مقالة منهجية

TurboID القائم على القرب العلامات في تحديد بلانتا لشبكات التفاعل البروتين البروتين

DOI:

10.3791/60728

⸱

مايو 17, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفها هنا هو طريقة وضع العلامات القرب لتحديد شركاء التفاعل من مجال النقل البري الدولي من مستقبلات المناعة NLR في أنسجة أوراق نيكوتيانا بنتاميانا. كما يتم توفير بروتوكول مفصل لتحديد التفاعلات بين البروتينات الأخرى ذات الأهمية باستخدام هذه التقنية في نيكوتيانا والأنواع النباتية الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنيات وضع العلامات القرب (PL) باستخدام هندسة أسكوربات بيروكسيديز (APEX) أو Escherichia coli biotin biotin ligase Bira (المعروفة باسم BioID) وقد استخدمت بنجاح لتحديد التفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) في خلايا الثدييات. ومع ذلك ، فإن متطلبات بيروكسيد الهيدروجين السام (H2O2)في PL المستندة إلى APEX ، ووقت الحضانة الأطول مع البيوتين (16-24 ساعة) ، ودرجة حرارة الحضانة الأعلى (37 درجة مئوية) في PL المستندة إلى BioID تحد بشدة من تطبيقاتها في النباتات. وPL التي وصفت مؤخرا TurboID المستندة إلى العديد من القيود من BioID وAPEX. يسمح TurboID بوضع علامات سريعة على قرب البروتينات في 10 دقيقة فقط تحت ظروف درجة حرارة الغرفة (RT). على الرغم من أن فائدة TurboID قد ثبت في النماذج الحيوانية، أظهرنا مؤخرا أن PL المستندة إلى TurboID يؤدي بشكل أفضل في النباتات مقارنة بـ BioID لوضع العلامات من البروتينات التي هي قريبة من البروتين من الفائدة. يقدم هنا بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد شركاء التفاعل البروتين باستخدام N-محطة تول / interleukin-1 مستقبلات المجال (TIR) من النيوكليوتيدات ملزمة leucine الغنية مكرر الأسرة (NLR) البروتين كنموذج. تصف الطريقة بناء النواقل ، والتسلل الزراعي لبنيات التعبير البروتينية ، وعلاج البيوتين ، واستخراج البروتين وإزالة الملح ، والكم ، وإثراء البروتينات المتناهية الحيوية عن طريق تنقية التقارب. ويمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا بسهولة لدراسة البروتينات الأخرى ذات الأهمية في نيكوتيانا والأنواع النباتية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PPIs هي أساس العمليات الخلوية المختلفة. تشمل الطرق التقليدية لتحديد PPIs فحص الخميرة-اثنين الهجين (Y2H) وهطول الامطار المناعية إلى جانب قياس الطيف الكتلي (IP-MS)1. ومع ذلك، يعاني كلاهما من بعض العيوب. فعلى سبيل المثال، يتطلب فحص عام 2حاء توافر مكتبة Y2H للأنواع النباتية أو الحيوانية المستهدفة. إن بناء هذه المكتبات كثيف العمالة ومكلف. وعلاوة على ذلك، يتم تنفيذ نهج Y2H في خميرة الكائن الحي الأوكاريوتيكي أحادي الخلية غير المتجانسة، والتي قد لا تمثل الحالة الخلوية للخلايا الأوكاريوتيكية العليا.

وعلى النقيض من ذلك، فإن IP-MS يظهر كفاءة منخفضة في التقاط مؤشرات أسعار الصفحات العابرة أو الضعيفة، كما أنه غير مناسب لتلك البروتينات ذات الوفرة المنخفضة أو الهيدروفوبية العالية. يتم التعبير عن العديد من البروتينات الهامة المشاركة في مسارات إشارات النبات مثل الكيناز الشبيهة بالمستقبل (RLKs) أو عائلة NLR من مستقبلات المناعة بمستويات منخفضة وغالباً ما تتفاعل مع البروتينات الأخرى بشكل عابر. ولذلك، فإنه يحد إلى حد كبير من فهم الآليات التي تقوم عليها تنظيم هذه البروتينات.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق وضع العلامات القرب (PL) على أساس الايكوربات المهندسة peroxidase (APEX) ومتحولة Escherichia coli biotin الكولاي biraR118G (المعروفة باسم BioID) واستخدامها لدراسة PPIs2،3،4. مبدأ PL هو أن البروتين المستهدف من الفائدة تنصهر مع إنزيم، مما يحفز تشكيل labile biotinyl-AMP (الحيوي AMP). يتم تحرير هذه الحرة الحيوية AMP بواسطة إنزيمات PL وتنتشر إلى محيط البروتين المستهدف، مما يسمح للتفريط الحيوي من البروتينات القريبة في الأمينات الأولية ضمن دائرة نصف قطرها تقدر بـ 10 نانومتر5.

ولهذا النهج مزايا كبيرة على النهجالتقليدي لعام 2H وIP-MS، مثل القدرة على التقاط مؤشرات أسعار الصرف الأولي العابرة أو الضعيفة. وعلاوة على ذلك، يسمح PL وضع العلامات من البروتينات القريبة من البروتين المستهدف في بيئاتها الخلوية الأصلية. الإنزيمات PL مختلفة لها عيوب فريدة عند تطبيقها على أنظمة مختلفة. على سبيل المثال ، على الرغم من أن APEX يقدم حركية علامات أعلى مقارنة بـ BioID ويتم تطبيقه بنجاح في أنظمة الثدييات ، فإن متطلبات بيروكسيد الهيدروجين السام (H2O2)في هذا النهج يجعلها غير مناسبة لدراسات PL في النباتات.

في المقابل ، يتجنب PL المستند إلى BioID استخدام H2O2السام ، ولكن معدل وضع العلامات بطيء (يتطلب 18-24 ساعة لإكمال علم الخلايا الحيوية) ، مما يجعل التقاط مؤشرات أسعار الصفحات العابرة أقل كفاءة. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع درجة حرارة الحضانة (37 درجة مئوية) اللازمة لكفاءة PL بواسطة BioID يدخل الإجهاد الخارجي لبعض الكائنات الحية، مثل النباتات4. لذلك ، تم الإبلاغ عن نشر محدود من PL المستندة إلى BioID في النباتات (أي نتوءات الأرز وArabidopsis و N. benthamiana) 6و7و8و9. الانزيم TurboID وصفها مؤخرا يتغلب على أوجه القصور من APEX وBioID القائم على PL. TurboID أظهرت نشاط عال يمكن من إنجاز PL في غضون 10 دقيقة في RT10. وقد تم تطبيق PL توربوID المستندة بنجاح في خلايا الثدييات والذباب والديدان10. في الآونة الأخيرة، ونحن وغيرها من مجموعات البحوث بشكل مستقل الأمثل وتوسيع نطاق استخدام PL توربودي المستندة لدراسة PPIs في أنظمة نباتية مختلفة، بما في ذلك N. بنتامانيا والنباتات Arabidopsis والطماطم جذور شعر11،12،13،14. أشارت التحليلات المقارنة إلى أن TurboID يؤدي أداء أفضل لPL في النباتات مقارنة بـ BioID11,14. كما أظهرت متانة PL المستندة إلى TurboID في بلانتا من خلال تحديد عدد من التفاعلات الجديدة مع مستقبلات المناعة NLR11, بروتين يصعب عادة الحصول على شركاء التفاعل باستخدام الطرق التقليدية.

يوضح هذا البروتوكول PL المستندة إلى TurboID في بلانتا من خلال وصف تحديد بروتينات التفاعل في مجال النقل البري الدولي N-terminal لمستقبلات المناعة NLR في نباتات N. benthamiana. ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى أي بروتينات ذات أهمية في N. بنثاميانا. والأهم من ذلك، أنه يوفر مرجعا هاما للتحقيق PPIs في الأنواع النباتية الأخرى مثل العربيدوبسيسوالطماطم وغيرها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة على الأسلوب في الشكل 1.

1. إعداد المواد النباتية

  1. تنمو N. بنثاميانا البذور في التربة الرطبة بكثافة عالية والحفاظ عليها في غرفة المناخ مع ضوء 16 ساعة (حوالي 75 ميكرومول / م2ث) و 8 ساعة فترة ضوئية مظلمة في 23-25 درجة مئوية.
  2. حوالي 1 أسبوع في وقت لاحق، ونقل بعناية كل شتلات الشباب إلى 4 '× 4' الأواني والحفاظ على الشتلات في نفس الغرفة.
  3. الحفاظ على النباتات في الغرفة لمدة 4 أسابيع تقريبا حتى تنمو إلى مرحلة ورقة من 4-8 للتسرب الزراعي اللاحقة15.

2. بناء الانصهار TurboID

  1. استخدام تقنية الاستنساخ الجزيئي القياسية لتوليد الانصهار من البروتين المستهدف مع TurboID (PCR TurboID من #107177 Addgene plasmid). هنا، استخدمنا مجال النقل البري الدولي N-terminal من مستقبلات المناعة NLR كبروتين الهدف من الفائدة وشيدت TIR تنصهر إلى TurboID تحت سيطرة القرنبيط فيروس الفسيفساء 35S المروج (p35S::TIR-TurboID).
    ملاحظة: سوف الانصهار من إنزيم توربوID إلى الريكونولين أو الأمينية terminus من البروتين المستهدف تعتمد على البروتين الفائدة. عادة، للبروتين السيتوبلازمي، ينبغي أن يكون كلا تيرميني مقبولة، طالما أن الانصهار TurboID لا يؤثر على وظيفة البروتين المستهدف. ومع ذلك ، بالنسبة للبروتين المترجمة الغشاء ، يجب وصف طوبولوجيا البروتين مسبقًا قبل تحديد الترصال الأفضل للانصهار TurboID.
  2. بناء السيترين المنصهر ة TurboID تحت نفس المروج لتكون بمثابة السيطرة على التحليل البروتيني الكمي اللاحقة.
    ملاحظة: من المهم بناء عنصر تحكم TurboID لتحديد البروتيوم القريب من البروتين المستهدف. يجب أن يظهر عنصر التحكم في الانصهار TurboID مستوى تعبير مشابه لمستوى البروتين المستهدف المنصهر TurboID. ويمكن تحديد ذلك تجريبيا عن طريق تعديل تركيز البكتيريا الزراعية أثناء التسلل الزراعي. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أن يكون بروتين التحكم نمط توطين تحت الخلية مشابهًا لنمط البروتين المستهدف المهم.

3 - التسلل الزراعي

  1. تحويل البلازميدات إلى بكتيريا زراعية
    1. أضف 0.5 ميكروغرام من البلازميدات المتولدة من الخطوتين 2.1 و 2.2 إلى 50 ميكرولتر من الخلايا الزراعية المتوحية من Agrobacterium سلالة GV3101 الخلايا المختصة، أعدت على النحو المبين سابقا16.
      ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام سلالات أخرى من البكتيريا الزراعية، مثل GV2260.
    2. التأنيعلى الثلج لمدة 30 دقيقة.
    3. صدمة الحرارة في حمام مائي في 42 درجة مئوية لمدة 60 s.
    4. أضف 400 ميكرولتر من LB المتوسطة (10 ز/لتر تريبتون، 5 ز/لتر مستخلص الخميرة، و 10 ز/لتر NaCl؛ درجة الحموضة = 7.0) إلى Agrobacterium واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
    5. لوحة المحتوى بأكمله في أنبوب على LB أجار تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة لتحديد البلازميد, وكذلك لAgrobacterium (لGV3101: 50 ملغ / لتر gentamicin و 50 ملغ / لتر ريفامبيسين).
    6. لوحات الحضن في 28 درجة مئوية لمدة 36-48 ساعة حتى المستعمرات الفردية مرئية.
  2. اختيار وسلسلة العديد من المستعمرات الفردية على لوحة أجار LB الطازجة مع المضادات الحيوية (انظر الخطوة 3.1.5) وتنمو في 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: فمن الأمثل أكثر لأداء PCR مستعمرة لتأكيد وجود بناء ثنائي محددة في Agrobacterium. في تجربتنا, أكثر من 95% من المستعمرات تحتوي على البنى الثنائية المقدمة.
  3. Inoculate 3 مل من LB المتوسطة بالإضافة إلى المضادات الحيوية المناسبة (انظر الخطوة 3.1.4) مع مستعمرة Agrobacterium إيواء بناء الفائدة، واحتضان عن طريق الهز بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية حتى OD600 من ثقافة Agrobacterium تصل إلى 2.0.
  4. طرد الخلايا في 3000 × ز وإعادة تعليقها إلى OD600 = 1.0 في المخزن المؤقت للتسلل الزراعي (10 mM MgCl2، 10 mM MES [pH = 5.6] ، 250 ميكرومتر acetosyringone).
    ملاحظة: على الرغم من أنه من الأمثل لاحتضان التطعيم لمدة 2 ساعة في RT قبل الاختراق الزراعي، في تجربتنا مع سلالة GV3101، لم يكن هناك فرق كبير بين التعبير البروتين المستهدف مع مقابل دون حضانة.
  5. استخدام حقنة 1 مل إبرة لاختراق inoculum في البشرة (abaxial) من أوراق N. بنتامانيانا ناضجة تماما.
    ملاحظة: لإعداد كمية كافية من المواد الورقية لثلاث نسخ بيولوجية: عادة ما يتم اختراق ورقة كاملة، ويتم اختراق ثلاث أوراق لكل مصنع، وتستخدم ثلاثة إلى أربعة مصانع لكل بناء. لكل ورقة، 1.5-2.0 مل من البكتيريا الزراعية التي أعيد تعليقها كافية.
  6. After 36 h post-infiltration (hpi), infiltrate 200 μM biotin (in 10 mM MgCl2 solution) into the leaves pre-infiltrated with TurboID constructs.
  7. الحفاظ على النبات ل3-12 ساعة إضافية قبل حصاد الأنسجة ورقة كما هو موضح في القسم 4.
    ملاحظة: السبب في اختيار 36 hpi لتسلل البيوتين هو أن التعبير البروتين المستهدف قمم في هذه النقطة الزمنية وفقا للدراسات السابقة11. ينصح بتحديد الوقت اللازم للتعبير الأمثل عن البروتين المستهدف من الفائدة. يعتمد وقت الحضانة بعد تسرب البيوتين على التصميم التجريبي والبروتين المستهدف قيد الدراسة. عادة، 3-12 ساعة من العلاج البيوتين يسمح وضع العلامات من معظم البروتينات قريبة من البروتين المستهدف من قبل الانصهار توربوID.

4. ورقة عينة جمع

ملاحظة: للمعالجة اللاحقة لعينات الأوراق، ارتدي قفازات معقمة لتجنب تلوث الكيراتين بالعينات. يجب أن تكون جميع الكواشف أيضًا خالية من الكيراتين قدر الإمكان.

  1. قطع الأوراق المتسللة في قاعدة البتيول، وإزالة الوريد ورقة، ثم فلاش تجميد الأنسجة ورقة في النيتروجين السائل.
  2. طحن الأنسجة ورقة باستخدام الحشرات وقذائف الهاون وتخزين مسحوق ورقة في 15 مل أو 50 مل أنابيب الصقر في -80 درجة مئوية للاستخدام اللاحق.
    ملاحظة: خذ ثلاث إلى أربع قطع من الأوراق لكل من النسخ البيولوجية الثلاثة من النباتات المختلفة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا. قبل الخطوات اللاحقة ، يوصى بتقييم التعبير البروتيني وفرط البروتين الحيوي من البروتين المستهدف عن طريق تحليلات المناعي. وتظهر البوات الغربية النموذجية في الشكل 2.

5. استخراج من البروتين الكلي ورقة

  1. نقل حوالي 0.35 غرام من مسحوق ورقة إلى أنبوب 2 مل. إعداد أنبوبين لكل عينة.
    تنبيه: ارتداء القفازات عند لمس أي كائن تبريد بواسطة النيتروجين السائل.
  2. إضافة 700 ميكرولتر من العازلة الليسيس RIPA (50 mM Tris-HCl [درجة الحموضة = 7.5] ، 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0.1% SDS [w/v], 0.5% ثنائي الصوديوم [w/v], 1 mM DTT, 1 قرص من كوكتيل مثبطات البروتياز) إلى 0.35 غرام من مسحوق الأوراق.
  3. دوامة الأنابيب لمدة 10 دقيقة.
  4. اترك العينات على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  5. خلط محتويات كل 4-5 دقيقة عن طريق تحويل الأنابيب رأسا على عقب عدة مرات.

6. إزالة البيوتين الحر عن طريق إزالة الملح

ملاحظة: يستغرق هذا القسم حوالي 50 دقيقة.

  1. معادلة العمود إزالة الملح.
    1. إزالة الصاحب في الجزء السفلي من العمود desalting ووضع العمود في أنبوب 50 مل.
    2. إزالة محلول التخزين عن طريق الطرد المركزي في 1000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وتأكد من أن يتم تخفيف الغطاء.
    3. ضع العمود المملح في أنبوب 50 مل. Equilibrate العمود 3x مع 5 مل من العازلة RIPA lysis، في كل مرة الطرد المركزي في 1000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة والتخلص من flowthrough.
    4. نقل العمود إزالة الملح إلى أنبوب جديد 50 مل وتخزينها مؤقتا في 4 درجة مئوية للاستخدام اللاحق.
  2. تدور الأنابيب من الخطوة 5.4 في 16500 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ونقل supernatant من اثنين من أنابيب إلى أنبوب جديد 2 مل.
  3. أضف 1500 ميكرولتر من مستخلص البروتين إلى الجزء العلوي من راتنج العمود الملوحة المتساوية (من الخطوة 6.1.4). عندما يدخل مستخلص البروتين الراتنج، أضف 100 ميكرولتر أخرى من عازل RIPA lysis.
    ملاحظة: على الرغم من أن 1400 ميكرولتر من المحلول المؤقت RIPA كان يستخدم لاستخراج البروتين من الأوراق، تم دائما زيادة الحجم الإجمالي بعد استخراج البروتين وإزالة الملح إلى حد ما بالنسبة للحجم الأصلي. ولذلك، فإن الجمع بين العينات من كل مجموعة على النحو المبين في الخطوتين 5-1 و 5.4 يمكن أن يؤدي إلى ما لا يقل عن 500 1 ميكرولتر من مستخلص البروتين لكل عينة.
  4. الطرد المركزي في 1000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وترك العينات المنحلة على الجليد مؤقتا.

7. القياس الكمي لمستخلصات البروتين المملح باستخدام قياس برادفورد

  1. إعداد 50 ميكرولتر من كل محلول BSA التدرج: 0 ملغ / مل, 0.2 ملغ/مل, 0.4 ملغ/مل, 0.6 ملغ/مل, 0.8 ملغ/مل, و 1 ملغ/مل.
  2. تمييع مستخلص البروتين المملح عن طريق خلط عينة 5 ميكرولتر مع 45 ميكرولتر من ddH2O.
  3. إعداد 1x برادفورد ريجنت عن طريق تخفيف 5x برادفورد الوصي (100 ملغ من Coomassie الأزرق الرائع G250, 47 مل من الميثانول, 100 مل من 85% حمض الفوسفوريك, 53 مل من ddH2O).
  4. إضافة 50 ميكرولتر من كل التدرج BSA الحل و 50 ميكرولتر من مستخلص البروتين المخفف إلى 2.5 مل من 1x برادفورد ريجنت.
  5. احتضان في RT لمدة 10 دقيقة.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من محلول كل عينة إلى بئر واحد من لوحة ELISA (ثلاثة يكرر التقنية لكل عينة).
  7. قياس OD595 باستخدام قارئ microplate.
  8. رسم المنحنى القياسي على أساس قيمة التدرج محلول BSA وحساب تركيز عينات البروتين المملح. عادة، يتراوح إجمالي تركيز البروتين الذي تم الحصول عليه من 0.7 غرام من الأوراق من 3-6 ملغم/مل.
  9. إعداد 6-8 ملغ من مستخلص البروتين المملح لتنقية تقارب لاحقة.

8- إثراء البروتينات الحيوية

  1. خذ 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المترافق بين العقديات وC1 في أنبوب 2 مل.
  2. Equilibrate streptavidn-C1-زوجية الخرز المغناطيسي مع 1 مل من RIPA lysis المخزن المؤقت لمدة 1 دقيقة في RT.
  3. بعد كل غسل، استخدم الرف المغناطيسي لامتصاص الخرز لمدة 3 دقيقة وإزالة بلطف الحل عن طريق الأنابيب.
  4. كرر الخطوتين 8.2 و 8.3.
  5. نقل مستخلص البروتين المملح إلى الخرز المغناطيسي المأبس streptavidn-C1- المترافق.
  6. احتضان الأنبوب في 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة (أو بين عشية وضحاها) على دوار لتنقية تقارب البروتينات الحيوية.
  7. التقاط الخرز على رف المغناطيسي لمدة 4 دقيقة في RT حتى الخرز جمع في جانب واحد من الأنبوب، ثم إزالة بلطف supernatant بواسطة ماصة.
  8. إضافة 1.7 مل من غسل المخزن المؤقت الأول (2٪ SDS في الماء) إلى الأنبوب والاحتفاظ بها على الدوار في RT لمدة 8 دقيقة. كرر الخطوة 8.3.
  9. إضافة 1.7 مل من غسل المخزن المؤقت الثاني (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% حمض ديوكسيتشوليك [ث/v], 1% تريتون X-100) إلى الأنبوب والاحتفاظ بها على الدوار في RT لمدة 8 دقيقة. كرر الخطوة 8.3.
  10. إضافة 1.7 مل من غسل المخزن المؤقت الثالث (10 mM Tris-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% حمض ديوكسيكولينيك [ث/v], 1% NP40 [v/v]) إلى الأنبوب والاحتفاظ بها على الدوار في RT لمدة 8 دقيقة. كرر الخطوة 8.3.
  11. أضف 1.7 مل من 50 مل تريس-HCl (درجة الحموضة = 7.5) لإزالة المنظفات، ثم كرر الخطوة 8.3.
  12. نقل الخرز إلى أنبوب جديد 1.5 مل، وكرر الخطوات 8.11 و 8.3.
  13. اغسل الخرز 6x لمدة 5 دقيقة لكل منها مع حاجز بيكربونات الأمونيوم 50 mm في RT.
  14. إضافة 1 مل من 50 mm البيكربونات الأمونيوم العازلة إلى الخرز المغناطيسي وتخلط جيدا.
  15. إزالة 100 ميكرولتر من الخرز لتحليل البلوت المناعي لتأكيد إثراء البروتينات الحيوية. وتظهر لطخة غربية نموذجية في الشكل 3.
  16. فلاش تجميد بقية عينات البروتين وتخزينها في -80 درجة مئوية أو إرسالها على الفور لتحليل LC-MS / MS على الجليد الجاف.
    ملاحظة: يتم عرض نتائج MS النموذجية في منشور سابق (Zhang et al. 2019; الشكل 2، البيانات التكميلية 1، والبيانات التكميلية 2)11. تتوفر مجموعات البيانات بأكملها على MassIVE (وجدت في < http://massive.ucsd.edu > ) باستخدام المعرف: MSV000083018 و MSV000083019.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيانات التمثيلية، التي توضح النتائج المتوقعة استناداً إلى البروتوكول الموصوف، مقتبسة من تشانغ وآخرون11. يلخص الشكل 1 إجراءات تنفيذ PL المستندة إلى TurboID في N. benthamiana. ويبين الشكل 2 التعبير البروتين والحيوية tinylation في أوراق N. بنتامانيانا تسلل. ويبين الشكل 3 أن البروتينات الضئيلة بيولوجيا في الأوراق المخترقة قد تم إثراؤها بكفاءة لتحليل الطيف الكتلي اللاحق. تجدر الإشارة إلى أنه بع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إنشاء الرباط البيوتيد TurboID بواسطة الخميرة القائمة على عرض تطور توجيه BioID10. لديها العديد من المزايا على إنزيمات PL الأخرى. TurboID يسمح بتطبيق PL على أنظمة نموذج أخرى، بما في ذلك الذباب والديدان، ودرجة حرارة النمو الأمثل حوالي 25 درجة مئوية10. على الرغم من أن نهج PL قد استخدم على نطاق واسع في النظم الحيوانية ، فإن تطبيقه في النباتات محدود. يوفر البروتوكول الموصوف هنا إجراءً خطوة بخطوة لإنشاء PL المستند إلى TurboID في N. benthamiana، وهو نبات نموذجي تم استخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح من البرنامج الوطني للعلوم والتكنولوجيا المعدلة وراثيا (2019ZX08010-003 إلى Y.Z.) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31872637 إلى Y.Z.) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2019TC028 إلى Y.Z.) ، وNSF-IOS-1354434 ، NSF-IOS-1339185، وNIH-GM132582-01 إلى S.P.D.K.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
721 مقياس الطيفMetash ، صنع في الصينQ / SXFZ6لقياس OD600< / sub>
بيكربونات الأمونيومSigmaA6141-500G
BiotinSigmaB4639-1G50 mM مخزون
أجهزة الطرد المركزيEppendorfالطرد المركزي 5702
أجهزة الطرد المركزيEppendorf5417R
كوكتيل مثبط البروتيازروش11697489001
حمض الديوكسيكوليكسيجماD2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001لتنقية التقارب
EDTASigmaE6758-500G
لوحة ELISACorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
حمض الهيدروكلوريك (HCl) فيشرScientificA144S-212
Immobilon-P PVDF غشاءMilliporeIPVH00010لتحليل اللطخة الغربية
محلول كلوريد الليثيوم (LiCl) ، 8MSigmaL7026-500ML
مبردة منخفضة السرعة جهاز طرد مركزيZonkia ، صنع في الصينKDC-2046لتحلية
كلوريد المغنيسيوم ، سداسي هيدرات (MgCl2< / sub> & middot ؛ 6H 2 < / sub >O)SigmaM9272-500G
رف مغناطيسيInvitrogen123.21Dلامتصاص الخرزة
Multiskan FC Microplate مقياس ضوئيحراري فيشر ScientificN07710ل OD595< / sub> قياس
NP-40 (IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Rat anti-HARoche11867423001
خلاط دورانيKylin-Bell Lab InstrumentWH-986
لحاضنة IP ShockLabotery ، صنع في الصينZQPZ-228
كلوريد الصوديوم (NaCl)فيشر ScientificS271-3
صوديوم ديوكسي كولاتSigmaD2510-100G
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)SigmaL4390-1KG
Streptavidin-HRPAbcamab7403
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma baseSigmaT1503-1KG
دوامةالصناعات العلميةG-560E
حاضنة سترة مائيةزرقاء ، صنع في الصينGHP-9080لحضانة
Agrobacterium< / em>Zeba Spin Desalting ColumnThermo Fisher Scientific89893لإزالة البيوتين
الضوئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
  3. Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
  4. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
  6. Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
  7. Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212(2018).
  8. Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
  9. Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326(2019).
  10. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252(2019).
  12. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
  13. Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
  14. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864(2019).
  15. Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468(2011).
  16. McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
  17. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  18. Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
  19. Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TurboID NLR Nicotiana benthamiana

مقالات ذات صلة