يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام بيريميدين التناظري ، 5-iodo-2′-deoxyuridine (IdU) مع علامات دورة الخلية لإنشاء مراحل دورة الخلية في منصة قياس الخلايا الجماعية

2.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60556

⸱

أكتوبر 22, 2021

 , 
1Ohio State Comprehensive Cancer Center, Division of Hematology, The Ohio State University

في هذه المقالة

ملخص

يقوم هذا البروتوكول بتكييف قياسات دورة الخلية لاستخدامها في منصة قياس الخلايا الجماعية. مع قدرات متعددة المعلمات لقياس الكتلة الخلوية ، يسمح القياس المباشر لدمج اليود بتحديد الخلايا في المرحلة S بينما تتيح علامات الدورة داخل الخلايا توصيف كل حالة دورة خلية في مجموعة من الظروف التجريبية.

الملخص

يعد تنظيم مرحلة دورة الخلية جانبا مهما من جوانب الانتشار الخلوي والاتزان الداخلي. يعد تعطيل الآليات التنظيمية التي تحكم دورة الخلية سمة من سمات عدد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان. تتطلب دراسة دورة الخلية القدرة على تحديد عدد الخلايا في كل جزء من تقدم دورة الخلية وكذلك التحديد الواضح بين كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. يوفر ظهور القياس الخلوي الشامل (MCM) إمكانات هائلة لتحليل الخلية المفردة عالية الإنتاجية من خلال القياسات المباشرة للنظائر الأولية ، كما أن تطوير طريقة لقياس حالة دورة الخلية بواسطة MCM يزيد من فائدة MCM. هنا نصف طريقة تقيس مباشرة 5-iodo-2′-deoxyuridine (IdU) ، على غرار 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) ، في نظام MCM. يوفر استخدام MCM المستند إلى IdU العديد من المزايا. أولا ، يتم دمج IdU بسرعة في الحمض النووي أثناء تخليقه ، مما يسمح بقياس موثوق للخلايا في المرحلة S مع حضانات قصيرة تصل إلى 10-15 دقيقة. ثانيا ، يتم قياس IdU دون الحاجة إلى أجسام مضادة ثانوية أو الحاجة إلى تدهور الحمض النووي. ثالثا ، يمكن دمج تلطيخ IdU بسهولة مع قياس سيكلين B1 ، وبروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر (pRb) ، والهستون المفسفر H3 (pHH3) ، والذي يوفر مجتمعة تحديدا واضحا لمراحل دورة الخلية الخمس. يسمح الجمع بين علامات دورة الخلية هذه مع العدد الكبير من المعلمات الممكنة مع MCM بالاندماج مع العديد من المقاييس الأخرى.

المقدمة

يتيح قياس الكتلة الخلوي الكشف عن ما يقرب من 40 معلمة من خلال الاستفادة من الدقة العالية والطبيعة الكمية لتحليل الطيف الكتلي. تستخدم الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية بدلا من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور التي تسمح بعدد أكبر من القنوات وتنتج الحد الأدنى من التداعيات 1,2. MCM له مزايا وعيوب فيما يتعلق بتحليل دورة الخلية مقارنة بقياس التدفق الخلوي. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية ل MCM في أن العدد الكبير من المعلمات يتيح القياس المتزامن لحالة دورة الخلية عبر عدد كبير من أنواع الخلايا التائية المتميزة المناعية في عينات غير متجانسة للغاية. تم استخدام MCM بنجاح لقياس حالة دورة الخلية أثناء تكون الدم الطبيعي في نخاع العظمالبشري 3 ونماذج الفئران المعدلة وراثيا لنقص التيلوميراز4. أظهر تحليل حالة دورة الخلية في ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML) أن دورة الخلية مرتبطة بالاستجابات المعروفة للعلاجات السريرية ، مما يوفر نظرة ثاقبة في الجسم الحي للخصائص الوظيفية التي يمكن أن تفيد اختيارات العلاج5. الميزة الثانية لتحليل دورة الخلية الخلوية الجماعية هي القدرة على قياس عدد كبير من العلامات الوظيفية الأخرى التي قد تكون مرتبطة بحالة دورة الخلية. تمكنت الأعمال الحديثة من ربط تخليق البروتين والحمض النووي الريبي بحالة دورة الخلية من خلال استخدام IdU والأجسام المضادة الموسومة بالمعدن إلى BRU و rRNA6. هذا النوع من التحليل البارامتري للغاية الذي يقيس حالة دورة الخلية عبر العديد من المجموعات السكانية في سلسلة متصلة من التمايز سيكون شبه مستحيل مع تقنية قياس التدفق الخلوي الحالية. العيب الرئيسي ل MCM هو عدم وجود بقع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي مماثلة لتلك المستخدمة في قياس التدفق الخلوي الفلوري (على سبيل المثال ، DAPI ، Hoechst ، Pyronin Y ، إلخ). يمكن أن تعطي الأصباغ الفلورية قياسات دقيقة نسبيا لمحتوى الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، ولكن هذه الدقة ممكنة فقط بسبب التغيرات في خصائص الفلورسنت لهذه الأصباغ التي تحدث عند الإقحام بين قواعد النيوكليوتيدات. وبالتالي فإن تحليل MCM غير قادر على قياس محتوى الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بدقة مماثلة. بدلا من ذلك ، يعتمد تحليل دورة الخلية الخلوية الجماعية على قياسات البروتينات المتعلقة بحالة دورة الخلية مثل سيكلين B1 ، وبروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر (pRb) ، وهيستون H3 المفسفر (pHH3) جنبا إلى جنب مع القياس المباشر لذرة اليود من دمج IdU في خلايا المرحلة S. ينتج عن هذين النهجين للقياس نتائج متشابهة للغاية أثناء الانتشار الخلوي الطبيعي ، ولكن يمكن أن يكونا متنافرين عندما يتعطل تقدم دورة الخلية.

يعد قياس عدد الخلايا في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية أمرا مهما في فهم تطور دورة الخلية الطبيعية وكذلك اضطراب دورة الخلية ، والذي يلاحظ بشكل شائع في السرطانات والأمراض المناعية. يوفر MCM قياسا موثوقا للعوامل خارج الخلية وداخل الخلايا باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن. ومع ذلك ، كان قياس المرحلة S محدودا لأن مقحم الحمض النووي القائم على الإيريديوم لم يكن قادرا على التمييز بين الحمض النووي 2N و 4N. من أجل تحديد مراحل دورة الخلية ، طور بهبهاني طريقة تستخدم IdU بكتلة 127 ، والتي تقع ضمن نطاق مقياس الكتلة الخلوية وتسمح بالقياس المباشر للخلايا في المرحلةS 3. يتحايل هذا القياس المباشر على الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية أو استخدام عوامل تغيير طبيعة الحمض النووي مثل الحمض أو DNase. بالاقتران مع علامات ركوب الدراجات داخل الخلايا ، فإنه يسمح بدقة عالية لتوزيع دورة الخلية في النماذج التجريبية.

يتكيف هذا البروتوكول مع قياسات دورة الخلية من بروتوكولات قياس التدفق الخلوي الشائعة ل MCM. توفر أساليبنا طريقة مريحة وبسيطة لتضمين معلمات دورة الخلية. يتطلب دمج IdU للعينات في المختبر من 10 إلى 15 دقيقة فقط من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، وهو أقصر من معظم بروتوكولات تلطيخ BrdU التي توصي بأوقات حضانة لعدة ساعات 3,7. يمكن تثبيت العينات المدمجة IdU و BrdU باستخدام مثبت بروتيني ثم تخزينها لبعض الوقت في مجمد -80 درجة مئوية. وهذا يسمح بأرشفة أعداد كبيرة من العينات الملطخة ب IdU لتحليل الدفعات دون تقليل جودة العينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد مخزونات IdU

  1. قم بإذابة 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) في DMSO بتركيز 50 mM. مرشح معقم ، قسمة في أنابيب 10-50 ميكرولتر ، وتخزينها في -80 درجة مئوية
  2. أخرج IdU من الفريزر ، وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. قم بتخفيف IdU في RPMI-1640 لعمل حل عملي بتركيز نهائي قدره 1 mM. ماصة صعودا وهبوطا أو دوامة لخلط.
    1. عادة ، قم بتخفيف IdU المركز في الوسائط التي يتم فيها زراعة الخلايا (مثل DMEM ، IMDM ، إلخ) أو قم بتخفيفه إلى PBS لإضافته مباشرة إلى الدم المحيطي أو عينات نضح نخاع العظم. تسهل خطوة ما قبل التخفيف هذه خلط DMSO مع الوسائط المائية للخلايا المعنية.
      ملاحظة: يجب أن يكون التركيز النهائي ل IdU أثناء الحضانة 10 ميكرومتر ؛ يمكن إضافة محلول مقداره 1 mM بنسبة 10 μL لكل 1 مل من الوسائط.

2. حضانة IdU وحفظ العينات

  1. احتفظ بالعينات في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. أخرج العينة من الحاضنة وانقل العينة إلى غطاء للسلامة البيولوجية.
  2. أضف 10 ميكرولتر من 1 mM IdU إلى كل 1 مل من العينة.
    1. بالنسبة للوحة 6 آبار ، أضف 30 ميكرولتر من 1 mM IdU إلى 3 مل من وسائط الاستزراع في كل بئر. يمكن أيضا استخدام IdU مباشرة في شفاطات نخاع العظم وكذلك دراسات الفئران4.
  3. ضع العينة مرة أخرى في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. الحفاظ على الخلايا في ظل ظروف النمو المثلى ذات الأهمية أثناء التعرض ل IdU من أجل الحصول على القياس الأكثر دقة للمرحلة S.
  4. بعد حضانة IdU ، قم بإزالة العينة ونقلها إلى أنبوب مخروطي.
  5. أدر العينة على حرارة 400 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. نضح الطاف وإعادة تعليقه في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    1. إذا لزم الأمر ، قم بإجراء بقعة حية / ميتة (باستخدام سيسبلاتين) في هذه الخطوة لتمييز الخلايا الميتة قبل التثبيت والتجميد.
      ملاحظة: لا يعمل تلطيخ الروديوم الحي / الميت بشكل جيد بعد نفاذية الميثانول ، لذلك لا يوصى باستخدامه في تحليلات دورة الخلية.
  7. أضف 18.75 ميكرولتر من 16٪ بارافورمالدهايد (PFA) إلى PBS للحصول على تركيز نهائي قدره 1.5٪ PFA. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أدر العينة لأسفل عند 400 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بنضح محلول PBS / PFA وأعد تعليق العينة في 500 ميكرولتر من وسائط تلطيخ الخلايا (CSM ؛ 1x PBS مع 0.5٪ BSA و 0.02٪ أزيد الصوديوم) + 10٪ DMSO قبل التجميد.
    1. في حالة استخدام مثبت بروتيني تجاري ، أضف 280 ميكرولتر من المثبت البروتيني إلى العينة المعاد تعليقها في 200 ميكرولتر من PBS (1: 1.4). احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ثم ضعها مباشرة في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: ثبت أن IdU يندمج بشكل فعال في غضون 10-15 دقيقة حضانة عند 37 درجة مئوية. ستقلل حضانات IdU التي تزيد مدتها عن 10-15 دقيقة تدريجيا من دقة مجموعات المرحلة S و G2 ، حيث تغادر الخلايا التي تحمل علامة IdU المرحلة S وتتقدم إلى المرحلة G2 أو M. لقد لاحظنا أيضا أن الحضانة طويلة الأمد مع IdU يمكن أن تسبب موت الخلايا والتحف دورة الخلية. المعالجة اللاحقة للخلايا وتلطيخ الأجسام المضادة بعد دمج IdU كافية لغسل IdU المتبقي الذي لم يتم دمجه في خلايا الطور S. لم نلاحظ خلفية كبيرة من اليود عند استخدام البروتوكول في المختبر الموصوف هنا; ومع ذلك ، نادرا ما لاحظنا تلوث اليود في العينات السريرية. قد يحدث هذا من الإجراءات الطبية ، مثل تباين اليود في التصوير المقطعي المحوسب ، أو من الأدوية المحتوية على اليود. في حالة ملاحظة كميات كبيرة من خلفية IdU ، يجب عدم تشغيل العينة لتجنب تلف كاشف مقياس الكتلة الخلوية.

3. عينات تلطيخ لقياس الخلايا الجماعية

  1. قم بإزالة العينات من -80 درجة مئوية واتركها تذوب قبل تلطيخ السطح.
    1. في حالة استخدام طريقة التثبيت SmartTube ، قم بإذابة العينات عند 0-4 درجة مئوية لتجنب التثبيت الإضافي أثناء تسخين العينات.
  2. بعد إذابة العينات ، انقل ما يقرب من 1-2 مليون خلية إلى أنبوب FACS سعة 5 مل.
  3. قم بطرد أنبوب FACS عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ، واملأ أنبوب FACS بوسائط تلطيخ الخلايا (CSM) لغسل الخلايا. كرر مرة واحدة إضافية.
    1. إذا كان من المعروف أن الخلايا تلتصق ببعضها البعض ، أضف 400 وحدة / مل من الهيبارين إلى غسول CSM لمنع ملامسة الخلية للخلايا ولكن هذا ليس ضروريا تماما.
  4. احتضان الخلايا بعامل مانع FC ، 5 ميكرولتر من العامل لكل 100 ميكرولتر من الخلايا ، لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. تحضير خليط من الأجسام المضادة التي من شأنها تلطيخ سطح ، أو جزء خارج الخلية ، من الخلايا. سيصل إجمالي خليط التلوين إلى 100 ميكرولتر لكل 1-2 مليون خلية في كل اختبار. سيتم موازنة خليط التلوين وفقا لذلك مع CSM والهيبارين في أنبوب الكوكتيل و FACS.
    ملاحظة: ستؤدي إضافة CSM في هذه الخطوة أيضا إلى تقليل القطع الأثرية غير المحددة8. يعتمد خليط التلوين هذا كليا على الأهداف ذات الأهمية والنمط الظاهري السطحي (على سبيل المثال ، ستستخدم دراسة تتضمن الخلايا التائية خليطا سطحيا من CD45 و CD3 و CD4 و CD8 وما إلى ذلك). يمكن العثور على بروتوكول مفصل لمعالجة العينات وتلطيخها في Behbehani and McCarthy et al.9,10.
  6. أضف خليط تلطيخ السطح إلى الخلايا واحتضانه في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز المستمر لمدة 30-60 دقيقة.
  7. بعد التلوين ، املأ أنبوب FACS ب CSM ، وقم بتدويره لأسفل عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
  8. اغسل مرتين أخريين باستخدام CSM ، وقم بتدوير العينة عند 600 × جم لمدة 5 دقائق وشفط كل غسلة CSM.
  9. إصلاح الأجسام المضادة خارج الخلية عن طريق إضافة 1 مل من PBS مع 10٪ CSM و 1.5٪ PFA.
  10. املأ أنبوب FACS الذي يحتوي على خليط PBS / CSM / PFA ب CSM. قم بالدوران لأسفل عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ونضح المادة الطافية.
  11. أضف الميثانول عند -20 درجة مئوية.
  12. دوامة العينة لمدة 1-2 دقيقة لتحقيق تعليق خلية واحدة والتحقق من إعادة تعليق جميع كتل الخلايا.
  13. بينما تدور العينة ببطء ، أضف بسرعة 1 مل من الميثانول المثلج باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع طرف مرشح.
  14. امسك أنبوب FACs حتى الضوء وتأكد من عدم وجود كتل مرئية ؛ الغيوم أمر متوقع. أي كتل ستجعل العينة غير قابلة للاستخدام لتحليل MCM اللاحق.
  15. قم بتخزين العينة في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة.
  16. تحضير خليط تلطيخ داخل الخلايا خلال هذا الوقت. يعتمد خليط التلوين داخل الخلايا على الأهداف ذات الاهتمام. لتحليل دورة الخلية ، قم بتضمين CyclinB1 و pRb و Ki67 و pHH3 في خليط التلوين هذا ، ولكن يمكن إضافة علامات أخرى داخل الخلايا حسب الحاجة.
  17. بعد 10-20 دقيقة عند -20 درجة مئوية ، قم بإزالة العينة وإضافة 1.5 مل من PBS واملأ الباقي ب CSM.
  18. أجهزة الطرد المركزي العينة 600 × ز لمدة 5 دقائق ، ونضح طاف الطاف.
  19. اغسل مرتين أخريين باستخدام CSM ، وقم بتدوير العينة لأسفل عند 600 × جم لمدة 5 دقائق وشفط المادة الطافية في كل مرة.
  20. بعد غسل CSM الأخير ، قم بطرد العينة واترك حجما متبقيا يبلغ حوالي 50 ميكرولتر.
  21. أضف خليط الأجسام المضادة المحضر (عادة ما تضيف 50 ميكرولتر من كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة لتحقيق حجم تلطيخ نهائي يبلغ 100 ميكرولتر) إلى العينة واحتضانها على منصة اهتزاز لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  22. بعد تلطيخ إضافة CSM وأجهزة الطرد المركزي في 600 × غرام لمدة 5 دقائق.
  23. نضح CSM ، واغسله مرة أخرى باستخدام CSM ، ويدور عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشق CSM ، ثم أضف برنامج تلفزيوني.
  24. بعد الانتهاء من التلوين داخل الخلايا ، ضع الخلايا في محلول مقحم يثبت الأجسام المضادة للخلايا ويلطخ الحمض النووي لكل خلية لتمكين التعرف عليها. يحتوي محلول الإقحام على مقحم إيريديوم نقي غير نظائري (خماسي ميثيل سيكلوبنتادينيل-Ir(III)-ديبيريدوفينازين) مضاف من محلول مخزون الشركة المصنعة بتركيز 500 ميكرومتر. تمييع مخزون إيريديوم 1: 4000 في محلول PBS و 1.5٪ PFA. أضف محلول إقحام الإيريديوم بمعدل 100-200 ميكرولتر لكل مليون خلية من أجل تلطيخها بالتساوي ومنع الإفراط في تلطيخها.
    ملاحظة: يهدف الإيريديوم في محلول الإقحام هذا إلى تحديد الخلايا للبوابات المفردة ، ولا ينبغي استخدامه للبقع الحية / الميتة. إذا كانت البقع الحية / الميتة مرغوبة ، فيجب إجراؤها قبل التثبيت كما هو مذكور أعلاه وفي McCarthy et al.9.
  25. قم بتخزين العينات في محلول الإقفال في ثلاجة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين قبل الحصول على العينة على CyTOF.

4. عملية مقياس الخلايا الشامل

ملاحظة: يمكن أن تكون عملية قياس الخلايا الجماعية خاصة بالماكينة. ينصح دائما بالتحقق من دليل مستخدم CyTOF قبل التشغيل. بالإضافة إلى ذلك ، يوجد حاليا مقالتان من JoVE تتناولان بدء تشغيل الماكينة وصيانتها 9,11.

  1. افحص البخاخات بحثا عن أي قباقيب أو تشققات أو مخالفات أخرى قبل تشغيل مقياس الكتلة الخلوية.
  2. قم بتوصيل البخاخات بمقياس الخلايا وابدأ إجراء الإحماء. لا تقم بتشغيل مقياس الكتلة الخلوي بدون وجود البخاخات في مكانها.
  3. مرر الماء عبر خطوط العينة بمجرد انتهاء مقياس الكتلة الخلوي من الاحماء. يجب أن تصل غرفة الرش إلى حوالي 200 درجة مئوية قبل إجراء الضبط أو تحليل العينة.
  4. تشغيل المياه لمدة 5-10 دقائق. بعد 5-10 دقائق ، قم بتحميل حل الضبط وحدد مدير الضبط. محلول الضبط هو محلول يحتوي على تركيزات ثابتة من المعادن ويستخدم لتحسين مقياس الكتلة الخلوي قبل الحصول على العينة
  5. في مدير الضبط ، حدد معاينة بمجرد وصول حل الضبط إلى سجل ضرب في حالة ثابتة لبدء عملية الضبط التلقائي.
  6. بمجرد الانتهاء من الضبط ، قم بتحميل جهاز أخذ العينات بالماء والسماح للماء بالمرور عبر خطوط العينة أثناء معالجة العينة. يمكن العثور على بروتوكول مفصل لتشغيل مقياس الخلايا اليومي وضبطه في Leipold11.
  7. في بعض الأحيان ، لن يتم ضبط الضبط الآلي على الأداء الأمثل للماكينة. كرر إجراء الضبط لتصحيح هذا.
  8. اغسل العينة باستخدام CSM مرة واحدة وبالماء النقي منزوع الأيونات مرتين قبل الحصول على العينة. الغسيل بالماء مهم لإزالة الملح المتبقي من PBS / CSM.
  9. تحقق من الحساسية وتدفق العينات باستخدام حبات التوازن التي توفرها الشركة المصنعة ، حبات البوليسترين المحملة بتركيزات معدنية معروفة.
  10. قم بتغيير وضع الاستحواذ من الضبط إلى وضع التقاط الأحداث. اضبط الحد الزمني لإيقاف الاستحواذ على 120 ثانية. انتظر 45 ثانية قبل تحديد تسجيل.
  11. سيوقف مقياس الكتلة الخلوي الحصول على العينات تلقائيا بعد 120 ثانية. استخدم عارض مخطط المطر للتحقق من شدة Eu151 و Eu153.
  12. خرز التوازن المخفف في الماء النقي منزوع الأيونات بنسبة 1:20.
  13. قبل الحصول على عينة تحقق من مدير التجربة. استخدم مدير التجربة لتعيين أسماء للقنوات وإضافة قنوات لتسجيلها.
    1. تأكد من إضافة قناة 127-I في حالة استخدام IdU.
    2. لاحظ أنه من الضروري ضبط مقياس الكتلة الخلوية لقياس المعلمات المطلوبة (على سبيل المثال ، IdU) قبل الحصول على العينة. إذا لم يتم تحديد القنوات مسبقا ، فلن يتم جمع البيانات من أي قناة غير محددة ولا يمكن استردادها.
  14. قم بتخفيف الخلايا إلى تركيز حوالي 1-2 × 106 / مل باستخدام الماء النقي منزوع الأيونات 1:20 وخليط حبة التوازن. مرر الخلايا عبر أنبوب FACS المغطى بالمرشح لإزالة أي كتل متبقية.
  15. قم بتحميل العينة وتغيير وقت الاستحواذ.
  16. اضغط على معاينة وانتظر حتى يستقر عدد الأحداث في الثانية.
    1. لا تقم بتشغيل الأحداث التي تزيد عن 400 حدث في الثانية ، فسيؤدي ذلك إلى كميات كبيرة من المضاعفة والحطام. عادة ما نجمع ما لا يقل عن 20000 إلى 50000 حدث خلية ، لكن العدد الأمثل سيعتمد على التصميم التجريبي. عادة ما ينتج عن تلطيخ ما يصل إلى 2 مليون خلية 300000 إلى 400000 حدث خلوي. لاحظ أنه لن تكون جميع الأحداث عبارة عن خلايا (ستكون هناك أحداث حطام وخرز مدرجة في عدد الأحداث).
  17. بمجرد الانتهاء من الحصول على العينة ، قم بتحميل محلول الغسيل ، وابدأ تحريض العينة وقم بتشغيله لمدة 5-10 دقائق. بعد 5-10 دقائق توقف عن تحريض العينة وقم بتشغيل المياه لمدة 10-20 دقيقة. محلول الغسيل هو محلول ضعيف من حمض الهيدروفلوريك مصمم لتجريد المعدن المتبقي من خطوط العينة.
  18. أغلق مقياس الكتلة الخلوي وأزل البخاخات. سيكون البخاخات ساخنا ، توخ الحذر أثناء المناولة.

5. تحليل البيانات

  1. من أجل إزالة الخرز وأيضا لتصحيح انحراف الإشارة أثناء الحصول على العينة ، قم بتطبيع ملفات FCS باستخدام برنامج Fluidigm أو التطبيق الذي طورته Finck12.
  2. قم بتحميل FCS إلى Cytobank أو أي برنامج آخر لتحليل التدفق الخلوي. يمكن استخدام ملفات FCS في أي برنامج متوافق ، لأغراض هذا البروتوكول ، تم إجراء جميع البوابات والمزيد من التحليل في Cytobank13.
  3. قبل أن يتم رسم بوابات دورة الخلية ، استبعد أي ثنائيات أو حطام خلية من تحليل المصب ، يمكن القيام بذلك باستخدام المخطط ثنائي المحور لطول الحدث مقابل 191-Ir (الشكل 1 أ). ستشكل الخلايا مجموعة متميزة ومشرقة من الأشعة تحتالحمراء يمكن استخدامها لاستبعاد الثنائيات والحطام. هذه هي البوابة المفردة. عادة ما تزيل طريقة البوابات هذه حوالي 50-60٪ من أحداث الخلايا المزدوجة ، لذلك قد تكون هناك حاجة إلى استراتيجيات إضافية لإزالة أحداث الخلايا المزدوجة المتبقية.
    1. قم بتغيير مقياس طول الحدث (الحد الأدنى والحد الأقصى) لجعل الخلايا تبدو أكثر بروزا للمساعدة في بوابات المفردة.
    2. قم بإزالة الثنائيات والحطام باستخدام معلمات Gaussian والمتبقية والإزاحة. المتبقي الأعلى مع الإزاحة المنخفضة هو أيضا الحطام والزوجي ، ويمكن للبوابات حول هذه المجموعة أن تزيل الثنائيات والحطام (الشكل 1ب ، ج).
  4. بوابة المرحلة S - المرحلة S هي أسهل بوابة للرسم ولكنها أيضا الأكثر أهمية. ارسم هذه البوابة باستخدام مخطط ثنائي المحور من IdU مقابل pRb أو Ki67 أو cyclinB1. ستشكل خلايا IdU + في المرحلة S مجموعة مميزة عند النظر إلى هذه المخططات ثنائية المحور (الشكل 2 ب).
  5. بوابة المرحلة G0 / G1 ، بوابة المرحلة G2 / M - إنشاء بوابات المرحلة G0 / G1 و G2 / M على قطعة أرض IdU مقابل CyclinB1 واستخدام دمج IdU أمر بالغ الأهمية لإنشاء الحدود بين بوابات المرحلة G0 / G1 و G2 / M. ستكون المرحلة G0 / G1 منخفضة CyclinB1/ IdU- وستكون المرحلة G2 / Mعالية CyclinB1 / IdU-. سيظهر تلطيخ CyclinB1 الجيد تجمعا طبيعيا بين مجموعات G0-G1 و G2-M ؛ ومع ذلك ، سيختلف هذا عبر أنواع العينات والخلايا في ظل الظروف التجريبية. في الظروف التجريبية حيث قد يتأثر توزيع دورة الخلية وهناك فصل أقل بين مرحلة CyclinB1 G0 / G1 ومرحلة G2 / M ، سيسمح استخدام المرحلة S ببوابات متسقة لأنواع معينة من الخلايا في كل تجربة محددة. هذه الطريقة مفصلة أدناه.
    1. ارسم فقط خلايا الطور S على CyclinB1 مقابل IdU للمساعدة في إنشاء الفصل بين المرحلة G0 / G1 والمرحلة G2 / M. ارسم بوابة على عددالسكان المرتفع CyclinB1 واضبطه حتى يصبح أعلى 5٪ تقريبا من سكان المرحلة S داخل البوابة (الشكل 2 ج). يحدد هذا نقطة التوقف بين بوابات الطور G0 / G1 و G2 / M (الشكل 2ه ، و). سيتم تغيير السكان النشطين إلى السكان محل الاهتمام وسيكون الجزء المقيم داخل البوابة السابقة هو سكان المرحلة G2 / M بينما سيكون الباقي هو سكان المرحلة G0 / G1.
  6. بوابة المرحلة G0 - قم بإنشاء المرحلة G0 على مخطط pRb مقابل IdU. سيتم تمثيل المرحلة G0 بعدد منخفض من السكان pRb / IdU. سيكون لسكان ركوب الدراجات النشطين تعبير عال عن دمج pRb و IdU ، ويمكن رسم بوابة المرحلة G0 على هذه الحدود لأنها تعبر عادة عن مجموعتين متميزتين (الشكل 2g ، i).
    1. حدد المرحلة G0 عن طريق جعل سكان المرحلة S الذين تم رسمهم سابقا (الشكل 2 ب) هم السكان النشطون ورسم بوابة تضم أعلى 90-100٪ من السكانالمرتفعين في pRb. هذا هو عدد سكان ركوب الدراجات pRb + (الشكل 2i) ، وعددالسكان المنخفض pRb خارج هذه البوابة هو عدد السكان G0 (الشكل 2j).
    2. إذا كان pRb غير متوفر أو لا يمكن تسجيله ، فاستخدم Ki67 vs IdU لإنشاء مجتمع المرحلة G0. رسم بوابة تمثل غالبية سكان المرحلة S واستخدام تلك البوابة كحدود ل Ki67 مقابل IdU ، سيكون باقي السكان هو المرحلة G0 (الشكل 3 أ).
  7. بوابة المرحلة M - إنشاء المرحلة M في مخطط ثنائي المحور IdU مقابل pH3. تمثل المرحلة M جزءا صغيرا جدا من الخلايا وهي مسورة على عددالسكان المرتفع pH3 (الشكل 2 د).
  8. فشل دمج IdU أو لم يكن ممكنا - إذا كان IdU غير متوفر ، فحدد دورة الخلية وليس كسور التدوير باستخدام Ki67 و pRb. Ki67 و pRb ، في الظروف العادية ، يشكلان مجموعتين متميزتين Ki67 عالية / pRbعالية و Ki67 منخفضة / pRb منخفضة. يمثل السكان الإيجابيون المزدوجون السكان النشطين لركوب الدراجات ، ويرتبطون بالمرحلة G1 والمرحلة S والمرحلة G2 والمرحلة M. يمثل السكان المنخفضون المزدوجون السكان غير الدراجين ، ويرتبط بالمرحلة G0 (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: لا يمكن تحديد كل مرحلة على حدة باستخدام Ki67 مقابل pRb ولكن يمكن تحديد التأثيرات التجريبية على مجموعات الدراجات / عدم ركوب الدراجات النسبية.
  9. تحليل دورة الخلية - بمجرد إنشاء البوابات ، قم بتصدير القيم العددية من البوابات لمزيد من التحليل. يمكن تحقيق النسب المئوية في كل دورة عن طريق طرح المجموعات السكانية الفردية من المجموعات السكانية المجمعة. يمكن طرح المرحلة G0 ، المرسومة علىانخفاض IdU المنخفضpRb ،من المرحلة G0 / G1 ، المرسومة على CyclinB1IdU negالمنخفضة ، لإيجاد النسبة المئوية للمرحلة G1. وبالمثل ، فإن النسبة المئوية للمرحلة G2 مشتقة من طرح بوابة الطور M من بوابة الطور G2 / M. سيؤدي ذلك إلى إنشاء قيم عددية لكل مرحلة من مراحل دورة الخلية الفردية ؛ G0 و G1 و S و G2 و M. يمكن استخدام القيم العددية التي تم إنشاؤها لكل مرحلة من مراحل دورة الخلية الفردية لمزيد من التحليل مثل الرسوم البيانية والتحليل الإحصائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام خلايا HL-60 ونضح نخاع العظم البشري ، من الممكن إظهار كيف يمكن أن تؤثر الظروف التجريبية على توزيع دورة الخلية وتحليلها. أولا ، يجب إنشاء استراتيجية البوابة لتوضيح كيفية اشتقاق مراحل دورة الخلية. في الشكل 1 ، نعرض إنشاء البوابة المفردة ، وهو أمر مهم في فصل الحطام الخلوي والثنائيات ، وإنشاء مجموعة خلية واحدة. بالنسبة لخطوط الخلايا ، فإن البوابة المفردة هي كل ما هو مطلوب للانتقال إلى تحليل دورة الخلية (الشكل 2 أ). بالنسبة للعينات البشرية ، يجب عادة تحديد مج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توضح الأمثلة المقدمة هنا كيفية استخدام منصة MCM لتحليل توزيع دورة الخلية. وقد ثبت أيضا أن تحليل دورة الخلية حساس للظروف التجريبية مثل الوقت ودرجة الحرارة ، وهو اعتبار مهم يجب على الباحثين اتخاذه عند التفكير في MCM لتحليل دورة الخلية14. العينات التي تترك في التخزين لفترة قصيرة من الزمن ، لا تزيد عن ساعة ، سيكون لها دمج IdU مماثل لحالتها الطبيعية. العينات في نظام مغلق لفترات طويلة من الزمن ، حوالي 2 ساعة ، ستقلل من دمج IdU ، ومع ذلك ، فإن الكسور النسبية للدورة وغير الدورية لن تتغير مما يسمح بتحليل د...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يتلقى الدكتور بهبهاني دعم السفر من Fluidigm. كما اشترت Fluidigm كواشف ومواد للاستخدام في المختبر.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا جهود بالاك صخري وحسام الخلايلة وهسياوتشي تشانغ وجوستين ليبرغر على دعمهم التجريبي. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج زمالة بيلوتونيا. أي آراء ونتائج واستنتاجات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلف (المؤلفين) ولا تعكس بالضرورة آراء برنامج زمالة بيلوتونيا ".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألبومين مصل الأبقار (BSA)SigmaA3059مكون من
جهاز الطرد المركزيThermo Scientific75-217-420عينة الطرد المركزي
Cleaved-PARP (D214)BD BiosciencesF21-852تحديد الخلايا المبرمجة
Cyclin B1BD BiosciencesGNS-1G2 القرار
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)SigmaD2650Cryopreservative
EQ أربعة عناصر معايرة الخرزFluidigm201078معيار معدني داخلي لأداء CyTOF
أنبوب FACS مع مصفاة شبكيةCorning08-771-23مصفاة خلية لإزالة الكتل / الحطام قبل تشغيل CyTOF
مصل الأبقار الجنينية (FBS)VWR97068-085مكمل نمو ثقافة الخلايا
HeliosFluidigmنظام / منصة
CyTOF هيبارينسيجماH3393مادة مضافة للتلطيخ لمنع تلطيخ غير محدد
IdU (5-Iodo-2 & prime ؛ -deoxyuridine)SigmaI7125يشتمل في المرحلة S
Ki-67eBiosciencesSolA15تأكيد G0 / G1
MaxPar Multi Label KitFluidigm201300، يعلق المعادن إلى الأجسام المضادة
Microplate ShakerThermoScientific 88880023خلط العينات أثناء تلطيخ
بارافورمالدهيد (PFA)خدمات المجهر الإلكتروني15710المثبت
خماسي ميثيل سيكلوبنتادينيل-IR (III) -ديبيريدوفينازينFluidigm201192تحديد الخلية أثناء اكتساب CyTOF
p-H2AX (S139)MilliporeJBW301الكشف عن تلف الحمض النووي
p-HH3 (S28)BiolegendHTA28ذو الطور
M (PBS)Gibco14190-144محلول غسيل لزراعة الخلايا ومكون المحلول المثبت
p-Rb (S807 / 811)BD BiosciencesJ112906G0 / G1 Resolution
ProteomicStabilizer SmartTube IncPROT1عينة مثبت
RPMI 1640Gibco21870-076وسط نمو زراعة
الخلايا أزيد الصوديومأكروس العضويةمكون AC447810250من CSM / الأجسام المضادة العازلة ، المبيد الحيوي
CSM محلول ملحي مخزن بالفوسفات

المراجع

  1. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  2. Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
  3. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  4. Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).
  5. Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
  6. Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).
  7. Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
  8. Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
  9. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).
  10. Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).
  12. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  13. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).
  14. Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
  15. Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
  16. Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).
  17. Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

IdU B1 Rb H3
استخدام بيريميدين التناظري ، 5-iodo-2′-deoxyuridine (IdU) مع علامات دورة الخلية لإنشاء مراحل دورة الخلية في منصة قياس الخلايا الجماعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.