يصف هذا البروتوكول الطريقة والمواد والمعدات والخطوات اللازمة لإعداد الحمض النووي الريبي والبروتين يُنتج الخلايا الاصطناعية من أسفل إلى أعلى. تحتوي المقصورة المائية الداخلية للخلايا الاصطناعية على تحلل اتبكي S30 مغلف داخل طبقة ثنائية من الدهون (أي الليبوزومات المستقرة) ، وذلك باستخدام طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نهج التجميع من أسفل إلى أعلى لبناء الخلايا الاصطناعية هو أداة فعالة لعزل والتحقيق في العمليات الخلوية في بيئة تحاكي الخلية. وعلاوة على ذلك، أظهر تطوير أنظمة التعبير الخالية من الخلايا القدرة على إعادة إنتاج البروتين والنسخ وعمليات الترجمة (DNA→RNA→protein) بطريقة خاضعة للرقابة، مما يسخّر البيولوجيا التركيبية. هنا نصف بروتوكول لإعداد نظام التعبير خالية من الخلايا، بما في ذلك إنتاج تحلل البكتيريا قوية وتغليف هذا تحلل داخل الغنية بالدهون الغنية بالدهون الحويصلات يونيلاميلار (GUVs) (أي liposomes مستقرة)، لتشكيل الخلايا الاصطناعية. ويصف البروتوكول طرق إعداد مكونات الخلايا الاصطناعية بما في ذلك إنتاج الخلايا البكتيرية النشطة، يليها إعداد مفصل للخلايا الاصطناعية خطوة بخطوة على أساس طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت. هذه تسهل إنتاج الملايين من الخلايا الاصطناعية بطريقة بسيطة وبأسعار معقولة مع براعة عالية لإنتاج أنواع مختلفة من البروتينات. يمكن استخدام الخلايا الاصطناعية التي تم الحصول عليها للتحقيق في إنتاج البروتين / الحمض النووي الريبي والنشاط في بيئة معزولة ، في تطور موجه ، وكذلك كمنصة تسليم الأدوية الخاضعة للرقابة لإنتاج البروتينات العلاجية عند الطلب داخل الجسم.
المقدمة
الخلايا الاصطناعية هي جزيئات تشبه الخلايا الاصطناعية ، تحاكي وظيفة واحدة أو متعددة للخلية الحية ، مثل القدرة على الانقسام ، وتشكيل تفاعلات الغشاء ، وتوليف البروتينات استنادًا إلى رمز وراثي1،2،3. تمتلك الخلايا الاصطناعية التي تُغلف أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) وحدات عالية بسبب قدرتها على إنتاج بروتينات مختلفة وتسلسلات الحمض النووي الريبي بعد التعديلات في قالب الحمض النووي. تقديم بديل جذاب للنهج الحالية لإنتاج البروتين، وتستند أنظمة CFPS على تحلل الخلايا، والمكونات النقية، أو المكونات الاصطناعية وتشمل جميع آلات النسخ والترجمة اللازمة لتخليق البروتين مثل الريبوس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يتم تقديم توضيح بروتوكول إنتاج الخلايا الاصطناعية الكاملة في الشكل 1. وفقا لاحتياجات المستخدم، يمكن أيضا أن يتم التعبير البروتين (القسم 3.2) وتشكيل الخلايا الاصطناعية (القسم 4) أجزاء من البروتوكول بشكل مستقل (مع بعض التعديلات).
1. إعداد S30-T7 lysate
- لوحة متتالية والقولونية BL21 (DE3) البكتيريا التي تحولت مع T7 RNA polymerase التعبير عن pAR1219 plasmid على لوحة LB-agar تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين للحصول على مستعمرات واحدة.
- إعداد حل بداية: Inoculate مستعمرة واحدة إلى 5 مل من LB-media تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين في قارورة إرلينماير 100 مل وتنمو بين عشية وضح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نحن نقدم بروتوكوللإعداد الخلايا الاصطناعية عن طريق تغليف نظام S30-T7 CFPS على أساس BL21 E. القولونية داخل الحويصلات الدهنية. ويرد في الشكل 2وصف تخطيطي لعملية الإعداد يتضمن صورة لكل مرحلة . يعتمد نجاح عملية إعداد الخلايا الاصطناعية على الأداء المناسب لكل مرحلة ويتأثر بمعلمات مختلفة. وينبغي تعديل البروتوكول لاستيعاب إنتاج بروتين معين.
تم إدخال Plasmids التعبير عن نموذج البروتين فائقة المجلد البروتين الفلورسنت الأخضر (sfGFP) ورينيلا Luciferase تحت T.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة وبأسعار معقولة لإنتاج كميات كبيرة من الخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين. تعتمد غلة الخلايا النشطة على التنفيذ الدقيق والدقيق للبروتوكول مع التركيز على العديد من الخطوات الحاسمة. في قسم إعداد الليكل من هذه الطريقة ، من الضروري الوصول إلى كثافة البكتيريا المناسبة قبل تحليل الخلايا لتحقيق كمية كافية من البروتينات في الانزلات البكتيري. ثانيا، يجب أن يتم إجراء عملية الانزل عند 4 درجة مئوية وتجمد الليسات بسرعة مع النيتروجين السائل للحفاظ على نشاط البروتين. وعلاوة على ذلك، في هذا البروتوكول استخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل ERC-STG-2015-680242.
ويعترف المؤلفون أيضا بدعم مركز تكنيون المتكامل للسرطان( TICC)؛ معهد راسل بيري للتكنولوجيا النانوية؛ مركز لوري لوكي متعدد التخصصات لعلوم الحياة والهندسة؛ وزارة الاقتصاد الإسرائيلية لمنحة كامين (52752)؛ وزارة تكنولوجيا العلوم والفضاء الإسرائيلية - مكتب كبير العلماء (3-11878)؛ المؤسسة الإسرائيلية للعلوم (1778/13، 1421/17)؛ الجمعية الإسرائيلية للسرطان (2015-0116)؛ المؤسسة الألمانية الإسرائيلية للبحث العلمي والتطوير من أجل منحة من شركة GIF Young (I-2328-1139.10/2012)؛ برنامج الاتحاد الأوروبي FP-7 IRG لمنحة الاندماج الوظيفي (908049)؛ منحة مركز أبحاث فوسفوليبيد؛ (أ) مؤسسة روزنبلات لبحوث السرطان، منحة مؤ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>أ. الكواشف المطلوبة للخطوة 1 (تحضير المحللة S30-T7) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | الإشريكية القولونية BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | ناقل TargeTron للتحول. |
| محلول مخزون 50 مجم / مل أمبيسلين | سيجما | A9518 | مخزن عند -20 درجة مئوية. |
| 10 جم / لتر باكتو تريبتون | BD Bioscience ؛ | 211705 | لتحضير لوحة أجار لوريا بيرتاني (LB) (1.5٪). |
| 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 جم / لتر مستخلص الخميرة البكتو | BD Bioscience ؛ | 212750 | |
| 15 جم / لتر أجار أجار منقى | ميرك | 1.01614.5007 | |
| 50 & مايكرو ؛ جم / مل أمبيسلين | سيجما | A9518 | |
| 10 جم / لتر باكتو تريبتون | BD Bioscience ؛ | 211705 | لتحضير وسائط لوريا بيرتاني (LB) (20 مل). |
| 10 جم / لتر كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 جم / لتر مستخلص الخميرة البكتو | BD Bioscience ؛ | 212750 | |
| 50 & جم / مل أمبيسلين | سيجما | A9518 | |
| 12 جم / لتر باكتو تريبتون | BD Bioscience ؛ | 211705 | لتحضير وسائط المرق الرائع (TB) (1 لتر). |
| 24 جم / لتر مستخلص الخميرة BD | Bioscience ؛ | 212750 | |
| 4٪ (حجم / حجم) مختبر حيوي لا مائي من الجلسرين | 7120501 | ||
| 2.32 جم / لتر K2HPO4 | كيميائي طيف | P1383 | |
| 12.54 جم / لتر KH2PO4 | كيميائي الطيف | P1380 | |
| ؛ 50 وميكرو ؛ جم / مل أمبيسلين | سيجما | A9518 | |
| محلول مخزون من 100 ملي مولار من الأيزوبروبيل بيتا ؛ -D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) ؛ | INALCO | INA-1758-1400 | تمت تصفيته باستخدام 0.2 & micro ؛ م مرشح حقنة PVDF محب للماء. |
| محلول مخزون 0.1 M dithiothreitol (DTT) ؛ | TCI | D1071 | تمت تصفيته باستخدام 0.2 & micro ؛ م مرشح حقنة PVDF محب للماء. |
| 10 ملي مولار ثلاثية الأسيتات عند الرقم الهيدروجيني = 7.4 | سيجما | T1503 | S30 محلول عازلة (1.5 لتر) |
| 14 ملي أسيتات المغنيسيوم | ميرك | 1.05819.0250 | |
| 60 ملي أسيتات البوتاسيوم | كارلو إربا | 470147 | |
| 1 ملي متر DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 مل / لتر 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| المعدات المطلوبة للخطوة 1< / قوي> | |||
| 100 مل قوارير Erlenmeyer معقمة | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 قارورة |
| 2 لتر قوارير Erlenmeyer معقمة مع حواجز | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 قوارير |
| شاكر حاضنة الأرضية | MRC | TOU-120-2 | حاضنة شاكر المختبر 450x450mm ، 400 دورة في الدقيقة ، 70 درجة ؛ C |
| الطرد المركزي | الحرارية العلمية | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX دوار بزاوية ثابتة. يجب أن تمكن ما لا يقل عن 13,000 × g. ؛ * مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية. |
| الخالط عالي الضغط | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية. |
| -80 < سوب > < / سوب> ج فريزر | SO-LOW | U85-18 | |
| بلاستيكية معقمة 1.5 مل | Eppendorf | 30120086 | يفضل تبريدها مسبقا إلى -20 درجة مئوية. |
| مقياس الطيف | الضوئي TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96 جيدا لوحة شفافة | 167008 | حراري علمي | |
| أسطوانة متدرجة | معقمة أنابيب أجهزة | ||
| Eppendorf | 30120086 | يفضل أن يتم تبريدها مسبقا إلى -20 درجة مئوية. | |
| أطراف ماصة معقمة | كورنينج | يفضل تبريدها مسبقا إلى -20 درجة مئوية. | |
| دلو الثلج المجروش | Bel-Art | M18848-4001 | |
| خزان نيتروجين سائل صغير | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. الكواشف المطلوبة للخطوة 3 (الدهون في تحضير محلول الزيت): < / قوي> | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | مسحوق |
| الكوليسترول | Sigma | C8667 | مسحوق |
| الكلوروفورم | Bio-Lab | 3082301 | |
| الزيوت المعدنية | Sigma | M5904 | الزيت الخفيف |
| < قوي > المعدات المطلوبة للخطوة 2 < / قوي> | |||
| خلاط دوامة | الصناعات العلمية | SI-0256 | |
| كتلة التدفئة | TECHNE | FDB03AD | يسخن مسبقا إلى 80 درجة مئوية يجب أن يتيح التحكم في درجة الحرارة. |
| 2 مل قوارير زجاجية برغي برغي | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | على نطاق أوسع ، استخدم 50 مل من الصقور وتبخر الكلوروفورم باستخدام المبخر الدوار. |
| 9 مم غطاء لولبي | CSI الابتكارات التحليلية | C395R-09LC | |
| strong>C. الكواشف المطلوبة للخطوة 3 (مخاليط التفاعل الداخلية والتغذية): < / قوي> | |||
| طيف | HEPES | H1089 | 1 M HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني = 8) - عازلة الأس الهيدروجيني |
| هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M أسيتات المغنيسيوم | ميرك | 1.05819.0250 | مساعد ومثبت الشحنة السالبة. |
| 1 م أسيتات البوتاسيوم | كارلو إربا | 470147 | مثبت الشحنة السالبة. |
| 5.2 M أسيتات الأمونيوم | Merck | 1.01116.1000 | يستقر الشحنة السالبة. |
| 50٪ (وزن / حجم) بولي إيثيلين جلايكول 6000 (PEG) | ميرك | 8.07491.1000 | يزيد من تركيز الجزيئات الكبيرة. |
| 0.5 م 3-فوسفوغليسرات (3-PGA) | سيجما | P8877 | مصدر طاقة ثانوي. |
| 50 ملي مولار خليط الأحماض الأمينية I | Sigma | LAA21-1KT | مضافات الأحماض الأمينية يحتوي على: 50 ملي مولار من كل من الأحماض الأمينية الطبيعية ال 17 التالية - ألانين ، أرجينين ، أسباراجين ، حمض الأسبارتيك ، السيستين ، الجلوتامين ، حمض الجلوتاميك ، الجلايسين ، الهيستيدين ، الأيزولوسين ، الليوسين ، ليسين ، الميثيونين ، البرولين ، السيرين ، ثريونين ، والفالين. |
| 50 ملي مولار خليط الأحماض الأمينية II | Sigma | LAA21-1KT | مضاف للأحماض الأمينية يحتوي على: 50 ملي مولار من كل من الأحماض الأمينية الطبيعية الثلاثة التالية - التربتوفان والفينيل ألانين والتيروزين. |
| 100 ملي مولار أدينين ثلاثي الفوسفات (ATP) | سيجما | A3377 | النيوكليوتيدات ومصدر الطاقة. |
| 50 ملي مولار غوانيدين ثلاثي الفوسفات (GTP) | سيجما | G8877 | النيوكليوتيدات ومصدر الطاقة. |
| 100 ملي مولار يوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP) ACROS | ORGANICS | 226310010 | مضافات النيوكليوتيدات. |
| 100 ملي مولار إيزوبروبيل & بيتا ؛ -D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | تحريض تعبير الجينات. |
| 2 م السكروز | جي تي بيكر | 1933078 | توليد تدرج الكثافة. |
| 2 م جلوكوز | سيجما | 16301 | توليد تدرج كثافة. |
| H2O مياه فائقة النقاء (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase خال |
| من S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared في الخطوة 1. مصدر النسخ & مكونات الترجمة. تخزين في -80 & deg; ج, ذوبان الجليد على الجليد المحطم قبل الاستخدام مباشرة. |
| مخزون بلازميد الحمض النووي المفضل | _ | _ | يحتوي على تسلسل البروتين المطلوب. تحت T7 promotor |
| D. المعدات المطلوبة للخطوة 4 (تحضير الخلايا الاصطناعية) < / قوي > | |||
| شاكر حاضنة الأرضية أو Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | حاضنة شاكر المختبر 450x450mm ، 400 دورة في الدقيقة ، 70 درجة ؛ C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | خلاط | |
| حراري الطرد المركزي | الحراري | العلمي 75004270 | (75003629) - TX-400 4 × 400 مل دلو متأرجح دوار. مناسب للأنابيب بحجم 15 مل. يفضل أن تكون الدلاء المتأرجحة. يجب أن تمكن ما لا يقل عن 1000 × g. المبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية. |
| جهاز طرد مركزي للطاولة | 75002420 علمي حراري | (75003424) - دوار 24 × 1.5 / 2.0 مل مع ClickSeal. مناسب لقوارير Eppendorf. مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية. | |
| خلاط دوامة | الصناعات العلمية | SI-0256 | |
| دلو الثلج المجروش | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 مل قوارير زجاجية برغي العنق | CSI الابتكارات التحليلية | VT009M-1232 | |
| بلاستيكية معقمة 15 مل | أنابيب بلاستيكية | 339651 | |
| 1.5 مل أنابيب بلاستيكية | Eppendorf | 30120086 | |
| أطراف ماصة معقمة | Corning | معقمة بواسطة الأوتوكلاف. |
المراجع
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Procee....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
