يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنتاج جسيمات الإنفلونزا المعدية العالية التهابات بالمغلفات بالبروتينات السكرية المسببة للامراض الشديدة H5N1 وفيروسات الطيور H7N9

8.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60663

⸱

يناير 15, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory, Hang Zhou Red Cross Hospital, 2Clinical Laboratory, Yuhang District Maternity and Child Health Care Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول عمليه تجريبية لإنتاج الجسيمات الفيروسية المعدية عاليه التهاب (pp) مع البروتينات السكرية المغلفة من اثنين من سلالات الإنفلونزا A وكيفيه تحديد عدويها. هذا البروتوكول هو قابل للتكيف للغاية لتطوير pps من اي نوع آخر من الفيروسات يلفها مع البروتينات السكرية مغلف مختلفه.

الملخص

ومن المسائل الخطيرة المتعلقة بالصحة العامة الانتقال المباشر العرضي لإنفلونزا الطيور A المسببة للامراض الشديدة من فيروس H5N1 (HPAI H5N1) و H7N9 إلى البشر والفتك بها ، وتشير إلى احتمال حدوث وباء. ومع ذلك ، فان فهمنا الجزيئي للفيروس بدائي ، ومن الضروري دراسة الخواص البيولوجية للبروتينات المغلفة كاهداف علاجيه ووضع استراتيجيات للسيطرة علي العدوى. طورنا منصة الجسيمات الفيروسية الصلبة (pp) لدراسة فيروس إنفلونزا الطيور ، بما في ذلك التحليل الوظيفي للبروتينات السكرية المغلفة هيماغلوتينين (HA) والعصبية (NA) ، وخصائص أعاده التشكيل لل والناس ، مستقبلات, الانقسامات, تحييد الأجسام المضادة, التشخيص, عدوي, لأغراض تطوير المخدرات وتصميم اللقاح. هنا ، ونحن وصف اجراء تجريبي لإنشاء pps مع البروتينات السكرية المغلف (HA ، NA) من اثنين من سلالات الإنفلونزا A (HAPI H5N1 و 2013 الطيور H7N9). ويستند جيلهم علي قدره بعض الفيروسات ، مثل فيروس سرطان الدم murine (MLV) ، لدمج البروتينات السكرية المغلف في pp. الاضافه إلى ذلك ، ونحن أيضا بالتفصيل كيف يتم قياس هذه pps مع RT-qPCR ، والكشف عن عدوي الفيروس الأصلي وغير متطابقة pps اعتمادا علي أصل وقد و NAs. هذا النظام هو مرنه للغاية وقابله للتكيف ويمكن استخدامها لإنشاء pps الفيروسية مع البروتينات السكرية المغلف التي يمكن ادراجها في اي نوع آخر من الفيروسات يلفها. وهكذا ، يمكن استخدام هذه المنصة الجسيمات الفيروسية لدراسة الفيروسات البرية في العديد من التحقيقات البحثية.

المقدمة

وتتمثل مهمة الجسيمات الفيروسية في نقل المجين البشري من خليه مضيفه مصابه إلى خليه مضيفه غير مصابه وتسليمه إلى الخلايا الخلوية أو النواة في شكل النسخ المتماثل المختص1. يتم تشغيل هذه العملية في البداية عن طريق ربط مستقبلات الخلايا المضيفة ، تليها الانصهار من الاغشيه الخلوية والخلايا. للفيروسات المغلفة ، مثل فيروسات الإنفلونزا ، البروتينات السكرية الحاده هي المسؤولة عن مستقبلات ملزمه والانصهار1،2. الفيروسية المغلف البروتينات السكرية (علي سبيل المثال ، الحمم البركانية ، المستضدات) ، وتشارك في العديد من الخصائص والاحداث الهامه ، مثل بدء دوره حياه الفيروسات (ملزمه والانصهار) ، والمرض الفيروسي ، والاستمناع ،والخلية المضيفة المبرمج والتروسيه الخلوية ، ومسار البحوث علي البروتينات السكرية المغلف الفيروسية سوف تساعدنا علي فهم العديد من جوانب عمليه العدوى الفيروسية. الجسيمات الفيروسية الكاذبة (pp) ، وتسمي أيضا سودوفيريونز أو الكاذبة ، يمكن ان تتولد من خلال تقنيه التنميط الكاذب8،9،10. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لتطوير الجزيئات الكاذبة من العديد من الفيروسات, بما في ذلك التهاب الكبد C11,12, التهاب الكبد ب13, فيروس التهاب الفم الحويصلي (vsv)14,15, وفيروس الإنفلونزا16,17,18,19. وتستند هذه التكنولوجيا علي البروتين هفوة بول من لينتيفيروسيس أو غيرها من الفيروسات الرجعية.

يمكن الحصول علي الجزيئات الفيروسية الكاذبة باستخدام نظام البلازما الثلاثة عن طريق التحويل الفيروسي لغلاف البروتين السكري البلازميد ، والعبوات المضادة للفيروسات الارتجاعية في عداد المفقودين الجينات المغلف البيئية ، ومراسل منفصل البلازميد في الخلايا المنتجة pp. يتم تجميع الفيروس الرجعي من قبل بروتين الكمامة ، وانها براعم من غشاء الخلية المصابة التي تعبر عن بروتين مغلف الفيروس1. ولذلك ، فمن الممكن الحصول علي الإنفلونزا العالية عيار pps باستخدام الفيروس الرجعي الكمامة البروتين لإنتاج براعم علي الغشاء الخلوي التعبير عن الإنفلونزا HA و NA. في دراساتنا السابقة ، وقد/NAs في جميع تركيبات وظيفية وقادره علي أداء وظائفها المقابلة في دوره الحياة الفيروسية16،17،18،20،21. وتستخدم هذه الورقة للتحقيق في الخصائص البيولوجية الإنفلونزا, بما في ذلك التراص, النشاط نيوامينيداز, [ها-مستقبلات ملزمه التروسم, و عدوي. لان HA و NA علي حد سواء البروتينات الوظيفية السطحية الهامه في دوره الحياة الفيروسية ، وقد غير متطابقة و NAs المستمدة من سلالات مختلفه من الإنفلونزا يمكن ان تظهر جزئيا أعاده تشكيل بينهما. هنا ، ونحن توليد ثمانيه أنواع من الإنفلونزا pps من خلال الجمع بين اثنين واثنين من الناس (المستمدة من سلاله اتش بي جي 5 ووصمه العار H7N9) ، وذلك باستخدام نظام التنميط الكاذب ثلاثه plasmid. وتشمل هذه الأنواع الثمانية من pps اثنين الأصلي pps, H5N1pp, H7N9pp; اثنين غير متطابقة pps ، (H5 + N9) pp ، (H7 + N1) pp ؛ وأربعه pps فقط إيواء بروتين سكري واحد (HA أو NA) ، H5pp ، N1pp ، H7pp ، N9pp. والدراسات المتعلقة بفيروس الإنفلونزا ، مثل H5N1 و H7N9 ، محدوده بمتطلبات السلامة الاحيائيه. وينبغي اجراء جميع الدراسات المتعلقة بسلالات فيروس الإنفلونزا البرية في مختبر من مستوي السلامة البيولوجية 3 (BSL-3). ويمكن استخدام تكنولوجيا الجسيمات الفيروسية الزائفة لحزم الفيريون الاصطناعية في الاعداد 2 (BSL-2) مستوي السلامة الاحيائيه. ولذلك ، يمثل pps أداه أكثر أمانا وفائدة لدراسة عمليات فيروس الإنفلونزا اعتمادا علي اثنين من البروتينات السكرية الرئيسية: هيماغلوتينين (HA) و نيوامينيداز (NA).

يصف هذا البروتوكول الجيل من هذه pps مع استراتيجية ثلاثه plasmid المختلط (عرضت في الشكل 1) ، وكيفيه قياس pps ، والكشف عن عدوي. وينطوي إنتاج البولي بروبيلين علي ثلاثه أنواع من البلازميدات (الشكل 1). وقد استنسخت الجينات هفوة-pol ، والتي ترميز الفيروس الرجعية هفوة-بول البروتين ، من مجموعه التعبئة والتغليف الرجعية وادراجها في pcdna 3.1 بلازميد واسمه Pcdna-هفوة-pol. تم استنساخ الجين المعزز للبروتين الفلوري الأخضر (eGFP) ، الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر ، من ناقلات pTRE-EGFP ، والذي تم ادراجه في pcDNA 3.1 plasmid ، ودعا pcDNA-GFP. اثناء الاستنساخ ، تم أضافه تسلسل اشاره التعبئة والتغليف (ψ) عن طريق التمهيدي. تم استنساخ الجينات HA و NA في plasmid pVRC ، المسمي pVRC-HA و pVRC-NA ، علي التوالي. البلازما الاخيره بترميز البروتين الانصهار ويمكن استبدالها مع اي بروتين الانصهار الأخرى من الفائدة. لدينا منصة التنميط الكاذب ويشمل اثنين من التعبير البلازميدات بروتين سكري: pVRC-HA و pVRC-NA. وهذا يمكن تبسيط البحث علي أعاده تشكيل بين سلالات الفيروسات المختلفة في اعداد BSL-2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. اليوم الأول: ثقافة الخلية والبذر

  1. زراعه الكلي الجنينية البشرية (يشيك) 293T/17 الخلايا في اطباق 60 مم مع المتوسطة الاساسيه المعدلة دولبيكو (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (الدم) و 100 U/mL البنسلين-ستربتوميسين (DMEMالمتوسطة كامله ، DCM) في 37 درجه مئوية ، و 80 5
    ملاحظه: يتم المستحسن 293T/17 خلايا المرور منخفضه.
  2. غسل بعناية الخلايا مع 5 مل من الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) 1x.
    ملاحظه: يجب ان يكون التعامل اليدوي من الخلايا 293T/17 يشيك لطيف جدا ، لأنها فصل بسهوله.
  3. أزاله تلفزيوني وانفصال الخلايا مع 1 مل من 0.25 ٪ التريبسين-الاثيلين دياميني حمض تتراكسي (أدتا) الحل. وضع الطبق في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه لمده لا تزيد عن 5 دقائق حتى يتم فصل الخلايا.
  4. تعطيل التريبسين عن طريق أضافه 5 مل من DCM. تفريق الخلايا في تعليق خليه واحده عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا عده مرات.
  5. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل المبردة مسبقا. جمع الخلايا عن طريق طرد في 250 x g ل 5 دقيقه في 4 °c.
  6. الكثير من الخارقين قدر المستطاع أعاده تعليق بيليه الخلية مع 6 مل من المتوسطة DCM وحساب الخلايا. تمييع الخلايا إلى 1 × 106 خلايا/مل مع المتوسطة DCM.
  7. بذور الخلايا في 6 لوحه جيدا مع 1 مل من تعليق الخلية في بئر. ربت الصفيحة برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان لوحه بين عشيه وضحيها (14-16 ح) في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.

2. اليوم الثاني: أربعه-بلازميد كوترانسكشن بوساطة ليبوفيكشن

  1. تحقق من مورفولوجية الخلية وكثافتها تحت مجهر الضوء المقلوب. ومن الناحية المثالية ، ينبغي ان تكون الخلايا حوالي 85 ٪ متموج في التحويل. استبدل المتوسط ب1 مل من المصل الخالي من DMEM المتوسط لكل بئر ، ثم أعد الصفيحة إلى الحاضنة.
    ملاحظه: يجب ان يكون التعامل اليدوي من الخلايا 293T/17 يشيك لطيف جدا ، لأنها فصل بسهوله.
  2. لكل بئر من الخلايا المستزرعة ليتم نقلها ، تمييع 8 μL من الكاشف ترانسكشن إلى حجم 150 μL مع المصل المخفض المتوسطة (أنبوب 1). اخلطه برفق وحضنه لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT ، حوالي 20 درجه مئوية).
    ملاحظه: بالنسبة لكل عينه ترانسكشن ، واعداد اثنين من 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير ، مرقمه 1 و 2.
  3. في أنبوب 2 ، تمييع 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 150 μl من المصل المخفض المتوسطة.
    ملاحظه: في أنبوب 2 ، تمييع كل الحمض النووي البلازميد كما هو مبين في الجدول 1. واستخدم فيروس التهاب الفم البطيني الترميز البلازما (vsv) G بروتين سكري (البلازميد حزب التقدمي-vsv) كعنصر تحكم إيجابي ، لان vsv قادره علي أصابه مجموعه واسعه من الخلايا. جزيئات التحكم السلبية التي تفتقر إلى الإنفلونزا مغلف البروتينات السكرية (Δenv pps) تم إنشاؤها باستخدام pcDNA-هفوة-Pol و pcDNA-GFP البلازميدات.
  4. بعد الحضانة 5 دقائق ، والجمع بين الحمض النووي المخفف مع كاشف ترانسفيكشن المخفف. اخلطي برفق وحضني لمده 15 دقيقه أخرى في RT.
  5. أضافه الحمض النووي-الدهون المعقدة إلى جيدا المقابلة التي تحتوي علي الخلايا والمصل خاليه المتوسطة. امزجيه برفق بواسطة هزاز الطبق ذهابا وإيابا.
  6. بعد الحضانة ل 4-6 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه ، وأزاله المتوسطة ، واستبدال مع 2 مل من dmem. احتضان لأخر 36-48 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.
    ملاحظه: استبدل بالمصل خاليه من الأجسام المضادة و DMEM الخالية من الأضداد. في هذا البروتوكول ، يمكن استخدام اثنين واثنين من NAs لتوليد ثمانيه أنواع من pps (كما هو موضح في الجدول 1).

3-اليوم الثالث: بذر الخلايا المعرضة للاصابه

  1. لعدوي الفحص ، البذور كل نوع من الخلايا الحساسة في 1 × 104 خلايا لكل بئر في لوحه 96 جيدا.
    ملاحظه: استخدام نوعين من الخلية الهدف لتنفيذ الفحص عدوي في هذه المقالة: خط الخلايا البشرية المشتقة من السنخيه (خلايا A549) وخلايا الكلي البوليسية مادين-داربي (MDCK). وتستخدم خلايا MDCK علي نطاق واسع في أبحاث الإنفلونزا ويمكن ان تكون جيده السيطرة. هذه الخطوة مرنه. ويمكن استخدام اي خطوط أخرى للخلايا المستهدفة وفقا لمتطلبات البحث.
  2. احتضان لوحه بين عشيه وضحيها (14-16 ح) في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.

4-اليوم الرابع: جمع الجسيمات الفيروسية الكاذبة ، والقياس الكمي ، وفحص عدوي

  1. جمع الجسيمات الفيروسية الكاذبة
    1. تحقق من لون الوسط. من الناحية المثالية ، يجب ان يكون وردي فاتح أو برتقالي قليلا. فحص الخلايا مع المجهر البيولوجي الفلوري المقلوب تحت 440-460 نانومتر.
    2. في 36-48 ح بوستترانسكشن ، حصاد pps عن طريق المرور من خلال 0.45 ميكرومتر متعدد الفينيليدين فلوريد (pvdf) فلتر غشاء للقضاء علي الحطام الخلية.
    3. قسم الورقة إلى المستويات الصغيرة.
    4. تخزين pps في-80 درجه مئوية.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. ومع ذلك ، لا يتم تشجيع هذا ، لان عدوي من pps سوف تنخفض بشكل حاد بعد التجمد والذوبان.
  2. القياس الكمي للجسيمات الفيروسية الكاذبة
    1. نقل 20 μL من الإرسال والإرسال المنقي إلى 1.5 mL ريبونكليوداز (RNase)-أنبوب الطرد المركزي الصغير مجانا.
    2. أضافه 1 μL من 0.24 U/mL النواة البنداز. احتضان في 37 درجه مئوية ل 1 ح للقضاء علي اي الحمض النووي والجيش النيبالي التلوث.
      ملاحظه: الهدف RNA ، الفيروس المضخم للخلايا (CMV)-GFP الحمض الخلوي الريبي ، يتم تعبئتها في pps ويمكن تجنب المتدهورة من قبل النيوداز البنزوداز.
    3. تجميد العينة في-70 درجه مئوية للغاء تنشيط النيوداز البنبيناز.
    4. أضافه 2 μL من بروتيداز k. احتضان في 50 درجه مئوية لمده 30 دقيقه لهضم البروتينات المغلف والإفراج عن الحمض الريبي النيبالي-GFP. انتنشيط K بروتيداز في 100 درجه مئوية لمده 3 دقائق.
    5. القياس الكمي لل pps من قبل النسخ العكسي الكمية في الوقت الحقيقي (qRT)-PCR مع مسبار عالمي من خطوه واحده RT-Qrt كيت ، باستخدام التمهيدي إلى الامام 5 '-AACAAAAGCTGAGCTCGTTكتاتتا-3 ' ، والتمهيدي العكسي 5 '-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3 ' ، والتحقيق 5 '-فأم-CCCCCAAGAGACCCCCكمامه-تام-3 ' ، في الوقت الحقيقي PCR ثيرموسيكلير. تطبيع pps لرقم نسخه RNA قبل عدوي.
  3. فحص عدوي
    1. تمييع كل نوع من pps من حيث البيانات qRT-PCR إلى 4 × 105 نسخ/مل (pp التطبيع).
    2. أضافه توسيل-فينيلالانين كلونوايثيل كيتون (TPCK)-التربسين إلى تركيز نهائي من 40 ميكروغرام/مل في pps ان الميناء H7N9 HA. احتضان في 37 درجه مئوية ل 1 ح لتشكيل الوحدات الفرعية الوظيفية HA1 و HA2.
      ملاحظه: ليست هناك حاجه لعلاج pps ان الميناء H5 مع TPCK-تريبسين ، لان لديهم عده بقايا ارجينين ويسين في موقع الانشقاق HA1-HA2. هذا الموقع الانقسام متعددة الاساسيه يمكن المشقوق من قبل بروتينيه الخلوية في كل مكان.
    3. مزيج تطبيع pps مع DMEM المتوسطة (مصل خاليه) بنسبه 1:1 (حجم/حجم).
    4. احضر الصفيحة التي تحتوي علي خلايا حساسة إلى مجلس السلامة البيولوجية.
    5. يستنشق ماده طافي ويغسل الخلايا مره واحده مع 0.1 مل من الحرارة المسبقة.
    6. أضف 0.1 مل من خليط pps-DMEM إلى بئر واحد. ثلاثه نسخ الاختبارات العدوية لكل نوع من pps إلى خط خليه واحده حساسة (العرض الزائد في الشكل 2).
    7. احتضان لوحه بئر 96 لمده 4-6 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.
    8. يستنشق ماده طافي واستبدال مع 0.1 mL من DCM.
    9. احتضان لوحه بئر 96 لأخر 24-36 ح في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.

5-اليوم الخامس أو السادس: كشف عدوي

  1. احضر لوحه ال96 الجيدة إلى مجلس السلامة البيولوجية.
  2. يستنشق ماده طافي ويغسل الخلايا 1x مع 0.2 مل من الحرارة المسبقة.
  3. أزاله تلفزيوني وانفصال الخلايا مع 0.1 mL من 0.25 ٪ التريبسين--أدتا الحل.
  4. وضع الطبق في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه لمده 3 دقائق حتى يتم فصل الخلايا.
    ملاحظه: تجنب احتضان لأكثر من 5 دقائق ، لان هذا سيؤدي إلى تكتل الخلايا.
  5. تعطيل التريبسين عن طريق أضافه 0.4 mL من DCM.
  6. تفريق الخلايا في تعليق خليه واحده عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا عده مرات.
  7. نقل تعليق الخلية إلى المبردة 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير.
  8. تحديد الخلايا الايجابيه مراسل GFP مع الفلورية الخلية المنشط الفرز (FACS).
    ملاحظه: لتحديد نسبه الخلايا الهدف الايجابيه مراسل GFP ، تعيين بوابات التدفق الخلوي باستخدام عينات التحكم (pps-غير المعالجة A549 الخلايا أو الخلايا MDCK) ، ومن ثم حساب الخلايا الايجابيه مراسل GFP من خلايا 10,000 لكل عينه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

اعتمادا علي الاجراء العام الموصوف أعلاه ، لقد ولدت 10 أنواع من pps الجمع بين اثنين من مجموعه لديها/NAs أو VSV-G بروتين سكري أو البروتينات السكرية لا المغلف (كما هو موضح في الجدول 1). سبعه منهم معدون. و pps ان الميناء لا المغلف بروتين سكري أو الميناء فقط NA لم تظهر اي عدوي هنا. يتم الإفراط في النظر في اجراء إنتاج الإنفلونزا pp في الشكل 1. ويرد في الشكل 3الرسوم البيانية الكترونيه للإرسال من pps (علي سبيل المثال ، H5N1pp). وترد نتائج اختبارات عدوي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه لإنتاج الجسيمات الكاذبة فيروس الإنفلونزا (pp) في اعداد BSL-2. وأدرجت المخبر البلازميد pcdna-gfp في pps ويمكن استخدامها لقياس pps من قبل facs في عدوي مقايسة. اخترنا نوعين من خطوط الخلايا الحساسة لأنها تستخدم علي نطاق واسع في أبحاث الإنفلونزا. ومن شان خلايا MDCK ان توفر سيطرة جيده علي الخلايا البشرية المتغيرة المستخدمة في هذه الدراسات.

ويستند هذا البروتوكول علي الفيروس الرجعي MLV ، والتي يمكن ان تدمج مراسل GFP وإنتاج براعم علي الغشاء الخلوي. وقد تم تطوير هذه ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المقدمة من الطب والعلوم الصحية وخطه التكنولوجيا في مقاطعه تشجيانغ (أرقام المنح ، 2017KY538) ، والطب البلدي في هانغتشو ، وخطه العلوم الصحية والتكنولوجيا (أرقام المنح ، OO20190070) ، والعلوم الطبية في هانغتشو التكنولوجيا الرئيسية المشروع (أرقام المنح ، 2014Z11) والبلدية هانغتشو مشروع التطبيق المستقل للتنمية الاجتماعية والبحث العلمي (أرقام المنح ، 20191203B134).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Benzonase NucleaseMillipore70664تقليل اللزوجة الفعالة وإزالة الأحماض النووية من محاليل البروتين
صفائح دقيقة شفافة مسطحة القاع معالجة بالبوليسترين TC (96 بئر)Corning3599معالج لربط الخلايا الأمثل
معقم بإشعاع جاما ومعتمد غير بيروجيني
رموز أبجدية رقمية فردية لتحديد الجيد
ألواح الآبار المتعددة المعالجة ب TC الشفافة (6 آبار)كوستار3516رموز أبجدية رقمية فردية لتحديد الآبار
معالج لربط الخلايا الأمثل
معقم بإشعاع جاما
وسط أساسي معدل من Dulbecco (DMEM)Gibco11965092وسط قاعدي مستخدم على نطاق واسع لدعم نمو العديد من خلايا الثدييات
المختلفة مصل الأبقار الجنينيExcellFND500الأمصال البقرية الجنينية التي يمكن أن تقدم قيمة ممتازة لزراعة الخلايا الأساسية ، والبحوث المتخصصة ، والمقايسات المحددة
فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS)Beckman coultercytoflex
السرطان الغدي السنخي البشري خلايا A549ATCCCRM-CCL-185
الكلى الجنينية البشرية (HEK) HEK-293T / 17 خليةATCCCRL-11268كاشف تعداء متعدد الاستخدامات ثبت أنه ينقل بشكل فعال أكبر مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا الملتصقة والمعلقة
المجهر البيولوجي الفلوري المقلوبأوليمبوسBX51-32P01-FLB3
مجهر ضوئي مقلوبأوليمبوسCKX31-12PHP
ليبوفاكتامين 2000 كاشف التعداءInvitrogen11668019الكشف السريع والحساس والدقيق عن qPCR القائم على المسبار وتحديد كمية أهداف الحمض النووي الريبي المستهدف.
Luna Universal Probe خطوة واحدة RT-qPCR KitNEBE3006Lسوف يتحمل ما يصل إلى 14,000 RCF
RNase - / DNase خالية
خلايا الكلى Madin-Darby (MDCK)ATCCCCL-34
MaxyClear Snaplock Micro Centrifuge Tube (1.5 مل) AxygenMCT-150-C33 مم ،
وحدة تصفية حقنة Millex-HV المعقمة جاما ، 0.45 & micro ؛ م ، PVDFMilliporeSLHV033RSالحد الأدنى من الوسط الأساسي المحسن (MEM) الذي يسمح بتقليل مكملات مصل الأبقار الجنينية بنسبة 50٪ على الأقل دون أي تغيير في معدل نمو الخلايا أو مورفولوجيا. يوصى أيضا باستخدام وسيط Opti-MEM I مع كواشف تعداء الدهون الموجبة ، مثل كاشف Lipofectamine.
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058021تستخدم المضادات الحيوية البنسلين والستربتومايسين لمنع التلوث البكتيري لمزارع الخلايا بسبب عملهما المشترك الفعال ضد البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام.
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140122الحد الأقصى RCF هو 12,500 xg
نطاق درجة الحرارة من -80 درجة ؛ C إلى 120 درجة ؛ أنابيب الطرد المركزي المعقمة PP
RNase / DNase
br / > (15 مل)Corning430791بروتياز سيرين مستقر وعالي التفاعل
بروتيناز KBeyotimeST532معالج لربط الخلايا الأمثل
معقم بإشعاع جاما
وطبق ثقافة معتمد غير معالج ب TC غير حراري (60 مم)Corning430166التربسين من البنكرياس البقري
TPCK المعالج ، خالي من الملح بشكل أساسي ، مسحوق مجفف بالتجميد ، & ge ؛ 10,000 وحدة BAEE / مجم بروتين
TPCK-trypsinSigmaT1426تحتوي هذه التركيبة السائلة من التربسين على EDTA وأحمر الفينول. يتكون Gibco Trypsin-EDTA من مسحوق التربسين ، وهو خليط مشع من البروتياز المشتق من البنكرياس الخنازير. نظرا لقوته الهضمية ، يستخدم التربسين على نطاق واسع لتفكك الخلايا ، ومرور ثقافة الخلايا الروتينية ، وتفكك الأنسجة الأولية. يختلف تركيز التربسين المطلوب للتفكك باختلاف نوع الخلية والمتطلبات التجريبية.
التربسين EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمرجيبكو25200056
من

المراجع

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501(2008).
  4. Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629(2014).
  5. Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
  6. Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
  7. Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
  8. Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
  9. Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
  10. Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
  11. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  12. Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
  13. Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
  14. Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
  15. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  16. Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
  17. Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).
  18. Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825(2010).
  19. Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
  20. Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
  21. Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
  22. McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
  23. Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
  24. Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70(2006).
  25. Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
  26. Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
  27. Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
  28. Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
  29. Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
  30. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254(2016).
  31. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  32. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  33. Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).
  34. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  35. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  36. Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
  37. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  38. Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).
  39. Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RT qPCR 2 HEK 293T 17
إنتاج جسيمات الإنفلونزا المعدية العالية التهابات بالمغلفات بالبروتينات السكرية المسببة للامراض الشديدة H5N1 وفيروسات الطيور H7N9
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.