديد (PI)-ريبونكليوداز اعداد حل لعينه واحده.
        1. مزيج 50 μL من PI مع 450 μL من تلفزيوني (لتمييع 10x).
        2. أضافه 50 μL من ريبونكليوداز A (1 مغ/مل) إلى الخليط. تبقي ملفوفه في إحباط في جميع الأوقات.
    3. الهضم وتلطيخ
      1. أضافه محلول سيترات 4 درجه مئوية إلى أنابيب 15 مل ثم وضع في حمام مياه 80 درجه مئوية لمده 2 ساعة.
      2. دع المحلول يبرد إلى درجه حرارة الغرفة (15 دقيقه). أزاله الحل سيترات.
      3. أضافه 6 مل من 1x تلفزيوني, دوامه, والانتظار 1 − 2 دقيقه للسماح للانسجه ليستقر إلى أسفل. أزاله 1x تلفزيوني باستخدام شفط فراغ وماصه الزجاج باستور.
      4. أضافه 1 مل من محلول البيبسين (مسخن إلى 37 درجه مئوية) ومكان في 37 درجه مئوية حمام جاف لمده 30 دقيقه. دوامه كل 10 دقيقه. اعداد الحل في الدقيقة الاخيره 10 من هذه الحضانة.
      5. أضافه 6 مل من 1x تلفزيوني, دوامه, والانتظار 1 − 2 دقيقه للسماح للانسجه ليستقر إلى أسفل. أزاله 1x تلفزيوني باستخدام شفط فراغ وماصه الزجاج باستور.
      6. أضافه 550 μL من PI-ribonase حل ووضع العينات في حمام جاف 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
        ملاحظه: عند هذه النقطة ، يمكن ان تكون ملفوفه العينات في إحباط وترك بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية حتى صباح اليوم التالي.
      7. تصفيه الحل من خلال شبكه الترشيح 48 μm. جمع الترشيح في أنابيب البوليسترين جولة القاع ، والتي يمكن استخدامها مع تدفق المضخم. استخدام ملقط لوضع 5 سم بنسبه 5 سم قطعه من شبكه الترشيح في الجزء العلوي من الأنبوب ، بحيث يمكن ان يكون السائل الأنابيب من خلال شبكه والي الأنبوب.
        ملاحظه: العينات جاهزه الآن ليتم تشغيلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي. الاحتفاظ بها ملفوفه في إحباط حتى انهم مستعدون لتشغيل.
    4. تشغيل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي بمساعده فني منصة التدفق الخلوي للمؤسسة.
      ملاحظه: يتم استخدام قناه PE للكشف عن الحمض النووي الملون PI ويجب تعيين معدل التدفق لإبطاء اثناء الاستحواذ. تاكد من ان يتم اختيار الجهد من هذا القبيل ان ذروه مضاعف هو تقريبا في 200 علي طول PE-A x-محور لتسهيل التحليل والتفسير. تهدف إلى تسجيل الحد الأدنى من 20,000 الاحداث لكل عينه.
الكاشف المستخدمة (6 مل لكل منهما)مده
1) اكسيلين2 × 10 دقيقه
2) 100 ٪ الايثانول2 × 10 دقيقه
3) 95 ٪ الايثانول10 دقائق
4) 70 ٪ الايثانول10 دقائق
5) 50 ٪ الايثانول10 دقائق
6) الماء المقطر2 × 10 دقيقه

الجدول 3: الكواشف وفترات المغادرين والجفاف.

  1. تحليل بيانات التدفق الخلوي
    1. تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل التدفق الخلوي (جدول المواد).
      ملاحظه: الخطوات التالية هي لبرنامج واحد محدد (جدول المواد) ولكن قد تكون مساعده لاعداد أنواع أخرى من البرامج أيضا.
      1. بعد تشغيل العينات علي مقياس التدفق الخلوي ، تحميل FCS 2.0 ملفات للتحليل.
      2. افتح برنامج تحليل التدفق الخلوي ، انقر علي الملف | مستند جديد.
      3. انقر فوق رمز الرسم البياني (figure-protocol-8) ، ثم اسحب المؤشر لجعل مستطيل.
      4. استعرض للحصول علي ملف FCS ثم انقر فوق فتح. علي طول المحور س ، انقر علي FCS-a ثم حدد PE-a.
      5. انقر فوق رمز نقطه المؤامرة (figure-protocol-9) ثم قم بسحب المؤشر لإنشاء مستطيل آخر تحت مخطط الرسم البياني. ثم استعرض للحصول علي نفس الملف FCS التي تم تحديدها للرسم البياني.
      6. تغيير المحور س من مؤامرة نقطه إلى pe-A ومحور ص إلى pe-W.
        ملاحظه: يبين الشكل 8الف مظهر المؤامرات في هذه المرحلة.
      7. انقر علي أيقونه المنطقة (figure-protocol-10) ورسم مربع علي مؤامرة نقطه التي تبدا قبل ذروه مضاعف (حوالي 100 علي المحور س في الشكل 8ب) والتي تنتهي حول 700 علي محور x ، كما هو مبين في مؤامرة نقطه في الشكل 8 باء-
        ملاحظه: الذروة مضاعف في الشكل 8 تقريبا في 200 علي المحور س. يتم اختيار هذا تعسفا كما يتم تسجيل العينات من خلال تدفق الخلوي ، وذلك ببساطه لتسهيل تحليل وتفسير النتائج.
      8. انقر علي مؤامرة | حرر المناطق/البوابات، ثم اكتب R0 في الخلية المجاورة للخلية الG0ه ضمن الاستراتيجية. ثم انقر علي إغلاق.
      9. انقر في اي مكان علي الرسم البياني ، ثم علي مؤامرة | تنسيق الرسم/التراكب. تحت البوابة، حدد G0 = R0 ثم انقر علي OK.
        ملاحظه: هذه هي الخطوة النابضة التي تسمح للمرء ان تصور أفضل القمم صيغه الصبغيه. يجب ان تبدو المدرج التكراري الآن مثل الرسم البياني في الشكل 8B. فمن الممكن ان تلعب حولها مع البوابة التي تم إنشاؤها (عن طريق تحريك مربع رسمها في الخطوة 2.4.1.7) من أجل التركيز علي مناطق محدده من مؤامرة نقطه.
      10. لتسميه المؤامرات ، انقر فوق رمز منطقه النص (figure-protocol-11) ، ثم اسحب المؤشر لإنشاء مربع في اعلي المستند ، ثم اكتب في المعلومات التالية: معرف المريض ، معرف الاتصال الشخصي والكتلة المستخدمة (لأنه قد يكون هناك عده كتل لواحده منها) ، والنسبة المئوية السيرة الذاتية الموجودة علي كتله ، والجهد المستخدم لتشغيل العينة ، والتاريخ.

figure-protocol-12
الشكل 8: لقطه شاشه تعرض رسما بيانيا ومؤامرة نقطية لعينه تمثيليه غير مسوره (a) ومسوره (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعقيد الانسجه المولية وحقيقة انها قد يكون لها مختلف الأنماط الجينية يتطلب تحليلا صارما واستخدام عده طرق مثل التقييم المورفولوجية ، p57 مناعي ، التنميط الجيني الميكروي ، والتدفق الخلوي ، والأسماك. علي سبيل المثال ، تمت أحاله مريض واحد (1790) مع اثنين phm التي تم العثور عليها لتكون منشا بتحليل ميكروصفيف من pocs فقط. ولذلك تم تشخيص المريض مع PHM المتكررة. وكشف التنميط الجيني الميكروي لاثنتينين من "PHM" جنبه مع الحمض النووي للمريض وشريكها انه في حين ان الشامة الاولي للمريض هي تشتت ثلاثي اللون...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HM هي حالات الحمل البشري غير الطبيعية مع المسببات غير المتجانسة ولها أنواع مختلفه من الانسجه والأنماط الجينية ، مما يجعل تصنيفها الدقيق والتشخيص الصعب. وغالبا ما ثبت ان التقييم المورفولوجية غير دقيق وغير موثوق به من تلقاء نفسه لتصنيف HM في اليه تبادل أليات و PHM وتمييزها عن الإجهاض غير المولي. ولذلك ، فان التشخيص الدقيق لHM يتطلب استخدام أساليب أخرى مثل التنميط الجيني للحمض النووي المتعدد الإرسال المتعدد ، وتحليل الصيغة الخلوية بواسطة قياس التدفق ، والتحليل اللوني بواسطة FISH ، و p57KIP2 مناعي. كل من هذه الطرق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفان صوفي باترير وماريان باريسي لمشاركتهما بروتوكول التدفق الخلوي الأصلي ، و Promega و Qiagen لتوفير الإمدادات والكاشفات. وقد حظي هذا العمل بدعم من الهيئة الكندية لأعاده الإنتاج والمعهد الR.S. للبحوث الصحية (MOP-130364) إلى المركز الكوري لبحوث الصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BD FACS Canto IIBD BioSciences338960
أداة الرحلان الكهربائي الشعري: الجينوم Applied Biosystems 3730xl محلل الحمض النوويالأنظمة الحيوية التطبيقية313001Rالخدمة التي يقدمها مركز علم الجينوم التطبيقي
(http://www.tcag.ca)
حمض الستريكSigma251275
Cytoseal 60 ، وسط تركيب علم الأنسجةالمرضي فيشر23244257
حل مخزون Eosin Y (1٪)FisherSE23-500D
FCSalyzer - برنامج تحليل قياس التدفق الخلويSourceForge-https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen kitQiagen80234
ملقطأدوات العلوم الدقيقة11295-51للتقطيع ولعملية التنظيف
الجليدية حمض الخليك (المركز)SigmaA6283-500mL
أغطية زجاجية: غطاء زجاجيفيشر12-541a
هيماتوكسيلينفيشرCS401-1D
فورماميد منزوع الأيونات للغاية: Hi-Di FormamideThermofisher4311320
منصة IHC: المعيار UltraRoche-Kimwipes
Ultident30-34120
MicrotomeLeicaRM2135
شفرات MicrotomeFisher12-634-1C
ترشيح Nitex ، 48 & mu ؛ مFilmar74011http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ؛ أي مرشح آخر مناسب ، ولكن هذا خيار غير مكلف وفعال من شركة غير بحثية
p57 للجسم المضادCell Marque457M
Pasteur ماصةVWR53499-632
آلة PCRPerkin Elmer ، نظام Biosystems AppliedGeneAmp PCR 9700
برنامج PeakScanner 1.0Applied Biosystems4381867لتحليل التنميط الجيني.
البيبسين من الغشاء المخاطي للمعدة الخنازيرSigmaP7012
أنابيب البوليسترين المستديرة القاعBDFalcon 352058
شرائح موجبة الشحنة: Superfrost Plus 25x75mmفيشر1255015
PowerPlex 16 HS SystemPromega CorporationDC2102
Propidium IodideSigmaP4864
ريبونوكلياز أ من البنكرياس البقريمصفوفة الفصل
: POP-7 بوليمرثيرموفيشر4352759
UltraPureAgarose Fisher16500-500
XyleneFisher X3P1GAL
شبكة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
  2. Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
  3. Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
  4. Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy? Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
  5. Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
  6. Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
  7. Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
  8. Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
  9. Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
  10. Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
  11. Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
  12. Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
  13. Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
  14. Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
  15. Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
  16. Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA p57KIP2

مقالات ذات صلة