مقالة منهجية

في المختبر أعاده تشكيل الخلية المكانية أنماط الاتصال مع المعزولة Caenorhabditis الاجنه البدائية والخرز البوليسترين لاصقه

DOI:

10.3791/60422

⸱

نوفمبر 26, 2019

 ,  , 
1Department of Zoology, The University of British Columbia, 2Life Sciences Institute, The University of British Columbia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعقيدات الانسجه من أنظمه متعددة الخلايا العثور علي تحديد العلاقة السببية بين العظة خارج الخلية والسلوكيات الخلوية الفردية. هنا ، نقدم طريقه لدراسة الصلة المباشرة بين الإشارات التي تعتمد علي الاتصال ومحاور القسمة باستخدام الكريات البدائية الجنينية c. والخرز البوليسترين لاصقه.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في النظم متعددة الخلايا ، وتحيط الخلية الفردية من العظة الفيزيائية والكيميائية المختلفة القادمة من الخلايا المجاورة والبيئة. وهذا التعقيد النسيجي يخلط بين تحديد العلاقة السببية بين العظة الخارجة والديناميكيات الخلوية. ويتغلب النظام المتعدد الخلايا المعاد تشكيله بشكل صناعي علي هذه المشكلة من خلال تمكين الباحثين من اختبار جديلة معينه مع القضاء علي الآخرين. هنا ، نقدم طريقه لأعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية مع معزولة Caenorhabditis البدائية والخرز البوليسترين لاصقه. وتشمل الإجراءات أزاله قشر البيض ، وعزل الخلايا البدائية عن طريق تعطيل التصاق خليه الخلية ، واعداد الخرز البوليسترين لاصقه ، وأعاده تشكيل خليه خليه أو خليه حبه الاتصال. وأخيرا ، نقدم تطبيق هذه الطريقة للتحقيق في اتجاه محاور الانقسام الخلوية التي تساهم في تنظيم الزخرفة الخلوية المكانية ومواصفات مصير الخلية في تطوير الاجنه. تمكن هذه الطريقة القوية والقابلة للتكرار ومتعددة الاستعمالات في المختبر من دراسة العلاقات المباشرة بين أنماط الاتصال بالخلايا المكانية والاستجابات الخلوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال التنمية متعددة الخلايا ، يتم تحديد السلوكيات الخلوية (علي سبيل المثال ، محور القسمة) للخلايا الفردية بواسطة الإشارات الكيميائية والفيزيائية المختلفة. لفهم كيفيه الخلية الفردية يفسر هذه المعلومات ، وكيف انها تنظم التجمع متعدد الخلايا كخاصيه الناشئة هي واحده من الأهداف النهائية للدراسات التكوين. وقد ساهم الكائن النموذجي c. اليجانسيس بشكل كبير في فهم التنظيم علي مستوي الخلوية من تخلق مثل قطبيه الخلية1، الخلية تقسيم زخرفه1، الخلية مصير القرار2، واللوائح علي نطاق الانسجه مثل الأسلاك العصبية3 والعضوي4،5. علي الرغم من وجود العديد من الاداات الجينية المتاحة ، فان أساليب هندسه الانسجه محدوده.

طريقه هندسه الانسجه الأكثر نجاحا في الدراسة c. اليجايليس هو العزلة الكلاسيكية البدائية6; كما ج. وتحيط الاجنه الجنينية بقشره البيض وحاجز نفاذيه7، وأزالها هي واحده من الإجراءات الرئيسية لهذا الأسلوب. في حين ان هذه الطريقة العزلة الاريميه تمكن من أعاده الاتصال خليه خليه بطريقه مبسطه ، فانه لا يسمح للقضاء علي العظة غير المرغوب فيها ؛ الاتصال الخلية لا تزال تشكل كلا الميكانيكية (علي سبيل المثال ، التصاق) والعظة الكيميائية ، مما يحد من قدرتنا علي تحليل كامل للعلاقة السببية بين السلوك جديلة والخلوية.

تستخدم الطريقة المعروضة في هذه الورقة حبات البوليسترين المعدلة الكربوكسيل التي يمكن ان ترتبط بشكل خاص بأي جزيئات الأمين-التفاعلية بما في ذلك البروتينات كما ligands. علي وجه الخصوص ، استخدمنا شكل أمين التفاعلية من رومامين الأحمر-X باعتبارها يجند لجعل الخرز علي حد سواء بصريا تتبعها ولاصق إلى الخلية. وتقترن مجموعات الكربوكسيل من السطح حبه ومجموعات أمين الاوليه من الجزيئات القابلة للذوبان في الماء كربوديوميد 1-ايثيل-3-(ديميثيلامينوبروبيل) كربوديوميد (edac)8،9. الحصول علي حبات لاصقه تسمح للآثار من جديلة الميكانيكية علي ديناميات الخلوية10. لقد استخدمنا هذه التقنية لتحديد الإشارات الميكانيكية المطلوبة لتوجيه انقسام الخلية10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اعداد حبه البوليسترين لاصقه

ملاحظه: هذا البروتوكول لا يتطلب تقنيه العقيم.

  1. تزن 10 ملغ من الخرز البوليسترين المعدلة الكربوكسيل في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL.
  2. لغسل الخرز ، أضافه 1 مل من 2-(ن-مورفينو) حمض اثانيسولفونيك (MES) العازلة في الأنبوب. منذ MES العازلة لا تحتوي علي الفوسفات والخلات ، والتي يمكن ان تقلل من تفاعل كربوديوميد ، وهي مناسبه للاستخدام في تفاعل البروتين اقتران. دوامه الأنبوب لخلط الخرز.
  3. تدور الانبوبه ل 60 s في 2,000 x g عبر أجهزه الطرد المركزي بينتوب.
  4. تجاهل ماده طافي عن طريق الأنابيب بعناية خارج المخزن المؤقت.
  5. غسل الخرز مره أخرى مع 1 مل من المخزن المؤقت MES عن طريق الخطوات التالية 1.2-1.4.
  6. أضافه 1 مل من العازلة MES التي تحتوي علي 10 ملغ من EDAC في أنبوب لتنشيط مجموعات الكربوكسيل السطحية. دوامه الأنبوب لخلط الخرز.
  7. تدوير واحتضان الأنبوب لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
  8. تدور الخرز ل60 s في 2,000 x g.
  9. تجاهل ماده طافي عن طريق الأنابيب بعناية خارج المخزن المؤقت.
  10. لغسل الخرز ، أضافه 1 مل من الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (تلفزيوني) في الأنبوب. دوامه الأنبوب لخلط الخرز.
  11. تدور أسفل الأنبوب ل 60 s في 2,000 x g.
  12. تجاهل ماده طافي عن طريق الأنابيب بعناية خارج المخزن المؤقت.
  13. غسل الخرز مره أخرى مع 1 مل من تلفزيوني باتباع الخطوات 1.10-1.12.
  14. التركيز النهائي من روناميني المستخدمة سوف تعتمد علي سلاله يجري imaged. اعداد 1 مل من 1-، 10-، 100-، و 1000 اضعاف سلسله التخفيف من رونامامين الأحمر-X من الحل الأسهم الأحمر-X 0.65 مم.
  15. ماصه 20 μL من الخرز في كل أنبوب التخفيف التسلسلي.
  16. تدوير واحتضان أنبوب لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
  17. غسل الخرز مرتين مع 1 مل من تلفزيوني عن طريق تكرار الخطوات 1.10-1.12.
  18. أضافه 1 مل من تلفزيوني في الأنبوب وتخزينه في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 6 أسابيع. تحقق من كثافة مضان من الخرز تحت المجهر المستخدمة للتصوير الحي. يعتمد التركيز المناسب لأستر رونامامين ريد-اكس X علي ظروف التصوير (الشكل 1).
    ملاحظه: الخرز دون العلاج الأحمر رونامامين لا تلتزم الخلية. [روممين] [رد-اكس] يخدم كعلامة مضان [اس ول س] جزيء لاصقه. التفاعل الكهربائي ساكنه بين المشحونة إيجابيا الأحمر-X وغشاء البلازما مشحونة سلبا هو السبب المفترض للتصاق.

2. جمعيه ماصه الفم

  1. قطع واسعه (6.35 مم القطر الداخلي) وضيقه (3.175 مم الداخلية) أنابيب Tygon إلى حوالي 25 سم و 40 سم في الطول ، علي التوالي (الشكل 2).
  2. توصيل أنابيب Tygon مع تترافلوروايثيلين (PTFE) فلتر (0.2 μm حجم المسام) (الشكل 2).
  3. تفكيك أنبوب الشفط المتاحة تجاريا ونعلق صاحب الشعرية واللسان إلى نهاية أنابيب Tygon الضيقة وواسعة ، علي التوالي (الشكل 2).
    ملاحظه: تم استخدام فلتر PTFE لمنع استنشاق أبخره محلول الكلوريد عن طريق ماصه الفم.

3-عزل الاجنه الجنينية

ملاحظه: ارتداء القفازات ومعطف المختبر لتجنب قطع والاتصال مع محلول التبييض.

  1. عقد كل طرف من الشعيرات الدقيقة (القدرة ؛ 10 μL) مع اليد اليمني واليسرى.
  2. سحب ميكروشعري نحو طرفي لتطبيق التوتر وجلب مركز الشعرية علي الموقد لجعل اثنين من الشعيرات الدمويةسحبتباليد (الشكل 3ا).
  3. تقليم نصائح الشعيرات الدموية سحبت باليد مع ملقط تحت تشريح المجهر ونعلق الشعرية سحبت في جهاز الفم الأنابيب (الشكل 2). اعداد نوعين من الماصات. وينبغي ان تكون احجام فتح الأطراف للماصات حوالي 2x و 1x طول المحور القصير لأجنه c. ايليتس (30 ميكرومتر) لنقل الاجنه وأزاله قشر البيض ، علي التوالي الشكل 3ب-د).
  4. ماصه 45 μL من محلول ملح البيض علي بئر من شريحة مولتيبئر (الشكل 4ا؛ أسفل).
  5. مكان 5-10 الكبار c. اليجاليس علي محلول الملح البيض التي تحتوي عليها جيدا.
  6. للحصول علي الاجنه المبكرة c. اليجانز , قطع البالغين إلى قطع عن طريق وضع اثنين من الابر إلى اليمين واليسار من الجسم c. اليجانز وانزلاق الابر الماضية بعضها البعض (الشكل 4ا; المخططات العليا).
  7. ماصه 45 μL من محلول هيبوكلوال علي بئر بجوار الحل الذي يحتوي علي ملح البيض جيدا (الشكل 4ب).
  8. ماصه 45 μL من وسط النمو شيلتون علي الآبار الثلاثة اللاحقة بجانب محلول الاحتواء علي البئر الذي يحتوي عليالشكل 4(ب).
  9. انقل المرحلة الاولي من الخلايا والاجنه المرحلة المبكرة ذات الخليتين إلى محلول الكلوريد بالفم بواسطة الأنابيب الشعرية المرسومة يدويا لنقل الاجنه (الشكل 4ب).
  10. انتظر 40 – 55 ثانيه.
  11. اغسل الاجنه عن طريق نقل الاجنه من محلول كلوكلوال إلى متوسط نمو شيلتون عن طريق الفم مع الشعرية المرسومة باليد لنقل الاجنه (الشكل 4ب).
  12. اغسل الاجنه مره أخرى عن طريق نقل الاجنه إلى بئر جديد من متوسط نمو شيلتون عن طريق الفم والأنابيب مع الشعرية المرسومة باليد لنقل الاجنه (الشكل 4ب).
  13. انقل الاجنه المغسولة إلى بئر جديد لمتوسط نمو شيلتون عن طريق الفم مع الشعيرات الشعرية المرسومة يدويا لنقل الاجنه. باستخدام الشعرية المرسومة باليد لأزاله قشر البيض ، كرر بعناية الأنابيب (الشكل 4ج؛ المخططات الوسطي). إذا تمت أزاله قشر البيض بنجاح ، فان الخلايا الجنينية تصبح أكثر كرويه (الشكل 4ج؛ يمين).
  14. افصل الخلايا البدائية الجنينية المرحلة ذات الخليتين عن طريق الوضع برفق وباستمرار مع الشعرية المرسومة يدويا لأزاله قشر البيض (الشكل 4د).

4. أعاده تشكيل أنماط الاتصال مع الكيسة وحبه

ملاحظه: العمل تحت مجهر التصوير لتجنب تفكك خليه من حبه وتسهيل الحصول علي الصورة في الوقت المناسب.

  1. لمراقبه استخدام المجهر المقلوب ، واعداد غرفه التصوير كما في الشكل 5.
    1. وضع الشفة علي حامل كوفيرسليب (الشكل 5ا).
    2. الشريط حواف المشبك لتحقيق الاستقرار فيه. الجانب مع الشريط هو "الجانب الخلفي" (الشكل 5ا ، ب).
    3. الوجه حامل كوفيرسليب إلى الجانب ' الجبهة ' ورسم دائره علي كوفيرسليب مع القلم مسعور (الشكل 5ج).
      ملاحظه: يعمل اي طبق من الزجاج السفلي أيضا ، شريطه ان تكون الاجنه متلاعبة بواسطة ماصه الفم.
  2. أضافه وسط النمو شيلتون في الدائرة التي رسمها علامة مسعور (الشكل 5د).
  3. انقل الطبقة البدائية المعزولة إلى غرفه التصوير.
  4. الاستغناء عن حجم صغير من الخرز وظيفية كيميائيا باستخدام الشعرية مرسومه باليد لنقل الاجنه.
  5. السيطرة علي موقف من الخرز البوليسترين بالنفخ في الشعرية مرسومه باليد حتى حبه يعلق علي البدائية المعزولة.
  6. جبل الشفة لتجنب تبخر المتوسطة (الشكل 5ه). أداء التصوير الحي.

5. اعداد الكواشف الهامه

  1. الحل ملح البيض (10 مل): الجمع بين 235 μL من 5 م كلوريد الصوديوم و 240 μL من 2 م KCl مع 9525 μL من dH2O.
  2. الحل كلوكلوال (10 مل): الجمع بين 7.5 مل من Clorox (التي تحتوي علي ما يقرب من 7.5 ٪ من الصوديوم) مع 2.5 مل من هيدروكسيد الصوديوم 10 N (التركيز النهائي لل الكلوريكلوديوم هو تقريبا 5.625 ٪).
    ملاحظه: علي الرغم من ان العديد من الأساليب المنشورة قد استخدمت chitinase لهضم قشور البيض الزيتية ، ونحن قد اعتمدت طريقه استخدام الحل هيبوكلواس11. من خلال تجنب الاختلافات دفعه إلى دفعه من الانشطه chitinase ، ونحن نعتقد ان هذا الأسلوب هو أكثر استنساخا ونهج فعاله من حيث التكلفة.
  3. 0.81 الحل انولين مم (40 مل)
    1. أضافه 0.2 غرام من انولين إلى 40 مل من dH2س.
    2. الاوتوكلاف لأذابه.
      ملاحظه: يحتفظ لمده 1 شهر في 4 درجه مئوية.
  4. 0.5 M MES العازلة (500 mL)
    1. تذوب 48.81 غرام من MES في 400 مل من الماء المقطر (dH2س).
    2. ضبط درجه الحموضة إلى 6.0.
    3. جلب الحجم الإجمالي إلى 500 مل مع dH2س.
  5. حلول تلفزيونيه (1 لتر)
    1. لجعل 10 اضعاف الحل برنامج تلفزيوني ، وحل 1 حزمه من البودرة بريميكس البرامج التلفزيونية في 1 لتر من dH2س.
    2. الجمع بين 100 مل من 10 اضعاف حل تلفزيوني مع 900 mL من dH2س.
  6. 5% بوليفينيلبيروليتم (PVP) محلول (4 مل)
    1. في ظل ظروف معقمه ، ذوب 0.2 غرام من PVP في 4 مل من المتوسطة دروفيا شنايدر.
      ملاحظه: دائما فتح الأسهم المتوسطة شنايدر في النسيج الثقافة (TC) هود. يحفظ لمده 1 شهر عند 4 درجه مئوية.
  7. 0.65 mM الحل الأسهم الأحمر-X رونامين (2 مل)
    1. تزن 1 ملغ من رونامامين الأحمر-X.
    2. أضافه 2 مل من ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) لأذابه.
    3. Aliquot ومخزن في-20 درجه مئوية.
  8. المتوسطة النمو شيلتون (SGM) (10.25 mL)
    1. تحت ظروف معقمه ، الجمع بين 8 مل من دروفيا شنايدر المتوسطة ، 1 مل من محلول PVP ، 1 مل من محلول انولين ، 1 مل من النسر المتوسط القاعدي (BME) الفيتامينات ، 50 μL من البنسلين ، ستربتوميسين ، و 100 μL من الدهون التركيز معا.
    2. Aliquot 325 μL من SGM إلى 1.5 mL ميكروانابيب.
      ملاحظه: الاحتفاظ لمده 1 شهر في 4 درجه مئوية.
    3. في يوم العزلة البدائية ، أضف 175 μL من مصل الأبقار الجنينية إلى SGM (للحجم الإجمالي 500 μL).
      ملاحظه: تخزين في-20 درجه مئوية وذوبان قبل الاستخدام. ولا يلزم ان تكون الحرارة قد قتلت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لاعداد الخرز ، ونحن تحديد المبلغ الأمثل من روامين الأحمر-X استر الناجحة لسلاله المحورة وراثيا التعبير عن GFP-ميوسين الثانية و mCherry-histone (الشكل 1ا-د). استخدمنا mcherry الموسومة هيستون كعلامة علي تطور دوره الخلية. لان كلا من رونامين الأحمر-x و mcherry ستكون مضيئه بواسطة ليزر 561 nm ، والكثافة المثلي للاشاره الأحمر-x رونامين مماثله لتلك التي هيستون للسماح التصوير في وقت واحد من الخلية وحبه. علي سبيل المثال ، اشاره مضان من حبه تعامل مع 0.005 ميكروغرام/مل رونامامين الأحمر-X...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية المبسطة سوف تسمح للباحثين لاختبار ادوار أنماط الاتصال خليه محدده في جوانب مختلفه من التكوين. لقد استخدمنا هذه التقنية لإظهار ان محور تقسيم الخلية يتم التحكم من قبل الاتصال المادي مع الخرز لاصقه10. كما مواصفات محور الشعبة أمر حاسم للتنمية متعددة الخلايا من خلال المساهمة في تخلق14، قسم الخلايا الجذعية15،16، والتوازن الانسجه15،16

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جيمس بيس وبروس بورمان علي المشورة وتوفير سلالات c. اليجنز ، دون مورمان ، كوتا ميزوموتو ، ومعهد علوم الحياة مرفق التصوير الاساسيه لتقاسم المعدات والكاشفات ، أوى Hiroyasu ، ليزا فرناندو ، مين جي كيم للحفاظ علي c. اليجنز والقراءة النقدية لمخطوطنا. ويدعم عملنا مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) ، (RGPIN-2019-04442).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) -3-إيثيل كاربوديميد هيدروكلوريدألفا إيسارAAA1080703لتحضير الخرزة
مجموعة أنبوب الشفاطدروموند21-180-13لعزل الأرومة.
سلالة Caenorhabditis elegans: N2 ، النوع البريCaenorhabditis Genetics CenterN2سلالة المستخدمة في هذه الدراسة
سلالة Caenorhabditis elegans: KSG5 ، النمط الجيني: zuIs45 ؛ itIs37في المنزلسلالة KSG5المستخدمة في هذه الدراسة
معايرة Mircopipets ، 10 & micro; LDrummond21-180-13لعزل البلاستومير
حبات البوليسترين المعدلة بالكربوكسيل (30 & micro; قطر م)KISKER BiotechPPS-30.0COOHPلإعداد الخرزة
Lipid ConcentrateLife Technologies11905031لعزل الأرومة. العمل في غطاء مزرعة الأنسجة.
كلوركسكلوركسإن إيهلعزل البلاستومير. افتح زجاجة جديدة عندما لا يعمل علاج هيبوكلوريت بشكل جيد.
حامل Coverslipفي المنزلNAلعزل البلاستومير.
مجهر التشريح: Zeiss Stemi 508 مع حامل M. مصدر الضوء هو LED مدمج. تكبير قطعة العين 10X.كارل زايسستيمي 508لعزل الأريمة.
مصل الأبقار الجنيني ، طلقة واحدة مؤهلة ، من أصل كنداGibcoA3160701لعزل الأريمة. العمل في غطاء مزرعة الأنسجة.
الاستخدام العام والدقة انزلاق الإبر تحت الجلد ، مقياس 25BD14-826AAلعزل الأريمة
InulinAlfa AesarAAA1842509لعزل الأريمة
MEM فيتامين Solution (100x)Gibco11120052لعزل الأريمة.
MES (بلورات بيضاء ناعمة)كواشف فيشر الحيويةBP300-100لإعداد الخرزة
شريحة متعددة الاختبار 10 WellMP BiomedicalsICN6041805لعزل الأريمة
PBS ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 10 × كواشف بيولوجية مسحوقفيشرBP665-1لتحضير الخرزة
البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)15140148 جيبكول عزل بلاستومير.
PolyvinylpyrrolidoneFisher BioReagentsBP431-100لعزل بلاستومير
كلوريد البوتاسيومBioshopPOC888لعزل البلاستومير
Rhodamine Red-X ، Succinimidyl Ester ، 5-isomerالمجسات الجزيئيةR6160لتحضير حبة
شنايدر ذبابة الفاكهة معقمة متوسطةجيبكو21720024لعزل الأريمة. العمل في غطاء مزرعة الأنسجة.
كلوريد الصوديومBioshopSOD001لمحلول
هيدروكسيد الصوديوم لعزل الأريمية ، 10 NFisher ChemicalSS255-1لعزل الأريمة
المجهر متحد البؤر القرص: Yokogawa CSU-X1 ، نطاق Zeiss Axiovert المقلوب ، كاميرا Quant EM 512 ، عدسة موضوعية 63X NA 1.4 Plan. تم التحكم في النظام بواسطة Slidebook 6.0.ابتكار التصوير الذكيNAللتصوير المباشر
مرشحات الحقن ، PTFE ، 13100115 غير معقمةBasixلعزل الأريمة.
أنابيب مختبر Tygon S3 ، الصياغة E-3603 ، القطر الداخلي 3.175 ممبلاستيك أداء Saint Gobain89403-862لعزل الأرومة.
مختبر Tygon S3 ، الصيغة E-3603 ، القطر الداخلي 6.35 ممSt Gobain Performance Plastics89403-854لعزل الأريمة.
CD أنابيب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624(2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C Elegans EmbryoBlastomere IsolationCell Contact ReconstitutionEggshell RemovalCapillary PreparationFluorescent LabelingLive ImagingSpindle OrientationCell Division Axis

مقالات ذات صلة