مقالة منهجية

تحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية في الشلل النصفي التشنجي الوراثي

DOI:

10.3791/60548

⸱

فبراير 9, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Bioengineering, University of Illinois at Chicago, 3MD Program, University of Illinois College of Medicine Rockford

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشارك ضعف نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في مختلف الأمراض العصبية التنكسية. يستخدم البروتوكول المقدم الخلايا العصبية الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة لتقييم نقل الميتوكوندريا والمورفولوجيا في الشلل النصفي التشنجي الوراثي. يسمح هذا البروتوكول بتوصيف الاتجار بالميتوكوندريا على طول المحاور وتحليل مورفولوجيا ها ، مما سيسهل دراسة الأمراض العصبية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية لديها مطالب مكثفة للحصول على طاقة عالية من أجل دعم وظائفها. وقد لوحظ ضعف نقل الميتوكوندريا على طول محاور عصبية في الخلايا العصبية البشرية, التي قد تسهم في التنكس العصبي في مختلف الدول المرض. على الرغم من أنه من الصعب دراسة ديناميات الميتوكوندريا في الأعصاب البشرية الحية ، فإن مثل هذه النماذج حاسمة لدراسة دور الميتوكوندريا في التنكس العصبي. وصف هنا هو بروتوكول لتحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا الميتوكوندريا في محاور عصبية الدماغ الأمامية المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة الإنسان (iPSCs). يتم تمييز iPSCs إلى الخلايا العصبية الجلوتامات telencephalic باستخدام أساليب راسخة. يتم تلطيخ الميتوكوندريا من الخلايا العصبية مع MITOTracker CMXRos، ويتم التقاط حركة الميتوكوندريا داخل محاور عصبية باستخدام مجهر التصوير الخلية الحية مجهزة حاضنة لثقافة الخلايا. يتم تحليل الصور الفاصلة الزمنية باستخدام البرامج مع "MultiKymograph" ، "المستورد Bioformat" ، والإضافات "وحدات الماكرو". يتم إنشاء Kymographs النقل الميتوكوندريا، ويتم قراءة متوسط سرعة الميتوكوندريا في الاتجاهات الانتريوية وإلى الوراء من الكيموغراف. فيما يتعلق بتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا ، يتم الحصول على طول الميتوكوندريا والمنطقة ونسبة العرض إلى الارتفاع باستخدام ImageJ. وباختصار، يسمح هذا البروتوكول بتوصيف الاتجار بالميتوكوندريا على طول محاور عصبية وتحليل مورفولوجيا ها لتسهيل دراسات الأمراض العصبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الحركة التوزيعية الميتوكوندريا دورًا حيويًا في تلبية المطالب النشطة المتغيرة والمتخصصة في الخلايا العصبية المستقطبة. الخلايا العصبية يمكن أن تمتد محاور طويلة للغاية للتواصل مع الأهداف من خلال تشكيل نقاط الاشتباك العصبي، والتي تتطلب مستويات عالية من الطاقة لكاليفورنيا2 + التخزين المؤقت والتيارات الأيون. نقل الميتوكوندريا من سوما إلى محور عصبي أمر بالغ الأهمية لدعم وظيفة المحاور العصبية ومتشابك من الخلايا العصبية. يتم إجراء حركة الميتوكوندريا الديناميكية مكانيًا وزمنيًا عن طريق النقل المحوري السريع بمعدلات عدة ميكرومترات في الثانية1.

على وجه التحديد، البروتينات الحركية أو المحولة، مثل kinesin وdynein، والمشاركة في النقل العضي السريع على طول microtubules للسيطرة على حركة الميتوكوندريا2،3. يتطلب النشاط العصبي العادي النقل السليم للميتوكوندريا المجمعة حديثًا من سوما الخلايا العصبية إلى محور عصبي بعيد (النقل المحوري الأنتري) والنقل العكسي للميتوكوندريا من محور عصبي بعيد إلى جسم الخلية (النقل الرجعي). وقد أشارت الدراسات الحديثة إلى أن تخصيص الميتوكوندريا غير لائق يرتبط بقوة مع عيوب الخلايا العصبية والأمراض التنكسية الخلايا العصبية الحركية4,5. لذلك ، لتشريح دور الميتوكوندريا في التنكس العصبي ، من المهم إنشاء طرق لفحص حركة الميتوكوندريا على طول المحاور في الثقافات الحية.

هناك تحديان رئيسيان في فحص وتحليل تتبع الميتوكوندريا: (1) تحديد الميتوكوندريا من الخلفية في كل إطار ، و (2) تحليل وتوليد الروابط بين كل إطار. في حل التحدي الأول ، يتم استخدام نهج وضع العلامات على نطاق واسع لتمييز الميتوكوندريا عن الخلفية ، مثل صبغة MitoTracker أو الترانفسيفان للميتوكوندريا المنصهر ة الفلورية التي تستهدف البروتين (على سبيل المثال ، mito-GFP)6،7،8. لتحليل الارتباط بين الإطارات ، تم وصف العديد من الخوارزميات وأدوات البرامج في الدراسات السابقة9. في ورقة حديثة، قارن الباحثون أربع أدوات آلية مختلفة (على سبيل المثال، Volocity، Imaris، wrMTrck، وتعقب الفرق) لتحديد النقل الميتوكوندريا. وأظهرت النتائج أنه على الرغم من التناقضات في طول المسار، وإزاحة الميتوكوندريا، ومدة الحركة، والسرعة، فإن هذه الأدوات الآلية مناسبة لتقييم فرق النقل بعد العلاج10. بالإضافة إلى هذه الأدوات ، تم استخدام البرنامج المساعد المتكامل "وحدات الماكرو" لImageJ (كتبه ريتدورف وSeitz) على نطاق واسع لتحليل نقل الميتوكوندريا11. تولد هذه الطريقة الكيموغرافيات التي يمكن استخدامها لتحليل حركة الميتوكوندريا، بما في ذلك السرعة في كل من الاتجاهات السابقة وإلى الوراء.

الميتوكوندريا هي العضيات ديناميكية للغاية التي تتغير باستمرار في العدد والمورفولوجيا استجابة لكل من الحالات الفسيولوجية والمرضية. الانشطار الميتوكوندريا والانصهار تنظيم بإحكام مورفولوجيا الميتوكوندريا والتوازن. يمكن أن يؤدي عدم التوازن بين الانشطار الميتوكوندريا والانصهار إلى شبكات الميتوكوندريا القصيرة أو الطويلة للغاية ، والتي يمكن أن تضعف وظيفة الميتوكوندريا وتؤدي إلى أنشطة عصبية غير طبيعية وانحطاط عصبي. ويشارك ضعف نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في مختلف الأمراض العصبية التنكسية, مثل مرض الزهايمر, مرض باركنسون, مرض هنتنغتون, والشلل النصفي التشنجي الوراثي (HSP)12,13,14,15. HSP هي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات العصبية الموروثة التي تتميز بانحطاط الجهاز القشري والفشل اللاحق في السيطرة على عضلات الأطراف السفلية16،17. في هذه الدراسة, وتستخدم الخلايا العصبية الأمامية المستمدة من iPSC لتقييم نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في HSP. توفر هذه الطريقة نموذجًا فريدًا لفحص ديناميكيات الميتوكوندريا من المحاور العصبية في الثقافات الحية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد الخلايا العصبية الجلوتامات من iPSCs telencephalic

ملاحظة: البروتوكول التفصيلي للحفاظ على iPSCs وتمايزها إلى الخلايا العصبية الجلوتامية telencephalic مماثلة لتلك التي وصفت سابقا18. هنا ، يتم إدخال العملية الحرجة أثناء تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وتسليط الضوء عليها.

  1. الثقافة iPSCs على الخلايا الليفية الجنينية الفأر (MEF) مغذيات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) المتوسطة تستكمل مع عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF، 4 نانوغرام /مل).
  2. بعد الحضانة مع dispase (1 ملغ / مل) لمدة 3 دقيقة ، وفصلها iPSCs إلى كتل صغيرة. ثم، ثقافة المجاميع iPSC في تعليق في وسط hESC لمدة 4 أيام. الرجوع إلى هذه النقطة الزمنية، عندما تبدأ iPSCs كثقافة التعليق، كيوم 1 (D1). تغيير المتوسط يوميا لمدة 4 أيام.
  3. في D5، جمع المجاميع iPSC بعد الطرد في 200 × ز لمدة 2 دقيقة والثقافة في وسائل الإعلام التعريفي العصبي (NIM) لمدة 3 أيام. ثقافة الخلية المجاميع في تعليق لمدة 3 أيام عن طريق تغيير نصف وسائل الإعلام كل 2 أيام. أضف DMH-1 (2 ميكرومتر) وSB431542 (2 ميكرومتر) إلى متوسط NIM لزيادة كفاءة الاستقراء العصبي.
  4. في D8، جمع المجاميع iPSC بعد الطرد في 200 × ز لمدة 2 دقيقة والسماح لهم الانضمام إلى 6 لوحات بئر (حوالي 20-30 المجاميع لكل بئر من لوحة) عن طريق الاستزراع في NIM مع FBS 10٪ (أو مع لوحات مغلفة لامينين) بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بإزالة الوسط القديم وتغييره إلى NIM كل يومين حتى D17.
    ملاحظة: يلاحظ توليد الخلايا العصبية البُرَبية، التي يُشار إليها من خلال تكوين خلايا عمودية ذات هياكل وردية، في هذه الفترة.
  5. في D17 ، عزل الخلايا العصبية في وسط المستعمرات ميكانيكيًا (الرفع مباشرة عن طريق الضغط الصغير على مركز المستعمرات) أو الأنزيمية (تعامل مع dispase). نقل الخلايا العصبية المعزولة إلى زراعة الأنسجة غير المعالجة T25 قارورة تحتوي على 8 مل من NIM مع إضافة B27 (1x)، cAMP (1 ميكرومتر)، ومنتدى إدارة الإنترنت (10 نانوغرام / مل).
    ملاحظة: تسمح ثقافة التعليق للخلايا بتكوين خلايا عصبية يتم إثراؤها بالسلف العصبية للإسقاط القشري.
  6. بعد D35، لوحة neurospheres على بولي أورنيثين وLDEV خالية من انخفاض عامل النمو مصفوفة غشاء الطابق السفلي(جدول المواد)المغلفة 35 ملم الأطباق الزجاجية القاع لتوليد الخلايا العصبية الجلوتامات telencephalic (الخلايا العصبية الإسقاط القشرية). قبل الطلاء ، فصل الخلايا العصبية إلى مجموعات صغيرة عن طريق الاحتضان مع محلول مفرزة الخلية 1 ملغ / مل لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. إزالة حل انفصال الخلية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق في 1 مل من وسط التمايز العصبي (NDM). خلايا لوحة على الطبق السفلي الزجاجي (حوالي خمس مجموعات في 100 ميكرولتر من المتوسط لكل طبق) للسماح لهم بإرفاق. ثم أضف NDM (1 مل لكل طبق) وزراعة الخلايا في NDM التي تحتوي على B27 (1x) و cAMP (1 μM) وIGF (10 نانوغرام / مل) وhBDNF (10 نانوغرام / مل) و GDNF (10 نانوغرام / مل).
    ملاحظة: يتم مطلي مجموعات صغيرة لأنها البقاء على قيد الحياة بشكل جيد، وتؤدي إلى الخلايا العصبية الإسقاط طويلة. بدلا من ذلك، يمكن فصل الخلايا ومطلي بكثافة حوالي 20،000 خلية لكل طبق لفصل أفضل.
  8. تميز الخلايا العصبية الجلوتاماتية telencephalic عن طريق التحسس المناعي علامات Tbr1 و αIII-tubulin.

2. فحص نقل الميتوكوندريا على طول محاور عصبية من الخلايا العصبية الجلوتاماتية telencephalic

  1. احماء NDM وتحويل على حاضنة المجهر الفلوري تعيين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. لتصور الميتوكوندريا على طول محاور عصبية الدماغ، احتضان الخلايا العصبية مع 50 nM صبغة الفلورسنت الحمراء لوصمة الميتوكوندريا في الخلايا الحية (على سبيل المثال، MitoTracker CMXRos) في NDM لمدة 3 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد ذلك، غسل الخلايا 2x مع NDM الدافئة. يتم احتضان الخلايا العصبية في NDM.
  3. من أجل تسجيل نقل الميتوكوندريا على طول محاور عصبية، واتخاذ الصور الفاصل الزمني لحركة الميتوكوندريا باستخدام الهدف 40x مع المجهر الفلوري.
    ملاحظة: لتحقيق الاستقرار في الثقافة، قم بإجراء تصوير الخلية الحية عندما يتم احتضان الخلايا في الحاضنة لمدة 20 دقيقة بعد تلطيخ الميتوكوندريا.
  4. تحت مجال المرحلة، وتحديد محاور عصبية على أساس الخصائص المورفولوجية (يخرج مباشرة من جسم الخلية العصبية، النيوتات طويلة رقيقة ثابتة مع عدم وجود تفريع). الميتوكوندريا تتحرك في anterograde (من جسم الخلية إلى محور عصبي بعيد) والاتجاهات الرجعية (من محطة محاور عصبية إلى جسم الخلية). للتمييز بين اتجاه حركة الميتوكوندريا على طول محاور عصبية، حدد بوضوح أجسام الخلايا العصبية. في هذه الخطوة، ركز محاور عصبية تحت حقل المرحلة للحد من التبييض الضوئي.
  5. بعد التمييز بين جسم الخلية ومحور عصبي، ضبط وقت التعرض والتركيز من الميتوكوندريا في محاور عصبية. ثم، التقاط نقل الميتوكوندريا داخل محاور عصبية كل 5 s لمدة إجمالية قدرها 5 دقيقة، مما أسفر عن 60 إطارات. التقاط عشوائي خمسة مواقع لكل طبق وتكرار 3x لكل مجموعة.

3. تحليل البيانات من نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية القشرية

ملاحظة: تحليل البيانات التي تم جمعها عن نقل الميتوكوندريا باستخدام برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال، ImageJ أومتحول19). منذ ImageJ هو متاح بسهولة ، وإجراء تحليل النقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا باستخدام ImageJ مع MultiKymograph، وحدات الماكرو، وتحليل المكونات الإضافية الجسيمات.

  1. تحليل نقل الميتوكوندريا باستخدام ImageJ
    1. بعد التقاط الصور الفاصلالزمني ة من حركية الميتوكوندريا، وتحليل سرعة وحركة الميتوكوندريا باستخدام البرنامج المساعد MultiKymograph. يتم حفظ الصور كملفات تنسيق .tiff ، والتي يتم تحليلها من قبل برنامج فيجي بعد طريقة تم الإبلاغ عنها مسبقًا20.
    2. تحميل برنامج فيجي. تحميل الإضافات التي ستكون هناك حاجة لتحليل سرعة التحرك الميتوكوندريا من kymographs. تحميل حزمة Bio-تنسيقات والمساعد Kymograph جنبا إلى جنب مع هذه الإضافات .class الأربعة، بما في ذلك: MultiKymograph.class، MultipleOverlay.class، StackDifference.class، وWalkingAverage.class (جدول المواد). نقل هذه الملفات إلى مجلد الإضافات فيجي. تحميل "tsp050706.txt" الإضافات إلى مجلد الإضافات. إعادة تشغيل برنامج فيجي عندما يتم نقل الملفات إلى مجلد الإضافات.
    3. فتح البرمجيات فيجي. اختيار الإضافات، ثم استيراد الصور من سلسلة.tiff من خلال Bio- تنسيقات المستورد تحت Bio -الأشكال. تأكد من اختيار ImageJ القياسية في عرض المكدس،واختيار فتح جميع المسلسلات،والتحقق من Autoscale،ثم انقر فوق موافق. يحيط علما رقم الإطار وحجم الصور في بكسل، والتي يتم عرضها في الجزء العلوي من الصورة.
      ملاحظة: خذ 60 إطارًا لكل صورة.
    4. فكر في جعل الصور أكثر وضوحًا عن طريق ضبط السطوع / التباين تحت قائمة الصور لجميع الإطارات الـ 60.
    5. انقر بزر الماوس الأيمن على أداة الخط لاختيار خط مجزأ ورسم خط مجزأ يبدأ من جسم الخلية وينتهي عند محور المحطة الطرفية. توليد kymograph عن طريق اختيار MultiKymograph تحت الإضافات. تتم المطالبة بتحديد عرض الخط بعد اختيار MultiKymograph. تأكد من أن هذا رقم فردي. اختر 1 لعرض الخط. يتم إنشاء كيموجراف بعد هذه الخطوة.
      ملاحظة: يمكن قراءة العديد من أجزاء هامة من المعلومات من الكيموغراف. المحور ص من كيموغراف هو الوقت من المدة (5 دقيقة) لإطارات 60. يمثل المحور س موضع المحاور المحددة.
    6. استخدام خط قطري في الكيموغراف لتحديد اتجاه حركة الميتوكوندريا (ما قبل الوراء، الوراء، أو مستقرة). على سبيل المثال، يشير خط إلى أسفل إلى اليمين على طول المحور ص إلى حركة ما قبل الرُص، ويشير خط إلى أسفل إلى اليسار على طول المحور ص إلى حركة رجعية. يشير الخط العمودي إلى أنه لم تكن هناك حركة في المياتوشوندريون.
    7. قياس المسافة، والقيم الزمنية، والسرعة للالميتوكوندريا المتحركة باستخدام البرنامج المساعد ماكرو في برنامج فيجي. انتقل إلى الإضافات | وحدات الماكرو | تثبيت | tsp050607.txt. رسم خط مجزأة على أثر حركة الميتوكوندريا على الكيموغراف ، ودائما رسم الخط من المنطقة العليا إلى أدنى (ص المحور).
    8. بعد رسم الخط ، انتقل إلى الإضافات | وحدات الماكرو | قراءة السرعات من ملعقة صغيرة. نظرًا لأنه يتم رسم خط مجزأ على طول التتبع ، يقرأ المكون الإضافي سرعات مجزأة تقابل الخط.
      ملاحظة: الوحدة لكافة البيانات هي وحدات بكسل. dy مجموع هو الوقت المستهلك من نقطة البداية، وdx مجموع يشير إلى مسافة mitochondrion تتحرك في المحور س. dy الآن وdx يظهر الآن الوقت الفترة ومسافة الحركة لكل شريحة، على التوالي. السرعة الفعلية تظهر السرعة لكل شريحة (dx الآن / dy الآن). يشير متوسط السرعة إلى متوسط سرعة الميتوكوندريا المتحركة (مجموع dx/dy).
    9. تغيير وحدة dx الآن من بكسل إلى ميكرومتر كنسبة بكسل في μm عن طريق قياس شريط المقياس. قم بتحويل الوحدة للمسافة من البكسل إلى الميكرومتر عن طريق قياس أشرطة المقياس في الصور. استخدم أداة الخط لرسم خط على طول شريط المقياس وقياس طول الخط عن طريق اختيار Measure' تحت "تحليل. تغيير الوقت من بكسل إلى ثانية، كـ 1 بكسل = 5 ثوان في هذه التجربة.
    10. في ملف جدول البيانات، قم بحساب متوسط السرعة وتسمية الحركة الرجعية أو السابقة. متوسط سرعة الحركة السابقة أو الرجعية.
    11. تحديد النسبة المئوية للالميتوكوندريا الثابتة والمتحركة من الكيموغراف. يتم تعريف الميتوكوندريا المتحركة الانتريوية أو الرجعية بأنها تتحرك 5 ميكرومتر إلى الأمام أو الخلف من الأصل خلال الفترة بأكملها21. تعتبر الميتوكوندريا ثابتة إذا لم تتحرك أكثر من 5 ميكرومتر خلال 5 دقيقة.
  2. تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام ImageJ
    ملاحظة: تحديد مورفولوجيا الميتوكوندريا عن طريق قياس طول الميتوكوندريا والمنطقة ونسبة العرض إلى الارتفاع باستخدام ImageJ. للقيام بذلك، اتبع الخطوات التالية.
    1. من أجل تحليل طول الميتوكوندريا والمنطقة داخل محاور عصبية ، قم بتنزيل البرنامج المساعد Straighten_.jar من موقع ImageJ (انظر جدول المواد)ونقله إلى مجلد الإضافات. إعادة تشغيل برنامج ImageJ.
    2. افتح الصورة من خلال الدالة المفتوحة تحت الملف وتحويل صورة 32 بت إلى 8 بت باستخدام اكتب تحت الصورة.
    3. رسم خط مجزأة على طول محاور عصبية. اختر استقامة تحت الإضافات وتعيين 50 بكسل لعرض خيوط / خط واسع. هذا سوف يولد محور عصبي مستقيم.
    4. ضبط عتبة تحت الصورة وتعيين القياس تحت تحليل عن طريق اختيار "المنطقة | محيط | تناسب القطع الناقص | واصفات الشكل.
    5. قياس شريط المقياس باستخدام وظيفة الخط وتعيين المقياس تحت تحليل عن طريق ملء المسافة في بكسل، تعرف المسافة، ووحدة الطول. ثم اختر عمومية لتعيين إعداد المقياس هذا.
    6. استخدام تحليل الجسيمات تحت تحليل لتحديد المنطقة. معلمات المطالبة هي الحجم (بكسل ^2) = 0.20-ما لا نهاية، ودائرية = 0.00-1.00، وتظهر = القطع الناقص. اختر نتائج العرض.
      ملاحظة: سيؤدي القياس إلى نتائج معلمات مورفولوجيا الميتوكوندريا المتعددة بما في ذلك المساحة ومحيط هاوية الطول (الرئيسية) والعرض (طفيفة) ونسبة العرض إلى الارتفاع (AR). كما يتم سرد رقم الميتوكوندريا المقابل.
    7. حساب عدد الميتوكوندريا لكل محور عصبي (μm) باستخدام عدد الميتوكوندريا مقسومًا على طول المحور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، تم تمييز iPSCs الإنسان إلى الخلايا العصبية الجلوتاميتي ة الخلايا العصبية telencephalic ، والتي تميزت بتلطيخ المناعة مع علامات Tbr1 و αIII tubulin(الشكل 1A). لفحص النقل المحوري للميتوكوندريا ، كانت هذه الخلايا ملطخة بصبغة فلورية حمراء ، وتم إجراء التصوير بفارق زمني. نظرًا لأن ImageJ متاح بسهولة وأسهل في الحصول عليه ، تم تحليل نقل الميتوكوندريا بشكل أكبر باستخدام الإضافات "MultiKymograph" و "Macros" ImageJ ، الموضحة في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المقالة طريقة لتحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في محاور عصبية باستخدام صبغة الفلورسنت الحمراء وبرنامج ImageJ ، وكلاهما يوفر منصة فريدة لدراسة الضمور المحوري ومورفولوجيا الميتوكوندريا في الأمراض العصبية. هناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول ، بما في ذلك تلطيخ الميتوكوندريا ، والتصوير الحي للخلايا ، وتحليل الصور. في هذه الطريقة ، تم استخدام صبغة فلورية لوصمة الميتوكوندريا. نظرًا لأن الخلايا العصبية المشتقة من iPSC البشرية يتم فصلها بسهولة عن الطبق ، فمن المهم ترك بعض المحلول في الطبق وإضافة وسط عصبي. يمك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الشلل النصفي التشنجي، ومؤسسة بليزر، والمعهد الوطني للصحة (R21NS109837).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حل انفصال خلية Accutaseتقنيات الخلايا المبتكرةAT104
شفاط السلامةالحيوية Thermo Scientific1300 SERIES A2
مصل الألبومين البقري (BSA)SigmaA-7906
عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF)Peprotech450-02
جهاز طردمركزي Thermo ScientificSorvall Legend X1R / 75004261
CoverslipsChemiglass Life Sciences1760-012
Cyclic AMP (cAMP)Sigma-AldrichD0627
DispaseGibco17105-041
DorsomorphinSelleckchemS7146
وسط النسر المعدل من Dulbecco مع خليط المغذيات F12 (DMEM / F12) Corning10-092-CV
FBSGibco16141-002
عامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2 ، bFGF)Peprotech100-18B
Geltrex LDEV خالية من عامل النمو المنخفض مصفوفة الغشاء القاعديGibcoA1413201
Gem21 NeuroPlex مكمل غذائي خال منالمصل Gemini400-160
أطباق القاع الزجاجيMatTekP35G-0.170-14-C
ماصات زجاجية مقاس 9 بوصاتVWR14673-043
عامل التغذية العصبية المشتق من Glial (BDNF)Sigma-AldrichD0627
GlutaMAX-IGibco35050-061
HeparinSigmaH3149
عامل نمو الأنسولين 1 (IGF1)InvitrogenM7512
Knockout Serum RepensrGibcoA31815
LamininSigmaL-6274
2-MercaptoethanolSigmaM3148-100ML
MitoTracker CMXRosInvitrogenM7512
Neurobasal mediumGibco21103-049
الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco11140-050
N2 NeuroPle Serum Free ملحقالجوزاء400-163
مجهر أوليمبوس IX83أوليمبوسIX83-ZDC2
PBSكورنينج21-031-CV
مجهر تباين المرحلةأوليمبوسCKX41 / IX2-SLP
6 ألواح آباركورنينج353046
24 لوحة بئركورنينج353047
بولي إل أورنيثين هيدروبروميد (بوليورنيثين))سيجما ألدريتشP3655
SB431542Stemgent04-0010
معقم 50 مل نظام ترشيح فراغ يمكن التخلص منه 0.22 & mu ؛ م ميليبور إكسبريس & ريج; بلس غشاءميليبورSCGP00525
ستريكوب 500/1000 مل ديورابور 0.22 مو ؛ M PVDFMilliporeSCGVU10RE
الجسم المضاد Tbr1 (1: 2000)ChemiconAB9616
مثبط التربسينGibco17075029
50 مل أنابيبفينيكسSS-PH50R
15 ملفينيكسSS-PH15R
T25 (غير معالجة)VWR10861-572
<قوي> الإضافات للبرامج< / strong>
bio-formats Packagehttp://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/< / a>
فيجي البرمجياتhttps://fiji.sc/< / a>
المساعد Kymographhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleKymograph.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
MultipleOverlay.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
WalkingAverage.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
StackDifference.classhttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
Straighten_.jarhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html
tsp050706.txthttps://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html
قوارير البرنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
  2. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
  3. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
  4. Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
  5. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  6. Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
  7. Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
  8. Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948(2009).
  9. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  10. Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
  11. Rietdorf, J. http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html. , Available from: http://www.embl.de/eamnet/html/kymograph.html (2015).
  12. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  13. Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
  14. Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O'Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
  15. Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin's interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
  16. Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
  17. Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
  18. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321(2013).
  19. Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
  20. Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
  21. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  22. Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
  23. Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
  24. Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
  25. Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
  26. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  27. Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
  28. De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
  29. Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
  30. Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
  31. Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
  32. Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
  33. Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
  34. Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
  35. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1(2016).
  36. Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
  37. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, Pt 1 469-477 (1999).
  38. Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
  39. Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MitoTracker ImageJ

مقالات ذات صلة