Method Article

تحديد المسارات المضيفة التي تستهدفها البروتينات البكتيرية باستخدام سميه الخميرة والشاشات المثبطة

DOI:

10.3791/60488

⸱

October 25th, 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرز مسببات الامراض البكتيرية البروتينات في المضيف الذي يستهدف العمليات البيولوجية الحاسمة. تحديد مسارات المضيف التي تستهدفها البروتينات البكتيرية هو المفتاح لمعالجه التسبب في الجزيئات. هنا ، يتم وصف طريقه باستخدام المثبطة الخميرة المعدلة والشاشة سميه لتوضيح مسارات المضيف التي تستهدفها البروتينات السمية البكتيرية المستجيب.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا داخل الخلايا تفرز عوامل الضراوة تسمي البروتينات المستجيب في عصارة المضيف التي تعمل علي تخريب البروتينات المضيفة و/أو المسارات البيولوجية المرتبطة بها لصالح البكتيريا. وقد أصبح تحديد البروتينات المستجيبة البكتيرية المفترضة أكثر قابليه للاداره بسبب التقدم في تسلسل الجينوم البكتيري وظهور الخوارزميات التي تسمح في تحديد سيليكو الجينات ترميز إفراز المرشحين و/أو حقيقية مثل النواة المجالات. ومع ذلك ، فان تحديد هذه العوامل الهامه في الضراوة ليس سوي خطوه أوليه. وبطبيعة الحال ، فان الهدف هو تحديد الوظيفة الجزيئية للبروتينات المستجيب وتوضيح كيفيه تفاعلها مع المضيف. في السنوات الاخيره ، ساعدت تقنيات مثل الخميرة الهجينة الشاشة والإيمونوبريسيبيتيشنز واسعه النطاق إلى جانب الطيف الكتلي في تحديد التفاعلات بروتين البروتين. علي الرغم من ان تحديد شريك ربط المضيف هو الخطوة الاولي الحاسمة نحو توضيح الوظيفة الجزيئية للبروتين المستجيب البكتيري ، وأحيانا يتم العثور علي البروتين المضيف لديها وظائف بيولوجية متعددة (علي سبيل المثال ، actin ، كلميثرين ، الأنابيب) ، أو البروتين البكتيري قد لا يربط جسديا البروتينات المضيفة ، وحرمان الباحث من المعلومات الهامه حول المسار المضيف دقيقه يجري التلاعب بها. تم تعديل شاشه سميه الخميرة المعدلة إلى جانب الشاشة القمعية لتحديد مسارات المضيف المتاثره بالبروتينات البكتيرية المستجيبة. تعتمد شاشه السمية علي تاثير سام في الخميرة التي يسببها البروتين المستجيب الذي يتداخل مع المسارات البيولوجية المضيفة ، والذي غالبا ما يظهر كعيب في النمو. يستخدم التعبير عن مكتبه الخميرة الجينية لتحديد العوامل المضيفة التي تقمع سميه البروتين البكتيري المستجيب التالي تحديد البروتينات في المسار الذي يستهدف البروتين المستجيب. يحتوي هذا البروتوكول علي إرشادات مفصله لكل من الشاشات السمية والمثبطة. ويمكن اجراء هذه التقنيات في اي مختبر قادر علي الاستنساخ الجزيئي وزراعه الخميرة والقولونية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التقرير الأول من الإجراءات المماثلة لتلك المعروضة هنا تتميز الهوائية الرئوية النوع الرابع sidd ، ديامبيلاسي الذي يعدل Rab11. واستخدمت تقنيات مماثله لتوصيف العديد من القاذفات الهوائية 1،2،3. وقد تم تكييف المقايسة لتميز بروتين المستجيب الرابع من نوع coxiella البورنيتيه 4، ومؤخرا تم توسيع فائده هذه التقنية لتوصيف البروتينات الغشائية لاحتواء الكلاميديا التراميزيه 5 .

يمكن تقسيم هذا البروتوكول إلى جزاين رئيسيين: 1) شاشه سميه الخميرة ، والتي يتم فيها التعبير عن البروتين البكتيري المستجيب للفائدة في الخميرة ويتم فحص المستنسخين للحصول علي النمط الظاهري السام كما يتضح من عيب في النمو ، و 2) شاشه الخميرة المثبطة ، حيث يتم قمع النمط الظاهري السامة عن طريق التعبير عن مكتبه الخميرة الجينوم في السلالة السامة. التالي ، فان شاشه السمية هي شاشه لأنماط الظاهري السامة التي تظهر كعيوب في النمو عندما يبالغ المستجيب البكتيري للفائدة. يتم اختيار المستنسخات السامة ، التي تم تحويلها بنجاح مع والتعبير عن المستجيب البكتيري ، وحفظها للخطوة التالية. الخطوة الرئيسية الثانية تنطوي علي المبالغة في التعبير عن مكتبه الخميرة الجينوم هضمها جزئيا في استنساخ الخميرة السامة. البلازميدات التي تشكل الخميرة الجينوم المكتبة اقترح للاستخدام في هذا البروتوكول تحمل 5 − 20 ادراج kb ، وعاده ما يقابل 3 − 13 الخميرة المفتوحة إطارات القراءة (ORF) متوسط حجم الجينات من ~ 1.5 كيلوبايت في جميع انحاء البلازميدات ، والتي تمثل الجينوم الخميرة كامله مغطاه تقريبا 10x. ويسمي هذا الجزء من الفحص الشاشة القمعية ، والهدف من ذلك هو قمع سميه البروتين المستجيب البكتيري. يتم عزل البلازميدات المثبطة المحتملة من الخميرة ، متسلسلة ، و ORFs قمع المحددة. الأساس المنطقي الذي تقوم عليه الشاشة القمعية هو ان البروتين المستجيب يربط ، يتفاعل مع ، و/أو مكونات يثقل كاهله للمسار المضيف الذي يستهدفه ، وان توفير تلك البروتينات المضيفة مره أخرى في الزائدة يمكن إنقاذ تاثير سام علي المسار ، التالي ، عيب النمو. التالي ، فان ORFs المحددة التي تقمع السمية غالبا ما تمثل مشاركين متعددين في مسار المضيف. ثم يتم اجراء التجارب المتعامدة للتحقق من ان المستجيب البكتيري يتفاعل بالفعل مع المسار المتورط. وهذا ضروري بشكل خاص إذا تم تحديد شريك ملزم مثل كلميثرين أو الاكتين ، لان هذه البروتينات تشارك في العديد من عمليات المضيف. ويمكن للتجارب الأخرى بعد ذلك توضيح الوظيفة الفسيولوجية للبروتين المستجيب اثناء العدوى. السمية وشاشات المثبطة هي أيضا أدوات قويه لفك رموز الوظيفة الفسيولوجية من البروتينات البكتيرية التي لا تربط جسديا البروتينات المضيف مع التقارب كافيه للكشف عن طريق الايمونوبريسيبيتيشن أو التي تتفاعل مع المضيف في التفاعلات الانزيميه ضرب وتشغيل التي قد لا يتم الكشف عنها من قبل الخميرة-اثنين من الشاشة الهجينة.

علي الرغم من ان الشاشة القمعية يمكن ان تكون وسيله قويه للكشف عن التفاعلات الفسيولوجية المحتملة بين البروتينات البكتيرية المستجيب ومسارات المضيف ، يجب ان يحفز البروتين البكتيري المستجيب خلل في النمو في الخميرة ، والا استخدامه في وسوف تكون الشاشة المثبطة للاستخدام قليلا. وعلاوة علي ذلك ، يجب ان يؤدي النمط الظاهري السامة علي الأقل 2-3 سجل العجز10 في النمو أو انه سيكون من الصعب تحديد المثبطات. إذا تم إنشاء مختبر لثقافة الخلية ، وفحص البروتينات المستجيب للسمية في خطوط الخلايا المشتركة مثل هيلا يمكن ان تعطي في كثير من الأحيان نظره ثاقبه حول ما إذا كان يستحق الجهد للمضي قدما في الشاشة سميه الخميرة. التعبير عن الرحم من البروتين المستجيب في الخلايا هيلا في بعض الأحيان يؤدي إلى السمية التي ترتبط بقوة شديده مع سميه في سلاله الخميرة المستخدمة لهذه الشاشات4. وتشمل السمات الملحوظة للإجهاد في الخلايا هيلا فقدان ألياف الإجهاد ، مفرزه الخلية من لوحه ، والتكثيف النووي يشير إلى المبرمج. اي اشاره بصريه من الإجهاد في الخلايا هيلا جعل البروتين من الفائدة مرشح جيد للحث علي خلل في النمو في الخميرة ، والتي تتكرر بسرعة أكبر بكثير ، التالي أكثر استجابه لاضطراب المسارات الاساسيه.

وتجدر الاشاره إلى ان الشاشة القمعية لا تحدد دائما الشركاء الملزمين المضيفين كمثبطين ، ولكنها لا تزال يمكن ان تورط المكونات الهامه للمسار (المسارات) المضيفة المستهدفة ، مما يعطي نظره شامله للعمليات البيولوجية التي اختطفتها بروتين المستجيب البكتيري. علي السطح ، وهذا يبدو غير بديهي ، لان توفير شريك ملزم من البروتين المستجيب في الزائدة سيكون من المتوقع لإنقاذ عيب النمو. في الجهود الرامية إلى تحديد المسارات التي تستهدفها c. التراميزاتيس البروتين المستجيب CT229 (cpos) ، الذي يربط ما لا يقل عن 10 مختلفه الراب GTPases اثناء العدوى5، أيا من شركاء الراب ملزمه قمعت سميه CT229. ومع ذلك ، تم التعرف علي العديد من القمعيين المتورطين في الاتجار بالحويصلات المغلفة بالكلس ، مما ادي إلى مزيد من العمل الذي يبرهن علي ان CT229 يقوض علي وجه التحديد الاتجار بالأشخاص الذين يعولهم الراب. المثل ، عند التحقيق في c. Cbu0041 البروتين المستجيب (cira) عده رو GTPases التي أنقذت خلل نمو الخميرة تم تحديدها ، وكان في وقت لاحق وجدت ان cira يعمل بمثابه Gtpases تنشيط البروتين (GAP) للروا4.

لا يمكن المبالغة في فائده الشاشة الخميرة المثبطة لتوضيح مسارات المضيف التي تستهدفها البروتينات البكتيرية المستجيب ، والباحثين الآخرين الذين يحاولون توصيف البروتينات البكتيرية داخل الخلايا يمكن ان تستفيد كثيرا من هذه التقنيات. هذه المقايسات هي ذات قيمه إذا فشلت إيمونوبريسيبيتيشنز و/أو الخميرة-اثنين من الشاشات الهجين للعثور علي شريك ملزم ويمكن توضيح المسارات التي تستهدفها البروتين المستجيب البكتيري. هنا ، يتم توفير بروتوكولات مفصله للشاشات السمية والمثبطة لتحديد المسارات البيولوجية المضيفة التي تستهدفها البروتينات البكتيرية داخل الخلايا ، فضلا عن بعض العقبات الشائعة التي شهدتها عند استخدام هذه المقايسات الحلول المقابلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-اعداد وسائط الاعلام والكاشفات

ملاحظه: يجب اعداد لوحات قبل يوم الفحص وهي جيده لمده شهر واحد. يمكن اجراء وسائل الاعلام والكواشف في اي لحظه وهي جيده لمده شهر واحد.

  1. اعداد 1 لتر من محلول الجلوكوز (10 ٪ ث/الخامس) عن طريق تذويب 100 غرام من D-(+)-الجلوكوز في 800 مل من الماء المقطر في 1 ، 000 مل الكاس. اضبط مستوي الصوت علي 1 لتر بالماء المقطر. تصفيه من خلال فلتر معقم 0.2 μm في زجاجه التخزين المعقمة 1 L الوسائط.
  2. اعداد 1 لتر من محلول الغالاكتوز (10 ٪ ث/الخامس) عن طريق تذويب 100 غرام من D-(+)-لبن في 800 مل من الماء المقطر في 1 لتر الكاس. ضبط مستوي الصوت إلى 1 مل باستخدام الماء المقطر وتصفيه من خلال فلتر معقم 0.2 μm في زجاجه التخزين المعقمة 1,000 mL وسائل الاعلام.
  3. اعداد 1 لتر من الخميرة استخراج ببتون سكر العنب (ypd) أجار عن طريق تذويب 10 غرام من استخراج الخميرة ، 20 غرام من ببتون ، 20 غرام من الجلوكوز ، و 20 غراما من أجار في 1,000 مل من الماء المقطر. الاوتوكلاف لمده 20 دقيقه وبارده في 56 درجه مئوية حمام المياه حتى تبرد. تصب في لوحات مم 100 باستخدام ~ 20 مل من وسائل الاعلام لكل لوحه.
  4. اعداد 1 لتر من مرق YPD عن طريق تذويب 10 غرام من مستخلص الخميرة ، 20 غرام من peptone ، و 20 غرام من الجلوكوز في 1,000 مل من الماء المقطر. الاوتوكلاف لمده 20 دقيقه.
  5. اعداد التسرب الاصطناعية (SD) اليوراسيل (Ura-) أجار الجلوكوز. ل 1 لتر ، تذوب 6.7 غرام من قاعده النيتروجين الخميرة دون الأحماض الامينيه ، 1.9 غرام من الملحق التسرب دون uracil ، و 15 غرام من أجار في 800 mL من الماء المقطر. الاوتوكلاف لمده 20 دقيقه وبارده في 56 درجه مئوية حمام المياه حتى درجه الحرارة هو ~ 50 − 60 درجه مئوية. باستخدام ماصه 50 mL المصلية أو اسطوانه معقمه تخرج ، أضافه 200 mL من محلول الجلوكوز أعدت في الخطوة 1.1. اخلطي جيدا بواسطة الدوران برفق أو ضعيه علي لوحه التقليب. تصب في لوحات مم 100 باستخدام ~ 20 مل من وسائل الاعلام لكل لوحه.
  6. اعداد التسرب الاصطناعية (SD) اليوراسيل (اورا-) أجار الغالاكتوز. ل 1 لتر ، تذوب 6.7 غرام من قاعده النيتروجين الخميرة دون الأحماض الامينيه ، 1.9 غرام من الملحق التسرب دون uracil ، و 15 غرام من أجار في 800 mL من الماء المقطر. الاوتوكلاف لمده 20 دقيقه وبارده في 56 درجه مئوية حمام المياه حتى درجه الحرارة هو ~ 50 − 60 درجه مئوية. باستخدام ماصه 50 mL المصلية أو اسطوانه معقمه تخرج ، أضافه 200 mL من محلول الغالاكتوز أعدت في الخطوة 1.2. اخلطي جيدا بواسطة الدوران برفق أو ضعيه علي الصفيحة الدوارة. تصب في لوحات مم 100 باستخدام ~ 20 مل من وسائل الاعلام لكل لوحه.
  7. اعداد التسرب الاصطناعية (SD) اليوراسيل (اورا-) مرق الجلوكوز. ل 1 لتر ، تذوب 6.7 غرام من قاعده النيتروجين الخميرة دون الأحماض الامينيه و 1.9 غرام من الملحق التسرب دون اليوراسيل في 800 mL من الماء المقطر. الاوتوكلاف لمده 20 دقيقه وبارده في 56 درجه مئوية حمام المياه حتى درجه الحرارة هو ~ 50 − 60 درجه مئوية. باستخدام ماصه 50 mL المصلية أو اسطوانه معقمه تخرج ، أضافه 200 مل من محلول الجلوكوز أعدت في الخطوة 1.1.
  8. اعداد التسرب الاصطناعي (SD) اليوراسيل (Ura-) لوسين (ليو-) أجار الجلوكوز. ل 1 لتر ، تذوب 6.7 غرام من قاعده النيتروجين الخميرة دون الأحماض الامينيه. 1.9 غرام من الملحق التسرب دون uracil, لوسين, و التربتوفان; 15 غرام من أجار. و 0.076 غرام من التربتوفان في 800 مل من الماء المقطر. الاوتوكلاف لمده 20 دقيقه وبارده في 56 درجه مئوية حمام المياه حتى درجه الحرارة هو ~ 50 − 60 درجه مئوية. باستخدام ماصه 50 mL المصلية أو اسطوانه معقمه تخرج ، أضافه 200 mL من محلول الجلوكوز أعدت في الخطوة 1.1. تصب في لوحات مم 100 باستخدام ~ 20 مل من وسائل الاعلام لكل لوحه.
  9. اعداد التسرب الاصطناعي (SD) اليوراسيل (Ura-) ليوسين (ليو-) أجار الغالاكتوز. ل 1 لتر ، تذوب 6.7 غرام من قاعده النيتروجين الخميرة دون الأحماض الامينيه. 1.9 غرام من الملحق التسرب دون uracil, لوسين, و التربتوفان; 15 غرام من أجار. و 0.076 غرام من التربتوفان في 800 مل من الماء المقطر. الاوتوكلاف لمده 20 دقيقه وبارده في 56 درجه مئوية حمام المياه حتى درجه الحرارة هو ~ 50 − 60 درجه مئوية. باستخدام ماصه 50 mL المصلية أو اسطوانه معقمه تخرج ، أضافه 200 mL من محلول الغالاكتوز أعدت في الخطوة 1.2. اخلطي جيدا بواسطة الدوران برفق أو وضعيه علي لوحه تحريك. تصب في لوحات مم 100 باستخدام ~ 20 مل من وسائل الاعلام لكل لوحه.
  10. اعداد التسرب الاصطناعي (SD) اليوراسيل (Ura-) ليوسين (ليو-) الجلوكوز مرق. ل 1 لتر ، تذوب 6.7 غرام من قاعده النيتروجين الخميرة دون الأحماض الامينيه. 1.9 غرام من الملحق التسرب دون uracil, ليوسين, التربتوفان; و 0.076 غرام من التربتوفان في 800 مل من الماء المقطر. الاوتوكلاف لمده 20 دقيقه وبارده في 56 − 60 درجه مئوية حمام المياه حتى درجه الحرارة هو ~ 50 درجه مئوية. باستخدام ماصه 50 mL المصلية أو اسطوانه معقمه تخرج ، أضافه 200 mL من محلول الجلوكوز أعدت في الخطوة 1.1.
  11. اعداد محلول البولي إيثيلين غليكول (PEG) . أضافه 50 ٪ ث/الخامس من البولي إيثيلين جلايكول 3350 في الماء المقطر. تعقيم عن طريق التعقيم.
  12. اعداد 1 متر خلات الليثيوم (LiAc) عن طريق تذويب 10.2 g من خلات الليثيوم ديهيدرات في 200 mL من الماء المقطر. تعقيم عن طريق التعقيم.
  13. اعداد الرنجة السائل المنوي DNA. تمييع 10 ملغ/مل الرنجة السائل المنوي الحمض النووي إلى 2 ملغ/مل باستخدام الماء المقطر. يسخن عند 100 درجه مئوية لمده 5 دقائق ومكان علي الفور علي الجليد لمده 5 دقائق.

2. استنساخ الجينات من الفائدة في الخميرة سميه بلازميد pYesNTA-كان

ملاحظه: حاليا ، هناك مجموعه متنوعة من ناقلات سميه الخميرة المتاحة علي حد سواء تجاريا وأكاديميا. ويمكن استخدام شاشه الخميرة المثبطة بالتزامن مع العديد من هذه المتجات شريطه ان البلازما التعبير عن البروتين المستجيب من الفائدة يستخدم اختيار التسرب غير اليوراسيل وعلامة المضادات الحيوية بخلاف BlaR. استخدم هذا العمل المتجه pyesnta المعدل4،5 الذي يتضمن كاسيت مقاومه كاناميسين لاجراء فحص أسهل للمثبطين المحتملين. ويجب ان يسمح مخطط الاستنساخ للبروتين المستجيب ان يكون في الإطار مع مروج غال وعلامته. واستخدمت البروتين الغشاء الكلاميديا الرمد النسيجي CT229 كدليل علي مبدا لهذه المقايسات.

  1. استخدام PCR لتضخيم CT229 من c. الحمض النووي الجينوم الجينية اتباع تعليمات الشركة المصنعة باستخدام CT229 + 1 Kpn F (CCGGTACCATGAGCTGTTCTATTTATTKAGGT) والإشعال CT229 xhoi (CCCTCGAGTTTTK.GGGGGGGGGATGGCP.). استخدم شروط PCR التالية: (1) 98 درجه مئوية لمده 30 ثانيه ؛ (2) 98 درجه مئوية ل 10 ثانيه ، 55 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، 72 درجه مئوية لمده 2 دقيقه ؛ (3) كرر الخطوة 2 لما مجموعه 25x ؛ (4) 72 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ؛ و (5) 4 درجه مئوية عقد.
  2. حللت 5 [ميكرول] من ال [بكر] منتوج علي 1% [اغبرز] هلام (شكل 1).
  3. تنقيه المتبقية 45 μL من الحمض النووي باستخدام مجموعه تنقيه PCR بعد تعليمات الشركة المصنعة.
  4. هضم 50 μL من المنقية PCR ادراج و pYesNTA-كان (الشكل 2) ل 1 ح في 37 درجه مئوية في حمام مياه باستخدام KPNI-Hf و XHOI-hf.
    ملاحظه: بالنسبة pyesnta-كان ، هضم 5 ميكروغرام من البلازميد باستخدام 5 ميكرولتر من kpni-hf ، 5 ميكرولتر من xhoi hf ، و 6 ميكرولتر من المخزن المؤقت في حجم إجمالي 60 ميكرولتر. لادراج ، هضم كامل 50 μL من المنتج PCR المنقي باستخدام 2 μL من KpnI-HF ، 2 μL من XhoI HF ، و 6 μL من العازلة.
  5. تشغيل كامل الهضم البلازميد علي 1 ٪ هلام اجبرز. قم بتنقية البلازما المهضومة باستخدام طقم استخراج الهلام بعد تعليمات الشركة المصنعة.
  6. تنقيه ادراج PCR هضم باستخدام مجموعه تنقيه PCR بعد تعليمات الشركة المصنعة.
  7. استنساخ ادراج في pyesnta-كان باستخدام 2 μl من pyesnta-كان (الخطوة 2.5) ، 2 μl من الحمض النووي يغاز العازلة ، 1 μl من T4 يغاز ، و 15 μl من ادراج (الخطوة 2.6). احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 1 ساعة.
  8. أضافه رد فعل الاستنساخ بأكمله إلى 50 μL من e. القولونية الخلايا المختصة وأداء رد فعل التحول.
  9. لوحه رد فعل التحول بأكمله علي لوحه LB تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين.
  10. تطعيم 10 مل من LB تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين مع ثلاث مستعمرات فرديه. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 150 دوره في الدقيقة.
  11. عزل البلازميد باستخدام مجموعه مينيميد البلازميد اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  12. تسلسل البلازميدات المعزولة باستخدام الإشعال الخاصة بالجينات (الخطوة 2.1).

3. اختبار البروتين من الفائدة للسمية في الخميرة

  1. خط ساكاروميسز سيريفيسياي W303 علي أجار ypd (الخطوة 1.3) للحصول علي مستعمرات معزولة. احتضان في 30 درجه مئوية ل 24 ساعة.
  2. تطعيم 10 مل من مرق YPD (الخطوة 1.4) مع مستعمره واحده من لوحه أجار (الخطوة 3.1). احتضان في 30 درجه مئوية مع اهتزاز في 150 دوره في الدقيقة بين عشيه وضحيها.
  3. أضافه 0.5 mL من الثقافة بين عشيه وضحيها إلى 10 مل من مرق YPD (الخطوة 1.4) واحتضان في 30 درجه مئوية مع الاهتزاز في 150 دوره في الدقيقة ل 4 ح.
    1. بيليه 10 مل من الثقافة في 3,000 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c.
    2. أعاده تعليق بيليه في 1 مل من المياه المعقمة ، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي ، وبيليه في 3,000 x g ل 1 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    3. أعاده التعليق بيليه في 1 مل من 1 مم خلات الليثيوم (LiAc) وبيليه في 3,000 x g ل 1 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    4. كرر غسل LiAc 2x.
    5. أزاله الغسيل. أعاده تعليق بيليه في 2.4 mL من 50% الوتد 3350. أضافه 360 μL من 1M LiAc ، 500 μl من 2 ملغ/مل من الحمض النووي الرنجة السائل المنوي ، و 400 μl من المياه المعقمة.
      ملاحظه: هذا كافيه ل 20 التحويلات.
    6. أضافه 180 μL من مزيج التحول من الخطوة 3.3.5 إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي علي 5 μL من pYesNTA-كان CT229 بلازميد الحمض النووي (100 − 500 ng) من الخطوة 2.12.
    7. احتضان في حمام مائي في 30 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    8. احتضان في حمام مائي في 42 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    9. بيليه في 3,000 x g لمده 1 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    10. أزاله مزيج التحول مع الماصة. أعاده تعليق بيليه في 100 μL من المياه المعقمة. لوحه التحول علي SD مورا- أجار مع الجلوكوز (الخطوة 1.5).
    11. احتضان لوحات في 30 درجه مئوية ل 48 h.
  4. تطعيم 5 مل من SD Ura- مرق يحتوي علي الجلوكوز (الخطوة 1.7) مع مستعمره واحده من لوحه. احتضان بين عشيه وضحيها في 30 درجه مئوية مع اهتزاز في 150 لفه في الدقيقة. وتشمل الخميرة تحولت مع ناقل وحده كعنصر تحكم سلبي.
    1. أضافه 180 μL من المياه المعقمة إلى 5 ابار من صفيحه بئر 96 (A2 − A6).
    2. دوامه الثقافة بين عشيه وضحيها لخلط.
    3. أضافه 180 μL من الخميرة إلى البئر الأول (A1). يخفف ال1:10 بشكل متسلسل (سته عينات في المجموع بما في ذلك المخفف).
    4. باستخدام ماصه متعددة القناات ، بقعه 5 μl من كل تخفيف علي SD ura-الجلوكوز (الخطوة 1.5) و ura- لبن (الخطوة 1.6) لوحات أجار. احتضان في 30 درجه مئوية ل 48 h.
  5. تقييم السمية عن طريق مقارنه نمو الخميرة التعبير عن البروتين المستجيب من الفائدة المزروعة علي وسائل الاعلام التي تحتوي علي الغالاكتوز لنمو الخميرة التعبير عن المتجه وحده.
  6. تاكيد التعبير عن البروتين الانصهار له علامة من قبل الغربية التنقيط.

4. تحويل الخميرة السامة مع الخميرة الجينوم مكتبه

  1. تطعيم 100 مل من SD مورا- مرق الجلوكوز (الخطوة 1.7) باستخدام 1 مل من الأسهم من الخطوة 3.4. احتضان ل 16 − 24 ح في 30 درجه مئوية مع اهتزاز في 150 لفه في الدقيقة. ضع 900 مل من مرق الجلوكوز SD Ura عند 30 درجهمئوية بين عشيه وضحيها لتسخين وسائل الاعلام.
  2. أضافه 100 mL كامل من الثقافة بين عشيه وضحيها إلى قارورة 1 لتر المسخن. احتضان لمده 4 − 5 ح في 30 درجه مئوية مع اهتزاز في 150 لفه في الدقيقة.
    1. بيليه الثقافة في 6,000 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c.
    2. تجاهل الخارقة. أعاده تعليق بيليه في 250 mL من المياه المعقمة. بيليه الثقافة في 6,000 x g ل 5 دقيقه في 4 °c.
    3. تجاهل الخارقة. أعاده تعليق بيليه في 250 مل من 1 مم LiAc. بيليه الثقافة في 6,000 x g ل 5 دقيقه في 4 °c.
    4. أزاله LiAc وأعاده تعليق بيليه في 9.6 مل من 50 ٪ PEG 3350. أضافه 1.44 mL من LiAc 1M ، 2 مل من 2 ملغ/مل الرنجة السائل المنوي DNA ، 50 ميكروغرام من مكتبه pYep13 الجينوم (ATCC 37323). ضبط حجم إلى 15 مل مع الماء المعقم. اخلطه برفق عن طريق الانقلاب.
    5. احتضان في حمام مائي في 30 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    6. أضافه 750 μL من ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) لتعزيز كفاءه التحول. احتضان في حمام مائي في 42 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. مزيج من قلب لطيف كل 10 دقيقه.
    7. بيليه الخميرة في 3,000 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
    8. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 10 مل من الماء المعقم. بيليه في 3,000 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
    9. أعاده تعليق بيليه في 8 مل من الماء المعقم.
    10. لتحديد كفاءه التحويل ، تمييع 1:10 ولوحه 100 μL من كل تخفيف علي SD Ura- ليو- أجار الجلوكوز (الخطوة 1.8).
    11. لوحه 200 μL من العينة علي SD اورا- ليو- غاكتوز أجار (الخطوة 1.9) لوحات. استخدام لوحات 50 في المجموع.
    12. احتضان عند 30 درجه مئوية ل 48 − 96 h أو حتى تظهر المستعمرات.
      ملاحظه: المستعمرات عموما تظهر علي لوحات أجار الجلوكوز في 48 − 72 h ولوحات أجار الغالاكتوز في 72 − 96 ح.
  3. المستعمرات التصحيح (الإنقاذ المحتملة) علي SD Ura- ليو- أجار لبن (الخطوة 1.9) لتوسيع وجعل الأوراق المالية. احتضان في 30 درجه مئوية ل 24 − 48h.
  4. تطعيم 5 مل من SD Ura- ليو- مرق الجلوكوز (الخطوة 1.10) باستخدام جزء من التصحيح. احتضان بين عشيه وضحيها في 26 درجه مئوية مع اهتزاز في 150 لفه في الدقيقة.
    1. أضافه 180 μL من المياه المعقمة إلى 5 ابار من صفيحه بئر 96 (A2 − A6).
    2. دوامه الثقافة بين عشيه وضحيها لخلط.
    3. أضافه 180 μL من الخميرة إلى البئر الأول (A1). يخفف ال1:10 بشكل متسلسل (سته عينات في المجموع بما في ذلك المخفف).
    4. باستخدام ماصه متعددة القناات ، بقعه 5 μl من كل تخفيف علي sd ura-الجلوكوز و sd ura- لبن لوحات أجار. وتشمل المستجيب السامة وحدها كعنصر تحكم.
    5. احتضان في 30 درجه مئوية ل 48 h.
  5. قارن نمو الخميرة التي تعبر عن المستجيب السام وحده إلى الخميرة التي تحتوي علي المثبطات المحتملة. المضي قدما فقط مع المثبطات المحتملة التي قد تضاءلت سميه مقارنه مع الخميرة التعبير عن المستجيب وحدها.

5. تحديد وتاكيد المثبطات

  1. تطعيم 5 مل من SD Ura- ليو- مرق الجلوكوز (الخطوة 1.10) مع 100 μl من الخميرة من الخطوة 4.4 واحتضان بين عشيه وضحيها في 30 درجه مئوية مع الاهتزاز في 150 دوره في الدقيقة.
    1. بيليه الخميرة في 3,000 x g لمده 2 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. تخلصي من الديدان برفق باستخدام ماصه.
    2. عزل البلازميد مع الخميرة البلازميد مجموعه مينيميد بعد تعليمات الشركة المصنعة.
  2. تحويل البلازميد معزولة في الخلايا المختصة e. القولونية ولوحه التحول بأكمله علي أجار LB مع 100 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين. احتضان في 37 درجه مئوية ل 24 ساعة.
  3. تطعيم 10 مل من مرق LB تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل من كاربينسيلين ، مع ثلاث مستعمرات من لوحه واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها مع اهتزاز في 150 دوره في الدقيقة.
    1. الثقافات بيليه في 3,000 x g لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. عزل البلازميد باستخدام مجموعه مصغره الاعداديه اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  4. أعاده تحويل الخميرة السامة مع البلازميدات المعزولة من الخطوة 5.3.1 اتباع الخطوات المذكورة في الجزء 3 من البروتوكول.
    1. تطعيم 5 مل من SD Ura- ليو- مرق الجلوكوز مع مستعمره من لوحه التحول. احتضان بين عشيه وضحيها في 30 درجه مئوية مع اهتزاز في 150 لفه في الدقيقة.
    2. بقعه علي اورا- ليو- الجلوكوز و لبن أجار لتاكيد قمع سميه.
  5. تسلسل باستخدام pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) و pYep13 R (TGATGCCGGCCACGATGC) الإشعال لتحديد الخميرة ORFs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قبل ان يمكن اجراء الشاشة الفعلية الخميرة المثبطة ، يجب اختبار البروتين المستجيب من الفائدة للسمية في الخميرة. ويتم ذلك عن طريق التعبير عن البروتين من الفائدة في الخميرة تحت سيطرة مروج الصبار المحرض. وينبغي أولا مقارنه النمو علي الجلوكوز (ظروف غير محفزه) لضمان السمية هو علي وجه التحديد بسبب التعبير عن البروتين من الفائدة وليس عيبا عاما. وكما هو مبين في الشكل 3، تتجلى السمية كمستعمرات أصغر و/أو انخفاض في النمو. وانخفاض السجل 2 − 3 في نمو الخميرة مثاليه للشاشات المثبطة الخميرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول الإجراءات خطوه بخطوه لتحديد المسارات البيولوجية المضيفة التي تستهدفها البروتينات البكتيرية باستخدام سميه الخميرة المعدلة والشاشة المثبطة. سلاله الخميرة المستخدمة ، s. سيريفيسياي W303 ، هو اوكتروفيك لكل من اليوراسيل و ليوسين. يستخدم uracil اوكتروفي من سلاله لتحديد الخميرة التي تحمل البروتين من الفائدة علي المتجات pYesNTA-كان في حين يستخدم لوسين اوكتروفي لتحديد لpYep13 الخميرة الجينوم مكتبه ناقلات. الخميرة البلازميدات مكتبه الجينوم تحمل 3 − 13 ORFs ، لذلك يجب ان يكون كل ORF المستنسخة بشكل فردي ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر شيلبي أندرسون ، وابي ماكلوف ، ولوريل وودز لمساعدتهم في هذه التقنيات. تم تمويل هذه الدراسة من قبل صناديق بدء التشغيل من جامعه أيوا قسم الميكروبيولوجيا والمناعة لمريم m. ويبر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أجارفيشرBP2641500
GalactoseMilliporeSigmaG0750-1KG
طقم استخراج GeneJetGel ThermoFisher ScientificK0691
طقم تنقية GeneJet PCRThermoFisher ScientificK0701
GeneJet طقم التحضير المصغر للبلازميدThermoK0503
الجلوكوزMilliporeSigmaG8270-1KG
الرنجة المنوية DNAPromegaD1811
KpnI-HFنيو إنجلاند BiolabsR3142S
خلات الليثيوم ثنائي هيدراتMilliporeSigmaL6883-250G
PeptoneFisher Scientific
Phusion عالية الدقة DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530
بولي (إيثيلين جلايكول) 3350ميليبورسيجما1546547-1G
pYep13ATCC37323
T4 DNA ligaseنيو إنجلاند بيولابيسM0202S
التربتوفانميليبورسيجما470031-1G
XhoI-HFنيو إنجلاند BiolabsR0146S
مستخلص الخميرةفيشر ScientificBP1422-500
مجموعة الخميرة الصغيرةZymoD2001
قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينيةMilliporeSigmaY0626-250G
الخميرة الاصطناعية المتسربة المكملات الغذائية المتوسطةMilliporeSigmaY1501-20Gبدون
الخميرة الاصطناعية المكملات الغذائية المتوسطةMilliporeSigmaY1771-20Gبدون يوراسيل ، ليوسين ، تربتوفان
العلمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119(1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070(1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21(2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989(2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Toxicity ScreenSuppressor ScreenBacterial Effector ProteinsHost Pathway IdentificationChlamydia trachomatisYeast Genomic LibraryPlasmid TransformationGrowth Defect AssaySerial DilutionDouble Drop out Agar

Related Articles