هنا ، نقدم طريقه باستخدام يدعم غشاء نفاذيه لتسهيل دراسة عدم الاتصال الإشارات paracrine المستخدمة من قبل الخلايا السرطانية لقمع الاستجابة المناعية. النظام قابل لدراسة دور العوامل التي تفرز الورم في تنشيط الضامة الملطف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دراسة اثار الورم الذي يفرز الأورام الليفية علي تنشيط الضامة باستخدام الثقافة المشتركة مع غشاء نفاذيه يدعم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الإشارات paracrine المستمدة من الورم هو عنصر التغاضي عن كبت المناعة المحلية ويمكن ان يؤدي إلى بيئة متساهلة لاستمرار نمو السرطان والانبثاث. يمكن ان تتضمن إشارات paracrine اتصال خليه خليه بين أنواع الخلايا المختلفة ، مثل PD-L1 المعرب عنها علي سطح الأورام تتفاعل مباشره مع PD-1 علي سطح الخلايا T ، أو إفراز الليغاندس بواسطة خليه الورم للتاثير علي خليه مناعية. هنا نقوم بوصف طريقه الثقافة المشتركة للتحقيق في اثار الأورام التي يفرزها الورم علي تنشيط الخلية المناعية (الضامة). هذا الاجراء المباشر يستخدم المتاحة تجاريا 0.4 μm غشاء البولي يدعم نفاذيه ولوحات ثقافة الانسجه القياسية. في العملية الموصوفة ، يتم استزراع الضامة في الغرفة العليا والخلايا السرطانية في الغرفة السفلي. وجود حاجز 0.4 μm يسمح لدراسة الإشارات بين الخلايا دون متغير الخلط من الاتصال المادي ، وذلك لان نوعي الخلية تشترك في نفس المتوسط والتعرض للحجاب paracrine. ويمكن الجمع بين هذا النهج والآخرين ، مثل التغييرات الجينية في الضامة (علي سبيل المثال ، العزلة عن الفئران الوراثية) أو الورم (علي سبيل المثال ، التعديلات التي تتم بوساطة CRISPR) لدراسة دور العوامل والمستقبلات المحددة التي تفرزها. ويفسح النهج نفسه أيضا للتحليلات البيولوجية الجزيئية القياسية مثل النسخ العكسي الكمي لتفاعل البلمره المتسلسل (qRT-PCR) أو تحليل اللطخه الغربية ، دون الحاجة إلى الفرز الانسيابي للفصل بين الخليتين السكانيتين. المثل يمكن استخدام المقايسات المناعية المرتبطة بالانزيمات (ELISAs) لقياس الخلايا المفرزة لفهم التفاعل الديناميكي لإشارات الخلية في سياق نوع الخلية المتعددة بشكل أفضل. ويمكن أيضا ان تختلف مده الثقافة المشتركة لدراسة الاحداث المنظمة زمنيا. هذه الطريقة المشتركة للثقافة هي أداه قويه تسهل دراسة الإشارات التي تفرز الورم في السياق المناعي.
المقدمة
وقد ركزت الدراسات الحديثة علي قدره الخلايا السرطانية لتجنب الكشف عن طريق الخلايا المناعية ، وقمع التنشيط المناعي المحلي ، أو لإنتاج البيئة السرطانية المتسامحة التسامح في الورم المجهري. وقد وصفت فئتين واسعه من التفاعلات الورم والخلايا المناعية التي تسهل هذه الآثار: التفاعلات بوساطة الاتصال أو الأورام التي تفرز الورم. واحده من أكثر أليات المدروسة والعريكة سريريا لتثبيط المناعة بوساطة الاتصال المستخدمة من قبل الأورام هو التعبير عن pd-L1 ، الذي يتفاعل مع pd-1 علي الخلايا T لكبح تنشيطها ووظيفة1،2. ردا علي مضاد للفيروسات-غاما (IFNγ) ، الذي يعبر عنه عدد من الخلايا المناعية المنشطة ، يمكن ان تزيد الخلايا السرطانية من التعبير عن PD-L1 للحث علي استنفاد الخلايا التائية النشطة ، التالي منعها من الاستئصال الفعال للخلايا السرطانية3. استخدام الأجسام المضادة لمنع التفاعل بين PD-L1 و PD-1 يستخدم حاليا لعلاج أنواع السرطان متعددة في البشر4. وفي ضوء هذا النجاح السريري وغيرها ، حظي تحديد واستهداف أليات المناعة المستمدة من الورم باهتمام متزايد.
إلى جانب قمع المناعة التكيفيه ، ومن المعروف أيضا ان الأورام تفرز العوامل التي تقمع الاستجابات الموالية للالتهابات من الخلايا المناعية الفطرية. الخلايا السرطانية يمكن أيضا ان تفرز العوامل التي تحرف التوظيف والتمايز من الخلايا المشتقة من النخاع النخاعي في البيئة المجهرية الورم لتعزيز قمع T تنشيط الخلية8,9.
نوع واحد من الخلايا المناعية الفطرية التي لها تاثير عميق علي تقدم الورم هو الضامة. لسنوات عديده ، وقد استخدم وجود الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) كنذير سلبيه لبقاء المريض10. وقد تم إدخال المفهوم الذي يثبط مناعة الخلايا المناعية التي تخفف من الأورام بوساطة الخلية أكثر من 40 سنه مضت11. في الاونه الاخيره, وقد ثبت ان الاستجابة الموالية للالتهابات الضامة يمكن ان تكون اقل تنظيما في حين ان النمط الظاهري الموالية للورم يمكن ان يكون مستحثا في البيئة المجهرية الورم. هذه الضامة المثبطة للمناعة يمكن ان تسهم في استجابه التحمل, القيادة الورم التقدم والمقاومة للعلاج الكيماوي-والعلاج المناعي12. النظر إلى ان الضامة هي في كثير من الأحيان واحده من الكريات البيضاء الأكثر وفره مع الورم ، واستعاده نشاطهم المناعي الخاصة الورم يمثل هدفا محتملا لعلاجات السرطان13.
في حين يمكن ان تكون علي غرار التفاعلات الاتصال بوساطة بين الخلايا السرطانية والضامة من خلال الزراعة المباشرة ، واستخدام يدعم غشاء نفاذيه يمكن توضيح العوامل التي تفرز الورم هي المناعية دون التاثير الذي يحتمل ان يكون الخلط من الخلايا المناعية الورم الخلية الاتصال. باستخدام أساليب مماثله إلى حد ما ، والبعض الآخر قد أظهرت امكانيه تحديد العوامل التي تفرز في التفاعلات العصبية/الخلايا الدقيقة14 وكذلك الأورام مع خلايا ميسوثيليال15. وقد استخدمنا أيضا بنجاح هذه التقنية المشتركة في الثقافة لتوصيف دور البروتين الذي يفرز الورم ، Pros1 ، كمثبط للتعبير الجيني الموالي للالتهابات بعد تحفيز الضامة الصفاقيه مع LPS ومضاد للفيروسات-جاما16. هنا نحن وصف منهجيه مباشره التي يمكن استخدامها لاستجواب كيفيه العوامل التي تفرز الورم يمكن ان تؤثر علي تنشيط الضامة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت جميع الإجراءات المتعلقة بحصاد واستخدام الضامة murine البريتوني في جامعه نورث كارولينا في تشابل هيل (UNC) ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للرعاية الحيوانية والاستخدام (IACUC) UNC.
1. الضامة الثقافة
ملاحظه: هذا الاجراء يمكن استخدام الضامة البريتوني الاساسيه (الموصوفة بالتفصيل أدناه) ، الضامة نخاع العظم المشتقة ، أو خطوط الخلايا الضامة مثل J774 (ATCC) أو RAW264 (ATCC).
- حصاد الضامة البريتوني كما سبق وصفها16،17 ولوحه مباشره في الغرفة العلوية (ق) من 0.4 μm غشاء البوليستر ادراج الثقافة المشتركة 6 لوحه جيدا (الشكل 1a).
ملاحظه: الغلة التقريبية من الضامة من كل عزله هو 1 × 106 خلايا المجموع ، التالي فان متوسط عدد الخلايا في بئر هو ~ 1.5-1.6 x 105 خلايا في 6 لوحه جيدا. - الثقافة الضامة التي تم حصادها في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM)/f12 ، 10 ٪ الجنين البقري المصل (سيتم) ، 1x البنسلين/ستربتوميسين ، 20 نانوغرام/مل الضامة مستعمره عامل تحفيز (M-السائل الدماغي الشوكي) لمده 3 أيام في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
ملاحظه: الغرفة العلوية تحتوي علي 1 مل من الثقافة المتوسطة في حين يتم تعبئة الغرفة السفلي مع 1.5 ml. يجب أضافه الوسيط إلى كل غرفه.
2. زراعه الخلايا السرطانية مع الضامة
- قبل الاستخدام ، الثقافة المتاحة تجاريا الخلايا السرطانية في المتوسطة الخاصة بها التالية ATCC-الانسجه الموصي بها أساليب الثقافة.
- غسل الخلايا السرطانية الملتصقة مره واحده مع الفوسفات مخزنه المالحة (التلفزيونية) ، أضافه 0.05 ٪ التريبسين + حمض ايثيلليندياميتاتاتاستيك (أدتا) ، واحتضان في 37 درجه مئوية حتى فصل الخلايا. أعاده تعليق الخلايا التي تحتوي علي المتوسطة ، كميه الخلايا باستخدام مقياس الكريات أو عداد الخلية ، ومن ثم أجهزه الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 220 x g إلى بيليه.
- اثناء الطرد ، يستنشق الوسط من الحجرات العلوية والسفلية من لوحات الدعم غشاء نفاذيه المحتوية علي الضامة واستبدال مع المتوسطة الطازجة.
- للغرف السفلي حيث سيتم مطلي الخلايا السرطانية ، وملء مع 1 مل من المتوسطة بدلا من 1.5 mL للسماح لحجم كاف لأضافه الخلية.
- يستنشق المتوسطة من الخلايا السرطانية التي تغلف وأعاده التعليق الخلايا في DMEM/F12 مع 10 ٪ منها ، 1x البنسلين/ستربتوميسين ، و 20 نانوغرام/مل M-السائل الدماغي الشوكي في تركيز 3 × 105 خلايا/مل.
- أضافه 0.5 mL من الخلايا السرطانية 3 × 105 خلايا/مل إلى غرفه السفلي من الآبار المطلوبة (الشكل 1b).
ملاحظه: يمكن معالجه الخلايا فورا.
3-علاج الخلايا المستزرعة المشتركة
- للحث علي التعبير الجيني الموالية للالتهابات الضامة ، وعلاج منفردة أو الضامة شارك في المثقف عن طريق أضافه 100 ng/mL IFNγ و 50 ng/mL LPS.
- تغيير مده أوقات العلاج في الثقافة حسب الحاجة. يحدث تنشيط الضامة في غضون 2 ح وبعض قمع بوساطة الورم يحدث من قبل 8 ح. الثقافة المشتركة لل 24 ح غله قويه ومتسقة الأورام المشتقة قمع.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن ان يحفز الضامة لاعتماد النمط الظاهري الشفاء الموالية للجروح من خلال أضافه عوامل مثل interleukin-10 (IL10) ، وتاثير الورم-يفرز يجند تقييمها.
- تغيير مده أوقات العلاج في الثقافة حسب الحاجة. يحدث تنشيط الضامة في غضون 2 ح وبعض قمع بوساطة الورم يحدث من قبل 8 ح. الثقافة المشتركة لل 24 ح غله قويه ومتسقة الأورام المشتقة قمع.
- كعنصر تحكم سلبي ، الضامة الثقافة منفردة وترك دون علاج. كعنصر تحكم إيجابي ، علاج الضامة مثقف منفردة مع 100 ng/mL IFNγ و 50 ng/mL LPS.
4-التحليل النهائي للخلايا المستزرعة المشتركة
- بعد وقت الحضانة المطلوب قد انقضت ، عزل الخلية محلله أو المتوسطة الثقافة المكيفة حسب الرغبة ، اعتمادا علي اختبار الاحتياجات.
- لعزل الخلية محلله لتحليل تفاعل البلمره الكمي (qpcr) ، يستنشق وسائل الاعلام من كلا الغرفتين من البئر ويغسل مره واحده مع 2 مل من تلفزيوني. تطبيق الجيش النيبالي التحلل العازلة إلى الغرفة العلوية التي تحتوي علي الضامة. كشط بلطف الغشاء للإفراج عن الخلية lysate ، ونقل إلى أنبوب جمع لمزيد من المعالجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لمجموعه العزل RNA.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتحديد تاثير الأورام التي يفرزها الورم علي الاستقطاب الضام ، تم استخدام الاجراء الموصوف. واستخدمت الضامة البريتوني مثقف في غياب الخلايا السرطانية السلبية (غير المعالجة = اليسار البعيد) وايجابيه (IFNγ و LPS حفزت = 2nd من اليسار) الضوابط (الشكل 2a). بدلا من ذلك ، كانت الضامة البريتوني مشتركه في الاستزراع مع خلايا الورم الميلانوما B16F10 (ATCC) (الشكل 1A). فورا بعد الطلاء ، كانت الخلايا اما التعامل مع IFNγ و LPS أو ترك دون علاج. بعد 24 ساعة من الثقافة ، ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحليل الثقافة المشتركة المقدمة هنا هو تعديل الاختبارات المحددة سابقا التي تسمح لدراسة العوامل التي تفرز الورم علي تنشيط الخلايا المناعية. في حين ان الاتصال بالخلايا الخلوية معروف للحث علي حدوث تغييرات في النشاط المناعي ، فان قدره الخلايا التي تفرز الورم لتعديل التنشيط المناعي اقل فهما. ونحن نقدم وصفا للطريقة التي ، علي عكس الثقافة المشتركة المباشرة ، يمكن استخدامها لاستجواب كيفيه تاثير العوامل المشتقة من الورم علي تنشيط الخلايا المناعية دون الطبيعة المربكة للإشارات التي تتم بوساطة الاتصال. ونظرا للاهميه السريرية المحتملة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
[اريك] [اوبيل] كان مولت, جزئيا, بالامريكيه سرطان جمعيه دكتوراه زمالة (128770-بف-15-216-01-ليب]). وقد تم دعم العمل من خلال منحه من المعاهد القومية للصحة (R01-CA205398) وجائزه مؤسسه أبحاث سرطان الثدي (BCRF) إلى الصحة والسلامة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| مجموعة توليف الحمض النووي (كدنا | Promega | A3500 | |
| DMEM / F12 وسائط | ThermoFisher العلمية- جيبكو | 11320033 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية O111: B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL) ThermoFisher | Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| ماوس مؤتلف IFN & gamma ؛ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR مجموعة Low-ROX | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable يدعم | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
المراجع
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
