Method Article

تحليل الرئيسيات غير البشرية جزيرة البنكرياس استهلاك الأكسجين

DOI:

10.3791/60696

⸱

December 18th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 2Agilent Technologies, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 4Department of Veterans Affairs Tennessee Valley, 5Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول القياس الدقيق والقابل للتكرار لاستهلاك الأكسجين في جزر البنكرياس الرئيسية غير البشرية. وتوفر تقنيات تحميل الجزيرة وطلاء الصفيحة المجهرية اطارا لقياس كفاءه التنفس في أنواع أخرى من الخزان المستزرعة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياس استهلاك الأكسجين في مجموعات كرويه من الخلايا ، مثل الجزر السابقة البنكرياس الجسم الآخر ، تاريخيا كانت صعبه. ونحن نظهر قياس استهلاك جزيرة الأكسجين باستخدام ميكروبلايت 96-بئر مصممه لقياس استهلاك الأكسجين في خزان. في هذا الفحص ، يتم تغليف ألواح المجهرية كروي مع الخلية والانسجه لاصقه في اليوم السابق لفحص. نحن الاستفادة من حجم صغير من الحل لاصقه لتشجيع جزيرة الانضمام إلى الجزء السفلي من البئر فقط. في يوم الفحص, يتم تحميل 15 الجزر مباشره في قاعده كل بئر باستخدام تقنيه التي تضمن الوضع الأمثل للجزر وقياس دقيق لاستهلاك الأكسجين. يتم البحث في جوانب مختلفه من التنفس الميتوكوندريا دوائيا في الجزر الرئيسية غير البشرية, بما في ذلك التنفس المعتمد علي ATP, التنفس القصوى, وتسرب البروتون. هذا الأسلوب يسمح لنتائج متسقة وقابله للتكرار باستخدام عدد قليل من الجزر الصغيرة لكل بئر. فانه يمكن نظريا ان تطبق علي اي خزان مثقف من حجم مماثل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل الحفاظ علي مستويات الجلوكوز في الدم العادية ، يجب ان تستشعر الخلية β البنكرياس الارتفاعات في الجلوكوز وتفرز الانسولين وفقا لذلك. يرتبط اقتران إفراز الانسولين مع مستويات الجلوكوز مباشره باستقلاب الجلوكوز وإنتاج ATP من خلال فوسفولات الاكسده المتقدريه. وهكذا, الميتوكوندريا تلعب دورا حاسما في تحفيز إفراز اقتران1. تقييم وظيفة الميتوكوندريا خليه β يمكن ان تكشف عن العيوب التي تؤدي إلى ضعف إفراز الانسولين. يتم أيضا ربط إفراز الجلوكاجون بخلايا α البنكرياس بشكل وثيق إلى وظيفة الميتوكوندريا2. علي الرغم من ان خطوط الخلايا جزيرة الخلد قد ثبت مفيده لبعض أنواع الاختبارات ، وعلم وظائف الخلايا من هذه الخلية لا تلخص بدقه وظيفة جزير....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اعداد ميكروبلايت وخرطوشه الاستشعار في اليوم السابق لتشغيل الفحص

وكانت الجزر الكبيرة معزولة من macaques اليابانية البالغ من العمر ثلاث سنوات كما وصفت سابقا13. هذا الأسلوب هو مشابه جدا لتلك التي تستخدم لعزل الجزر البشرية من المتبرعين جثة ، ولكن يختلف عن الفئران ، والتي غالبا ما يتم تضخيم بانكريتا مع محلول كولاجيناز في حين ان الحيوانية تحت التخدير وقبل أزاله الجهاز. وأجريت استعاده جزيرة وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام (IACUC) من مركز البحوث الرئيسية الوطنية اوريغون (ONPRC) وجامعه اوريغون الصحة والعلوم ووافقت عليها IACUC ONPRC. وتتقيد الهيئة بقانون رعاية الماشية واللوائح التي تطبقها وزا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحميل الجزر الصغيرة إلى ميكروبلايت ، وينبغي ان يستنشق 15 الجزر في 15 μL من وسائل الاعلام ، كما هو مبين في الشكل 1ا. ستستقر الجزر بشكل طبيعي باتجاه الجزء السفلي من طرف ماصه pipet-x في غضون ثوان معدودة. ثم ، يتم خفض غيض ماصه pipet-x إلى الجزء السفلي من البئر. الطرف هو رفع قليلا جدا ، وحجم صغير (حوالي 5 μL) هو الأنابيب إلى جانب الجزر. هذه التقنية نتائج في وضع ثابت من جزيرة في الجزء السفلي من ميكروبلايت جيدا (الشكل 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أعاقت الدراسة من استهلاك الأكسجين جزيرة في السابق من قبل شكل كروي من الجزر ، وعدم التزام بالأسطح الثقافية ، وعدد الجزر المطلوبة لكل بئر. في هذا البروتوكول ، ونحن تسليط الضوء علي فعاليه 96 كروي microplate لقياس استهلاك الأكسجين جزيرة علي عدد قليل من الجزر الصغيرة وإظهار تقنيه لمناوله وتحميل الجزر التي هي ممكنة من الناحية التقنية وتنتج متسقة نتائج.

من أجل الجزر الصغيرة للانضمام إلى الجزء السفلي من microplate وتكون غير مضطربة خلال خطوات الاختلاط في جميع انحاء الفحص ، يتم تغليف الصفيحة الدقيقة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون ان يعترفوا بنواه الفحص العالي الانتاجيه لاستخدام مرافقهم ، والتكنولوجيات الحيوية Agilent ، والدكتور بول Kievit (جامعه اوريغون للصحة والعلوم) لعزل الرئيسيات غير البشرية ، واريك دوناهو (جامعه فانديربيلت) للحصول علي المساعدة في الشكل 1. وقد دعمت J.M.E. من قبل NIGMS من المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة T32GM007347. وقد دعمت M.G. من قبل المعاهد القومية للصحة/NIDDK (R24DK090964) وأداره شؤون قدامي المحاربين (BX003744).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
طبق زراعة الخلايا ، 60 مم × 15 مم على غرارCorning430166
خلية Cell-Tak ولاصق الأنسجةCorning354240
أنبوب مخروطي ، 50 ملفالكون352070
سكر العنب اللامائيفيشر ScientificBP350-1لمحلول الجلوكوز ، 200 مجم / مل ،
معقمة يمكن التخلص منها (معقمة) ، 25 ملVistalab3054-1033لتحميل الماصة متعددة القنوات
EZFlow معقمة 0.45 & مرشح حقنة m PES ، 13 ممFoxx Life Sciences371-3115-OEM
L-glutamineGibco25030-081200 mM (100x)
أطراف ماصة متعددة القنواتThermoFisher Scientific94410810
ماصة متعددة القنوات ، 15-1250 & mu ؛ LThermoFisher Scientific4672100BTالماصات الموصى
بها P20 و P200 و P1000Eppendorf2231000602
مسبار الأس الهيدروجينيHanna InstrumentsHI2210-01
أطراف ماصة ، 20 مو ؛ لتر ، 200 مو ؛ لتر ، 1000 مو ؛ LOlympus24-404 ، 24-412 ، 24-430
Seahorse XF Base MediaAgilent103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress TestKit Agilent103015-100يشمل Oligomycin و FCCP و Rotenone / Antimycin A
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilentS7800Bبما في ذلك محطة الإعدادية بزاوية 37 درجة ؛ حاضنة C غير CO2
فرس البحر XFe96 Spheroid Fluxpak MiniAgilent102905-100يتضمن خرطوشة مستشعر ، صفيحة كروية ، وعيار
بيكربونات الصوديومفيشر ScientificBP328-500
بيروفات الصوديومGibco11360-070100 ملي متر (100x)
مجهر ستيريوأوليمبوسSZX9
حقنة (معقمة) ، 5 ملBD309603للترشيح المعقم
المياه (المعقمة)SigmaW3500-500mL
خزانات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
  2. Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Non Human Primate IsletsOxygen Consumption MeasurementSpheroid Microplate AssayMitochondrial Respiration AnalysisIslet Adhesion TechniqueExtracellular Flux AnalyzerOligomycin FCCP RotenoneIslet Seeding ProtocolPrimary Islet HandlingMitochondrial Function Assessment

Related Articles