جيل من الخنازير الخصيتين مع الهندسة المعمارية الخاصة بالخصية باستخدام الثقافة Microwell

في السنوات الاخيره ، كان هناك تجدد الاهتمام في ثلاثي الابعاد (3D) الهيكل التنظيمي. وقد تم اشتقاق أجهزه مختلفه مثل الأمعاء¹، المعدة²، البنكرياس^3،4، الكبد⁵، والدماغ⁶ بنجاح إلى أنظمه organoid 3d. هذه العضوية لديها أوجه التشابه المعمارية والوظيفية للأعضاء في الجسم الحيوي وأكثر اهميه بيولوجيا لدراسة البيئة المجهرية الانسجه من النظم الثقافية أحاديه الطبقة⁷. ونتيجة لذلك ، وقد بدات organoids الخصية لكسب الفائدة كذلك^{8،9،10،11،12}. معظم الطرق المبلغ عنها حتى الآن هي معقده, غير عاليه الانتاجيه¹⁰ وتتطلب أضافه البروتينات ECM^8,10. هذا التعقيد يؤدي أيضا إلى مشاكل مع استنساخ. وهناك حاجه إلى طريقه بسيطه وقابله للاستنساخ التي تسمح للجيل من الخصية العضوية مع الجمعيات الخلية التي هي مثل الخصية في الجسم الفيفو.

وقد أبلغنا مؤخرا عن نظام لمعالجه هذه المتطلبات¹². باستخدام خنزير كنموذج ، استخدمنا الطرد المركزي القسري نهج التجميع في نظام microwell. في ال [ميكروسس] نظامه, يحتوي كل بئر [ا لرج نومبر] من متماثلة صغيره ميكروويلس¹³. هذا يسمح للجيل من يتعدد خزان من حجم متسقة. وقد مكن نظام microwell من توليد اعداد كبيره من الهيكل التنظيمي الموحد مع بنيه خاصه بالخصية. النظام بسيط ولا يتطلب أضافه بروتينات ECM.

ملاحظه: تم الحصول علي الخصيتين من الخنازير التي تبلغ من العمر أسبوعا واحدا من مزرعة خنازير تجاريه كمنتج ثانوي من خصاء الخنازير التجارية. تمت الموافقة علي مصادر الخصيتين من قبل لجنه الرعاية الحيوانية في جامعه كالغاري.

1. اعداد حلول الانزيم لهضم الانسجه

ملاحظه: هناك حاجه إلى ثلاثه حلول الانزيميه المختلفة ، والتي تشمل اثنين من الحلول الرابعة كولاجيناز مختلفه (الحل A ، B) والحل deoxyribonbenase i (dnase 1).

1. لاعداد الحل A ، حل 20 ملغ من كولاجيناز IV S (جدول المواد) و 40 ملغ من كولاجيناز iv W (جدول المواد) في 25 مل من الجلوكوز العالي دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (dmem). ثم تصفيه تعقيم مع فلتر 0.22 μm. أضافه 0.4 مل من مصل الأبقار الجنينية (الدم) للحل A لمنع النشاط التريبسين.
2. لاعداد الحل ب ، حل 80 ملغ من كولاجيناز IV W (جدول المواد) في 40 ML من dmem. ثم تصفيه تعقيم مع فلتر 0.22 μm.
3. لاعداد DNase انا الحل (7 ملغ/مل) ، حل 70 ملغ من DNase انا في 10 مل من DMEM. ثم تصفيه تعقيم مع فلتر 0.22 μm.
   ملاحظه: تركيز الانزيم للحلول الرابعة كولاجيناز المبينة هنا ، يختلف من تركيزات (2 مغ/مل) المذكورة في المادة¹⁴الاصليه. وينتج البروتوكول الحالي خلايا ذات قدره اعلي قليلا علي البقاء. ومع ذلك ، فان الخلايا المعزولة بواسطة كلا البروتوكولين تنتج organoids ذات بنيه نسيجيه متطابقة.

2. الخصية الهضم الانزيمي الانسجه

1. جمع الخصيتين في كوب معقمه ويغسل مع الفوسفات مخزنه المالحة (برنامج تلفزيوني) التي تحتوي علي 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين (P/S). بعد الغسيل ، نقل الخصيتين إلى صحن ثقافة الانسجه مم 100 مع برنامج تلفزيوني يحتوي علي 1 ٪ P/S وأزاله غلاله المهبل والبربخ باستخدام مقص الاوتوكلاف وملقط. نقل الخصيتين معزولة إلى طبق جديد 100 مم ويغسل جيدا مع برنامج تلفزيوني يحتوي علي 1% P/S.
2. للمحافظة علي العقم ، استخدمي مجموعه أخرى من المقصات المعقمة والملقط لتقشير الخصيتين للخروج من البوغينيا التونيكا. قطع الخصيتين علي طول المحور الطولي مباشره تحت tunica. ثم قشر الخصيتين من غلاله باستخدام اثنين من ملقط ومكان في صحن جديد 100 مم يحتوي علي 1 مل dmem مع 1% P/S.
3. المفروم الخصيتين مقشر مع مقص العقيمة في قطع الانسجه مم 1-2. بعد التقطيع ، استخدم ملقط معقم لأزاله الشظايا البيضاء من النسيج الضام.
4. نقل قطع الانسجه المفرومة إلى الحل a واعليه يصل إلى 50 mL مع dmem للحصول علي تركيز 0.4 ملغ/مل ل كولاجيناز iv S (جدول المواد) وتركيز 0.8 ملغ/مل ل كولاجيناز iv W (جدول المواد). مكان الحل A تحتوي علي قطع الانسجه في حمام ماء 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه ، وعكس بلطف أنابيب كل 5 دقائق والتحقق بصريا للإفراج عن الحمض النووي.
   1. أضافه 500 μL من DNase انا إذا لوحظ الحرة الحمض النووي العائمة. بعد 30 دقيقه ، الطرد المركزي أنبوب في 90 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 1.5 دقيقه وتجاهل supernatant.
      ملاحظه: الحمض النووي سيظهر كماده غائمة. عندما تهتز الأنابيب ، تستقر قطع الانسجه في حين ان الحمض النووي سيبقي واقفا علي قدميه.
5. أضافه الحل B إلى أنبوب واعلي تصل إلى 50 mL مع DMEM للحصول علي تركيز 1.2 ملغ/مل من كولاجيناز IV W (جدول المواد). وضع أنبوب في 37 درجه مئوية حمام المياه لمده 30 دقيقه وعكس بلطف أنبوب كل 5 دقائق. أضافه 500 μL من DNase انا إذا لوحظ الحرة الحمض النووي العائم.
6. بعد 30 دقيقه ، الطرد المركزي أنبوب في 90 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 1.5 دقيقه. بعد ذلك تجاهل ماده طافي ويغسل مره واحده مع برنامج تلفزيوني مع 1 ٪ P/S.
   ملاحظه: ستحتوي المواد الفائقة المهملة من كلا الحلين A و B علي خلايا بينيه في المقام الأول.
7. اعلي الأنبوب مع تلفزيوني يصل إلى 50 mL. جمع بعناية الأنابيب من اعلي ومكان في أنبوب 50 mL جديده.
   ملاحظه: الأجزاء الكبيرة من الانسجه غير المهضومة تستقر بسرعة في الجزء السفلي ، في حين ان الأنابيب المنوية المهضومة ستبقي في التعليق. لا ينبغي جمع شظايا الانسجه الكبيرة. ويمكن تكرار هذا الاجراء عده مرات حتى الحل في الأنبوب الأصلي هو واضح تقريبا وفقط شظايا الانسجه غير المهضومة المتبقية ، والتي يمكن التخلص منها.
8. الطرد المركزي الأنابيب في 90 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 1.5 دقيقه وتجاهل supernatant. أضافه تلفزيونيه جديده والطرد المركزي مره أخرى. كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
9. بعد غسل تلفزيوني الماضي ، وأزاله ماده طافي وأعاده تعليق الأنابيب المنوية في 5 مل من تلفزيوني. ثم أضافه 15 مل من 0.25 ٪ التريبسين-ايثيلنديدياتيتاياستيك حمض (أدتا) إلى الأنابيب. وضع أنبوب في 37 درجه مئوية حمام المياه وعكس بلطف كل 2 دقيقه. إذا لوحظ الكثير من الحمض النووي العائمة الحرة ، أضافه 500 μL من DNase I مع 5 مل من DMEM.
10. تقييم الهضم الانزيمي من الأنابيب إلى خلايا واحده تحت المجهر (الأول بعد 5 دقائق ، ثم كل 2 دقيقه). إذا كان يمكن الكشف عن خلايا واحده في الغالب ، ووقف رد فعل مع 5 مل من وفلتر من خلال شبكه 70 μm ومن ثم من خلال شبكه 40 μm.
    ملاحظه: ينبغي الحرص علي ان القبعات علي أنابيب 50 mL المستخدمة لهضم (الحل A ، B و 0.25 ٪ تريبسين-أدتا) يتم تشديد بشكل صحيح. إذا كان التلوث في حمام المياه هو مصدر قلق ، قد تكون ملفوفه فيلم البارافين حول الغطاء لضمان العقم.
11. الطرد المركزي الخلايا الواحدة في 500 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، أعاده التعليق في وسط الإثراء (دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة F/12 (Dmem/F12) التي تحتوي علي 5 ٪ من الطراز الأول و 1 ٪ P/S) وحساب عدد الخلايا قابله للحياة. هذه هي الخلية البداية السكان. إصلاح 100 x 10³ خلايا وأداء المناعية لعلامة الخلية الجرثومية UCHL1 (اوبيكويتين C-الطرفية Hydrolase L1) كما هو موضح¹² وتحديد النسبة المئوية للخلايا الجرثومية في هذه الخلايا البداية السكان.
    ملاحظه: يمكن أيضا استخدام علامة الخلية الجرثومية برويلتيتيك ابيضاض الدم الزنك البروتين الاصبع (PLZF)¹⁵ كبديل مناسب ل UCHL1. في الخلية البداية السكان ، والعائد الخلية المتوقعة حول 700-800 x 10⁹/g من الانسجه. وينبغي ان تكون النسبة المئوية للخلايا الجرثومية في هذا العدد من الخلايا 4-5 في المائة.
12. وضع حوالي 20 × 10⁶ من هذا السكان خليه البداية في اثنين من المرفقات منخفضه جدا 100 mm الاطباق بيتري (10 × 10⁶ الخلايا المعلقة في 10 مل من dmem/F12 التي تحتوي علي 1% P/S في كل طبق) لمده 2 أيام في حاضنه الانسجه ثقافة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO₂، 21 ٪ الأكسجين). اجراء تخصيب الخلايا الجرثومية مع الخلايا المتبقية.
    ملاحظه: لضمان السلامة المثلي ونوعيه الخلية ، في حين ان تخصيب الخلايا الجرثومية والكمية اللاحقة يحدث ، يتم وضع السكان خليه البداية في الثقافة في الاطباق المنخفضة جدا المرفقات ثقافة الانسجه لمده 2 أيام.

3-إثراء الخلايا الجرثومية

ملاحظه: الاجراء الموصوف أعلاه ينتج في المقام الأول خلايا سيرتولي والخلايا الجرثومية. خصائص التصاق مختلفه تسمح للفصل بين خلايا سيرتولي والخلايا الجرثومية عن طريق الطلاء التفاضلي.

1. البذور 20-25 x 10⁶ خلايا من السكان خليه البداية لكل 100 ملم الانسجه ثقافة الطبق في الحجم الإجمالي لل 8 مل من الإثراء المتوسطة (Dmem/F12 مع 5% المدفع و 1% P/S) للطلاء التفاضلي. وضع الخلايا في حاضنه (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO₂، 21 ٪ O₂) وبعد 1.5 h ، وضمان ان معظم الخلايا سيرتولي نعلق علي لوحه.
2. جمع والجمع بين ماده طافي (التي تحتوي أساسا علي الخلايا الجرثومية) من 2 لوحات للوحه واحده جديده 100 مم ووضعه مره أخرى في الحاضنة. بعد 1 ح ، مره أخرى الجمع بين ماده طافي من 2 لوحات إلى لوحه جديده مم 100. وضع لوحات مره أخرى في الحاضنة لليله وضحيها.
   ملاحظه: ستحتوي المواد الفائقة مجتمعه في المقام الأول علي خلايا جرثوميه. الخلايا الملتصقة التي يتم تجاهلها مع لوحات هي في المقام الأول خلايا جسديه الخصية مثل سيرتولي و بيريتوبولار myoid الخلايا.
3. جمع الخلايا الجرثومية المخصب في اثنين من الكسور علي النحو التالي.
   ملاحظه: الخلايا الجرثومية المخصبة تلتزم بشكل مختلف ، وكسر غير ملتصقة وجزء التمسك قليلا. كلا هذه الكسور تشكل معا سكان الخلايا الجرثومية المخصب
   1. كسر غير ملتصقة: جمع سوبرناتنت.
   2. كسر ملتصقة قليلا: غسل لوحات برفق مع تلفزيوني ، وعلاج مع 2 مل من 1:20 التخفيف من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة ، ووقف رد الفعل مع 2 مل من الإثراء المتوسطة وجمع في نفس الأنبوب كجزء غير ملتصقة.
      ملاحظه: 0.25 ٪ تريبسين-أدتا يحتاج إلى ان تضعف مع تلفزيوني لإنتاج حل التريبسين 1:20.
4. حساب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام عداد خليه ، وإصلاح 100 x 10³ خلايا وتنفيذ المناعية لعلامة الخلية الجرثومية UCHL1 كما هو موضح¹² وتحديد النسبة المئوية للخلايا الجرثومية في هذه الخلايا المخصب السكان.
   ملاحظه: يجب ان تكون النسبة المئوية للخلايا الجرثومية في هذا العدد من الخلايا 60-70% علي الأقل. منذ المناعية للقياس الكمي سوف تتطلب 1 يوم ، يجب وضع الخلايا المخصب في المرفق منخفضه جدا 100 mm طبق بيتري مع DMEM/F12 تستكمل مع 1 ٪ P/S لمده لضمان جوده الخلية الأمثل والقدرة علي البقاء.

4. اعداد الخلايا لبذر

1. لحصاد اعداد خليه البداية ، وجمع ماده طافي في أنبوب 50 mL من المرفقات منخفضه جدا 100 mm الاطباق. غسل لوحات بقوة مع تلفزيوني لجمع الخلايا الملتزم بها. لا حاجه إلى الهضم الانزيمي.
   ملاحظه: بعض خلايا الخصية ، في المقام الأول خلايا سيرتولي ، يمكن ان تلتزم قليلا إلى لوحات المرفقات منخفضه جدا.
2. الجمع بين اعداد خليه البداية والخلايا الجرثومية المخصب للحصول علي اعداد خليه العمل التي تحتوي علي 25 ٪ من الخلايا الجرثومية. أجهزه الطرد المركزي في 500 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، وتجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في تشكيل المتوسطة (dmem/F12 تستكمل مع الانسولين 10 ميكروغرام/مل ، ترانسفيرين 5.5 ميكروغرام/مل ، السيلينيوم 6.7 ng/ml ، 20 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة ، 1 ٪ P/S). ضبط كثافة الخلية إلى 2.4 x 10⁶ لكل مل.
   ملاحظه: كل بئر في لوحات microwell المستخدمة¹³ في هذا البروتوكول الواردة 1,200 ميكروويلس.
3. استخدم الصيغة أدناه لحساب عدد الخلايا في البئر كما هو موضح أدناه.
   عدد الخلايا لكل بئر = عدد ميكروويلس x عدد الخلايا التي سيتم تجميعها لكل organoid.
4. لتوليد العضوية من 1000 خليه لكل منهما ، البذور مع كل (1,200 x 1,000 خلايا كل =) 1.2 × 10⁶ خلايا. اضبط كثافة الخلايا في تعليق الخلية بطريقه يتم فيها بذر الخلايا في حجم 0.5 مل من المتوسط. ل organoids شكلت من 1,000 خلايا كل ، استخدام كثافة 2.4 x 10⁶ خلايا لكل مل (1.2 × 10⁶ خلايا في 0.5 مل).

5-اعداد ميكروويلس لاستقبال الخلايا

ملاحظه: للتاكد من ان الخلايا لا تلتزم سطح microwell ، وعلاج مع محلول الشطف السطحي الذي هو متاح للشراء من قبل الشركة المصنعة.

1. أضافه 0.5 mL من محلول الشطف لكل بئر. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين في البئر. لأزاله فقاعات الهواء ، ان وجدت ، الطرد المركزي لوحه في 2,000 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 2 دقيقه.
2. مراقبه لوحه تحت التكبير المنخفض المجهر المقلوب ، للتحقق من ان الفقاعات قد أزيلت من ميكروويلس. إذا لوحظت فقاعات المحاصرين ، الطرد المركزي مره أخرى في 2,000 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 2 دقيقه لأزاله اي فقاعات المتبقية.
3. غطي الصفيحة بالغطاء والحضن لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. بعد العلاج كامله ، وأزاله محلول الشطف ويغسل علي الفور لوحه مع الماء المعقم أو تلفزيوني. تاكد من ان لوحه لا تجف بعد العلاج مع محلول الشطف.

6. جيل من الخصية العضوي

1. أضافه 0.5 mL من التشكيل العضوي المتوسطة (بدون اي خلايا) لكل بئر والطرد المركزي في 2,000 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 2 دقيقه لأزاله اي فقاعات الهواء المحاصرين. لاحظ البئر تحت المجهر المقلوب منخفض التكبير للتحقق من ان فقاعات الهواء قد أزيلت. إذا لوحظت فقاعات المحاصرين ، الطرد المركزي مره أخرى في 2,000 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 2 دقيقه لأزاله اي فقاعات المتبقية.
2. أضافه 0.5 mL من تعليق الخلية العاملة وتخلط بلطف عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا. أجهزه الطرد المركزي في 500 x ز مع الفرامل في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق. استخدم المجهر المقلوب للتحقق من ان الخلايا تتجمع داخل الميكروويلس.
3. نقل لوحه إلى حاضنه ثقافة الخلية والثقافة لمده 5 أيام. تغيير نصف المتوسطة كل يوم.
   1. لتغيير المتوسطة دون فقدان اي organoids ، لمس طرف الماصة إلى جدار البئر واقل برفق للمس الغضروف المفصلي ورسم الوسط ببطء. تاكد من اتباع الغضروف المفصلي لأنه يسقط. لأضافه المتوسطة الطازجة ، لمس طرف الماصة إلى جدار البئر علي نفس الجانب مثل السحب المتوسط وأضافه المتوسطة الطازجة بلطف ضد جدار البئر ، مما يسمح لها بالتدفق ببطء إلى أسفل الجدار.
4. لاستعاده الهيكل العضوي ، ماصه برفق المتوسطة صعودا وهبوطا باستخدام ماصه الفم واسعه. هذا من شانه ان يسمح لل organoids للخروج من الميكروويلس.
5. جمع organoids ، وغسل مع تلفزيوني ، وإصلاح وأداء المناعية لعلامة الخلية الجرثومية (ش-L1) ، سيرتولي علامة الخلية (غاتا البروتين ملزمه 4-GATA4) ، بيريتوبولار myoid علامة الخلية (α السلس العضلات Actin-αSMA) وعلامة خليه Leydig (سيتوكروم P450-CYP450) كما هو موضح¹² وتصور تحت المجهر البؤري.

الخلايا المعزولة من الخصيتين الخنازير القديمة التي تم استزراعها في الميكروويلس المنظم ذاتيا في خزان (الشكل 1ا، الشكل 2) ، مع الخارجية المحددة والمتميزة (ظهاره اللاهوتية) والمقصورات الداخلية ( انترستيتيوم) (الشكل 1(ب) ، الشكل 2). تم فصل المقصورات اثنين من قبل الكولاجينIV + ve غشاء الطابق السفلي. وكانت الخلايا الجرثومية-L1 + ve وGATA4 + ve سيرتولي الخلايا في المقصورة الخارجية علي غشاء الطابق السفلي (الشكل 1ب، الشكل 2). α-SMA + ve بيريتوبولار وكانت الخلايا myoid المترجمة علي طول الداخل من غشاء الطابق السفلي في حين سيتوكرومP450 + ve leydig الخلايا كانت في وسط الانترستيتيوم (الشكل 1ب، الشكل 2). ويشبه هذا الهيكل (الشكل 2) الظروف الموجودة في الموقع (الشكل 1ج) ، حيث توجد خلايا leydig ، بيريتوبولار myoid الخلايا في الانترستيتيوم في المقصورة الخلالي ؛ والخلايا الجرثومية ، وتقع خلايا سيرتولي في ظهاره اللاهوتية.

الشكل 1: المجهرية المشتقة من الخصيتين تظهر البنية النسيجية الخاصة بالانسجه ذات التضاريس المقلوبة. (ا) خلايا الخصية الخنازير في 0, 3, و 5 أيام من الثقافة ميكروحسن. (ب) الصور المناعية لاشكال الخصية التي تحدد أنواع خلايا محدده: خلايا سيرتولي (GATA4) ، غشاء الطابق السفلي (الكولاجين الرابع) ؛ الخلايا الجرثومية (أوش-L1) ؛ بيريتوبولار myoid الخلايا (α-SMA); خلايا leydig (CYP450). (ج) المظهر النسيجي (H & E) والتمثيل التخطيطي لخصيه الخنزير التي تبلغ من العمر أسبوعا واحدا. يتم الاشاره إلى أنواع الخلايا المحددة بالأسهم المناظرة. قضبان المقياس = 50 μm. وقد عدل هذا الرقم من ساكيب وآخرون12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التمثيل التخطيطي للتكوين العضوي. خلايا الخصية الوحيدة المعزولة يتم بذرها واستزراعها في ميكروويلس لمده 5 أيام لإنتاج اورجانويدات الخصية. وقد عدل هذا الرقم من ساكيب وآخرون12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الدكتور اونغرين لديه مصلحه مالية في التكنولوجيا AggreWell كمخترع.