يصف هذا البروتوكول عمليه تجريبية لإنتاج الجسيمات الفيروسية المعدية عاليه التهاب (pp) مع البروتينات السكرية المغلفة من اثنين من سلالات الإنفلونزا A وكيفيه تحديد عدويها. هذا البروتوكول هو قابل للتكيف للغاية لتطوير pps من اي نوع آخر من الفيروسات يلفها مع البروتينات السكرية مغلف مختلفه.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنتاج جسيمات الإنفلونزا المعدية العالية التهابات بالمغلفات بالبروتينات السكرية المسببة للامراض الشديدة H5N1 وفيروسات الطيور H7N9
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ومن المسائل الخطيرة المتعلقة بالصحة العامة الانتقال المباشر العرضي لإنفلونزا الطيور A المسببة للامراض الشديدة من فيروس H5N1 (HPAI H5N1) و H7N9 إلى البشر والفتك بها ، وتشير إلى احتمال حدوث وباء. ومع ذلك ، فان فهمنا الجزيئي للفيروس بدائي ، ومن الضروري دراسة الخواص البيولوجية للبروتينات المغلفة كاهداف علاجيه ووضع استراتيجيات للسيطرة علي العدوى. طورنا منصة الجسيمات الفيروسية الصلبة (pp) لدراسة فيروس إنفلونزا الطيور ، بما في ذلك التحليل الوظيفي للبروتينات السكرية المغلفة هيماغلوتينين (HA) والعصبية (NA) ، وخصائص أعاده التشكيل لل والناس ، مستقبلات, الانقسامات, تحييد الأجسام المضادة, التشخيص, عدوي, لأغراض تطوير المخدرات وتصميم اللقاح. هنا ، ونحن وصف اجراء تجريبي لإنشاء pps مع البروتينات السكرية المغلف (HA ، NA) من اثنين من سلالات الإنفلونزا A (HAPI H5N1 و 2013 الطيور H7N9). ويستند جيلهم علي قدره بعض الفيروسات ، مثل فيروس سرطان الدم murine (MLV) ، لدمج البروتينات السكرية المغلف في pp. الاضافه إلى ذلك ، ونحن أيضا بالتفصيل كيف يتم قياس هذه pps مع RT-qPCR ، والكشف عن عدوي الفيروس الأصلي وغير متطابقة pps اعتمادا علي أصل وقد و NAs. هذا النظام هو مرنه للغاية وقابله للتكيف ويمكن استخدامها لإنشاء pps الفيروسية مع البروتينات السكرية المغلف التي يمكن ادراجها في اي نوع آخر من الفيروسات يلفها. وهكذا ، يمكن استخدام هذه المنصة الجسيمات الفيروسية لدراسة الفيروسات البرية في العديد من التحقيقات البحثية.
المقدمة
وتتمثل مهمة الجسيمات الفيروسية في نقل المجين البشري من خليه مضيفه مصابه إلى خليه مضيفه غير مصابه وتسليمه إلى الخلايا الخلوية أو النواة في شكل النسخ المتماثل المختص1. يتم تشغيل هذه العملية في البداية عن طريق ربط مستقبلات الخلايا المضيفة ، تليها الانصهار من الاغشيه الخلوية والخلايا. للفيروسات المغلفة ، مثل فيروسات الإنفلونزا ، البروتينات السكرية الحاده هي المسؤولة عن مستقبلات ملزمه والانصهار1،2. الفيروسية المغلف البروتينات السكرية (علي سبيل المثال ، الحمم البركانية ، المستضدات) ، وتشارك في العديد من الخصائص والاحداث الهامه ، مثل بدء دوره حياه الفيروسات (ملزمه والانصهار) ، والمرض الفيروسي ، والاستمناع ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. اليوم الأول: ثقافة الخلية والبذر
- زراعه الكلي الجنينية البشرية (يشيك) 293T/17 الخلايا في اطباق 60 مم مع المتوسطة الاساسيه المعدلة دولبيكو (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (الدم) و 100 U/mL البنسلين-ستربتوميسين (DMEMالمتوسطة كامله ، DCM) في 37 درجه مئوية ، و 80 5
ملاحظه: يتم المستحسن 293T/17 خلايا المرور منخفضه. - غسل بعناية الخلايا مع 5 مل من الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) 1x.
ملاحظه: يجب ان يكون التعامل اليدوي من الخلايا 293T/17 يشيك لطيف جدا ، لأنها فصل بسهوله. - أزاله تلفزيوني وانفصال الخلايا مع 1 مل من 0.25 ٪ التريبسين-الاثيلين دياميني حمض تتراكسي (أدتا) الحل. وضع الطبق في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
اعتمادا علي الاجراء العام الموصوف أعلاه ، لقد ولدت 10 أنواع من pps الجمع بين اثنين من مجموعه لديها/NAs أو VSV-G بروتين سكري أو البروتينات السكرية لا المغلف (كما هو موضح في الجدول 1). سبعه منهم معدون. و pps ان الميناء لا المغلف بروتين سكري أو الميناء فقط NA لم تظهر اي عدوي هنا. يتم الإفراط في النظر في اجراء إنتاج الإنفلونزا pp في الشكل 1. ويرد في الشكل 3الرسوم البيانية الكترونيه للإرسال من pps (علي سبيل المثال ، H5N1pp). وترد نتائج اختبارات عدوي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه لإنتاج الجسيمات الكاذبة فيروس الإنفلونزا (pp) في اعداد BSL-2. وأدرجت المخبر البلازميد pcdna-gfp في pps ويمكن استخدامها لقياس pps من قبل facs في عدوي مقايسة. اخترنا نوعين من خطوط الخلايا الحساسة لأنها تستخدم علي نطاق واسع في أبحاث الإنفلونزا. ومن شان خلايا MDCK ان توفر سيطرة جيده علي الخلايا البشرية المتغيرة المستخدمة في هذه الدراسات.
ويستند هذا البروتوكول علي الفيروس الرجعي MLV ، والتي يمكن ان تدمج مراسل GFP وإنتاج براعم علي الغشاء الخلوي. وقد تم تطوير هذه ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المقدمة من الطب والعلوم الصحية وخطه التكنولوجيا في مقاطعه تشجيانغ (أرقام المنح ، 2017KY538) ، والطب البلدي في هانغتشو ، وخطه العلوم الصحية والتكنولوجيا (أرقام المنح ، OO20190070) ، والعلوم الطبية في هانغتشو التكنولوجيا الرئيسية المشروع (أرقام المنح ، 2014Z11) والبلدية هانغتشو مشروع التطبيق المستقل للتنمية الاجتماعية والبحث العلمي (أرقام المنح ، 20191203B134).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | تقليل اللزوجة الفعالة وإزالة الأحماض النووية من محاليل البروتين |
| صفائح دقيقة شفافة مسطحة القاع معالجة بالبوليسترين TC (96 بئر) | Corning | 3599 | معالج لربط الخلايا الأمثل معقم بإشعاع جاما ومعتمد غير بيروجيني رموز أبجدية رقمية فردية لتحديد الجيد |
| ألواح الآبار المتعددة المعالجة ب TC الشفافة (6 آبار) | كوستار | 3516 | رموز أبجدية رقمية فردية لتحديد الآبار معالج لربط الخلايا الأمثل معقم بإشعاع جاما |
| وسط أساسي معدل من Dulbecco (DMEM) | Gibco | 11965092 | وسط قاعدي مستخدم على نطاق واسع لدعم نمو العديد من خلايا الثدييات |
| المختلفة مصل الأبقار الجنيني | Excell | FND500 | الأمصال البقرية الجنينية التي يمكن أن تقدم قيمة ممتازة لزراعة الخلايا الأساسية ، والبحوث المتخصصة ، والمقايسات المحددة |
| فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| السرطان الغدي السنخي البشري خلايا A549 | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| الكلى الجنينية البشرية (HEK) HEK-293T / 17 خلية | ATCC | CRL-11268 | كاشف تعداء متعدد الاستخدامات ثبت أنه ينقل بشكل فعال أكبر مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا الملتصقة والمعلقة |
| المجهر البيولوجي الفلوري المقلوب | أوليمبوس | BX51-32P01-FLB3 | |
| مجهر ضوئي مقلوب | أوليمبوس | CKX31-12PHP | |
| ليبوفاكتامين 2000 كاشف التعداء | Invitrogen | 11668019 | الكشف السريع والحساس والدقيق عن qPCR القائم على المسبار وتحديد كمية أهداف الحمض النووي الريبي المستهدف. |
| Luna Universal Probe خطوة واحدة RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | سوف يتحمل ما يصل إلى 14,000 RCF RNase - / DNase خالية |
| خلايا الكلى Madin-Darby (MDCK) | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Micro Centrifuge Tube (1.5 مل) Axygen | MCT-150-C | 33 مم ، | |
| وحدة تصفية حقنة Millex-HV المعقمة جاما ، 0.45 & micro ؛ م ، PVDF | Millipore | SLHV033RS | الحد الأدنى من الوسط الأساسي المحسن (MEM) الذي يسمح بتقليل مكملات مصل الأبقار الجنينية بنسبة 50٪ على الأقل دون أي تغيير في معدل نمو الخلايا أو مورفولوجيا. يوصى أيضا باستخدام وسيط Opti-MEM I مع كواشف تعداء الدهون الموجبة ، مثل كاشف Lipofectamine. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | تستخدم المضادات الحيوية البنسلين والستربتومايسين لمنع التلوث البكتيري لمزارع الخلايا بسبب عملهما المشترك الفعال ضد البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام. |
| البنسلين الستربتومايسين | جيبكو | 15140122 | الحد الأقصى RCF هو 12,500 xg نطاق درجة الحرارة من -80 درجة ؛ C إلى 120 درجة ؛ أنابيب الطرد المركزي المعقمة PP RNase / DNase |
| br / > (15 مل) | Corning | 430791 | بروتياز سيرين مستقر وعالي التفاعل |
| بروتيناز K | Beyotime | ST532 | معالج لربط الخلايا الأمثل معقم بإشعاع جاما |
| وطبق ثقافة معتمد غير معالج ب TC غير حراري (60 مم) | Corning | 430166 | التربسين من البنكرياس البقري TPCK المعالج ، خالي من الملح بشكل أساسي ، مسحوق مجفف بالتجميد ، & ge ؛ 10,000 وحدة BAEE / مجم بروتين |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | تحتوي هذه التركيبة السائلة من التربسين على EDTA وأحمر الفينول. يتكون Gibco Trypsin-EDTA من مسحوق التربسين ، وهو خليط مشع من البروتياز المشتق من البنكرياس الخنازير. نظرا لقوته الهضمية ، يستخدم التربسين على نطاق واسع لتفكك الخلايا ، ومرور ثقافة الخلايا الروتينية ، وتفكك الأنسجة الأولية. يختلف تركيز التربسين المطلوب للتفكك باختلاف نوع الخلية والمتطلبات التجريبية. |
| التربسين EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمر | جيبكو | 25200056 |
المراجع
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
