مقالة منهجية

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

DOI:

10.3791/60829

⸱

أبريل 27, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول الطريقة والمواد والمعدات والخطوات اللازمة لإعداد الحمض النووي الريبي والبروتين يُنتج الخلايا الاصطناعية من أسفل إلى أعلى. تحتوي المقصورة المائية الداخلية للخلايا الاصطناعية على تحلل اتبكي S30 مغلف داخل طبقة ثنائية من الدهون (أي الليبوزومات المستقرة) ، وذلك باستخدام طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نهج التجميع من أسفل إلى أعلى لبناء الخلايا الاصطناعية هو أداة فعالة لعزل والتحقيق في العمليات الخلوية في بيئة تحاكي الخلية. وعلاوة على ذلك، أظهر تطوير أنظمة التعبير الخالية من الخلايا القدرة على إعادة إنتاج البروتين والنسخ وعمليات الترجمة (DNA→RNA→protein) بطريقة خاضعة للرقابة، مما يسخّر البيولوجيا التركيبية. هنا نصف بروتوكول لإعداد نظام التعبير خالية من الخلايا، بما في ذلك إنتاج تحلل البكتيريا قوية وتغليف هذا تحلل داخل الغنية بالدهون الغنية بالدهون الحويصلات يونيلاميلار (GUVs) (أي liposomes مستقرة)، لتشكيل الخلايا الاصطناعية. ويصف البروتوكول طرق إعداد مكونات الخلايا الاصطناعية بما في ذلك إنتاج الخلايا البكتيرية النشطة، يليها إعداد مفصل للخلايا الاصطناعية خطوة بخطوة على أساس طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت. هذه تسهل إنتاج الملايين من الخلايا الاصطناعية بطريقة بسيطة وبأسعار معقولة مع براعة عالية لإنتاج أنواع مختلفة من البروتينات. يمكن استخدام الخلايا الاصطناعية التي تم الحصول عليها للتحقيق في إنتاج البروتين / الحمض النووي الريبي والنشاط في بيئة معزولة ، في تطور موجه ، وكذلك كمنصة تسليم الأدوية الخاضعة للرقابة لإنتاج البروتينات العلاجية عند الطلب داخل الجسم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الاصطناعية هي جزيئات تشبه الخلايا الاصطناعية ، تحاكي وظيفة واحدة أو متعددة للخلية الحية ، مثل القدرة على الانقسام ، وتشكيل تفاعلات الغشاء ، وتوليف البروتينات استنادًا إلى رمز وراثي1،2،3. تمتلك الخلايا الاصطناعية التي تُغلف أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) وحدات عالية بسبب قدرتها على إنتاج بروتينات مختلفة وتسلسلات الحمض النووي الريبي بعد التعديلات في قالب الحمض النووي. تقديم بديل جذاب للنهج الحالية لإنتاج البروتين، وتستند أنظمة CFPS على تحلل الخلايا، والمكونات النقية، أو المكونات الاصطناعية وتشمل جميع آلات النسخ والترجمة اللازمة لتخليق البروتين مثل الريبوسوم، البوليميراز الحمض النووي الريبي، الأحماض الأمينية ومصادر الطاقة (على سبيل المثال، 3-phosphoglycerate والغدينين ثلاثي الفوسفات)4،,5،,6،,7،,8،,9. تغليف نظام CFPS داخل الحويصلات الدهنية تمكن من إنتاج بسيط وفعال من البروتينات دون الاعتماد على الخلية الحية10. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا المنبر تخليق الببتيدات التي قد تتحلل داخل الخلايا الطبيعية، وإنتاج البروتينات السامة للخلايا الحية، وتعديل البروتينات مع الأحماض الأمينية غير الطبيعية11،12. وقد استخدمت الخلايا الاصطناعية كنموذج لأغراض البحث التحقيق في الحد الأدنى من مكونات الخلية المطلوبة لتمكين الحياة الخلوية من منظور تطوري1,13. كما استخدمت الخلايا الاصطناعية لبناء وتنفيذ الدائرة الوراثية وكنماذج للتطور الموجه14،15،16. وقد ركزت دراسات أخرى على قدرة الخلايا الاصطناعية على تقليد النشاط البيولوجي للخلايا الطبيعية، تهدف إلى استبدال الخلايا الطبيعية التالفة، مثل خلايا بيتا في المرضى الذين يعانون من مرض السكري17. وعلاوة على ذلك، فإن قدرة هذه الخلايا الاصطناعية CFPS تغليف لإنتاج مجموعة متنوعة من البروتينات العلاجية يوضح قدرتها على أن تدمج في الاستخدام السريري18.

هنا نصف بروتوكول المختبر من أسفل إلى أعلى على نطاق(الشكل 1)لإنتاج الحمض النووي الريبي والخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين على أساس نظام CFPS مغلفة في الحويصلات الدهنية. وهذا يدل على الاستخدام المحتمل لمنصات الخلايا الاصطناعية كأنظمة جديدة لتوصيل الأدوية لإنتاج المخدرات البروتينية العلاجية في الجسم الحي19في الموقع. وقد بحثت الدراسات السابقة الأمثل من رد فعل CFPS وعمليات إعداد الخلية lysate4،8،20. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق العديد من التقنيات لإعداد الدهون بحجم الخلية، مثل أساليب تثبيت قطرات الدم الدقيقة والبوليمر21،22،23، والتي تختلف أيضًا في تكوين الدهون الدهنية24،25،26. في البروتوكول المعروض ، يتم إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت ويتم عملية التغليف في درجات حرارة منخفضة (<4 °C)5،10،24،27،28. وقد وجد أن هذه الظروف المعتدلة مواتية للاحتفاظ بالسلامة الحيوية الوظيفية للآلات الجزيئية ، وهي الريبوسوم والبروتينات27،29،30. يتكون تكوين الدهون من الجسيمات من كل من الكوليسترول و1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). تم العثور على الأول في جميع أغشية خلايا الثدييات وهو ضروري للاستقرار والصلابة والحد من نفاذية الغشاء ، ويحاكي هذا الأخير تكوين فوسفوليبيد الثدييات11،13. يتم استخراج النسخ الخلوي والآلات الجزيئية الترجمة من سلالة BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) ، والتي يتم تحويلها مع pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase لزيادة قوة CFPS وتخليق البروتين. وقد استخدم هذا النظام لإنتاج البروتينات التشخيصية والعلاجية، مع الأوزان الجزيئية تصل إلى 66 كيلو في المختبر وفي الجسم الحي19،,31. يوفر البروتوكول التالي طريقة بسيطة وفعالة لإنتاج نظام الخلايا الاصطناعية ، والتي يمكن أن تعالج مجموعة واسعة من الأسئلة الأساسية المرتبطة بتخليق البروتين في الطبيعة ويمكن استخدامها أيضًا في تطبيقات تسليم الأدوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم تقديم توضيح بروتوكول إنتاج الخلايا الاصطناعية الكاملة في الشكل 1. وفقا لاحتياجات المستخدم، يمكن أيضا أن يتم التعبير البروتين (القسم 3.2) وتشكيل الخلايا الاصطناعية (القسم 4) أجزاء من البروتوكول بشكل مستقل (مع بعض التعديلات).

1. إعداد S30-T7 lysate

  1. لوحة متتالية والقولونية BL21 (DE3) البكتيريا التي تحولت مع T7 RNA polymerase التعبير عن pAR1219 plasmid على لوحة LB-agar تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين للحصول على مستعمرات واحدة.
  2. إعداد حل بداية: Inoculate مستعمرة واحدة إلى 5 مل من LB-media تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين في قارورة إرلينماير 100 مل وتنمو بين عشية وضحاها باستخدام شاكر حاضنة الكلمة في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. إعداد التكرارات.
  3. Inoculate كل 5 مل بداية بشكل منفصل في 500 مل من وسائل الإعلام السل تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين في قارورة 2 لتر Erlenmeyer مع يحير وتنمو باستخدام شاكر حاضنة الكلمة في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية حتى تصل OD600 من 0.8-1. مراقبة دوري باستخدام مطياف.
  4. إضافة 2-3 مل من 100 mM مخزون IPTG (للوصول إلى 0.4 - 0.6 mM) لتحريض T7 RNA polymerase التعبير والاستمرار في زراعة الثقافة حتى تصل إلى OD600☆4.
  5. نقل المحلول من كل قارورة إرلنماير إلى أنبوبين معقمين من نوع 250 مل.
  6. الطرد المركزي لكل من7000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل supernatant.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين بيليه البكتيري ة عند -20 درجة مئوية لبضعة أيام قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.
  7. إعادة تعليق كل بيليه في 250 مل من الباردة (4 درجات مئوية) S30 lysate عازلة والطرد المركزي في 7000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم استخدام المخزن المؤقت S30 lysate للحفاظ على استقرار البروتين بعد إجراء تحليل الخلايا باستخدام المتجانس في الخطوة 1.9. ومن هذه الخطوة إلى الأمام، ينبغي تنفيذ جميع الخطوات حتى 1.12 على التوالي وبسرعة.
    ملاحظة: قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تبريد النصائح وقوارير 1.5 ملليلتر قبل الانتقال إلى الخطوة التالية التي ستكون ضرورية لتخزين الليسات
  8. تجاهل supernatant وإعادة تعليق جميع الكريات معا في 15 مل من الباردة S30 lysate المخزن المؤقت. تصفية التعليق باستخدام وسادة الشاش.
    ملاحظة: 15ml من الحل يرجع إلى حجم المتجانس دقيقة. وينبغي أن يلاحظ أن تركيز البكتيريا مهم أيضا.
  9. التجانس عند ضغط عمل قدره 15,000 psi ، مع ضغط هواء من 4 بار (تمريرتين) لكسر الخلايا. تجنب تخفيف المحلول لزيادة التركيز والفعالية.
  10. إضافة 100 ميكرولتر من 0.1 M DTT (تنبيه) لكل 10 مل من التعليق المتجانس.
  11. طرد مركزي التعليق عند 24,700 × ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  12. تنفيذ الخطوة التالية بسرعة للحفاظ على نشاط lysate: تقسيم supernatant واحدا تلو الآخر إلى 200 μL aliquots في قارورة 1.5 مل تبريد مسبق وفورا المفاجئة تجميدها مع النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام.
    تنبيه: يتم تصنيف DTT على أنها مهيجة وضارة وبالتالي يجب التعامل معها بعناية.

2. إعداد الدهون في محلول الزيت

  1. إذابة POPC والكوليسترول في الكلوروفورم (تنبيه) بشكل منفصل ، كل إلى تركيز نهائي قدره 100 ملغ / مل. دوامة كل قارورة على حدة.
    1. الجمع بين المكونات في قارورة زجاجية 2mL: إضافة 50 ميكرولتر من POPC في الكلوروفورم، 50 ميكرولتر من الكوليسترول في الكلوروفورم و 500 ميكرولتر من الزيوت المعدنية. وبالنسبة لـ 100 ميكرولتر من الخلايا الاصطناعية، يلزم وجود قنينتين من الدهون في الزيت.
    2. دوامة، ثم الحرارة لحوالي 1 ساعة في 80 درجة مئوية في غطاء محرك السيارة الكيميائية لتبخر الكلوروفورم. تأكد من حدوث التبخر الكامل باتباع الوقت / الشروط المحددة ومراقبة حجم الحل.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول الدهون في الزيت الناتج في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين. لتحسين النتائج، فمن المستحسن استخدام إعداد جديد قبل كل تجربة. يمكن تغيير نسب الدهون والكوليسترول وفقا لتكوين الغشاء المطلوب. تركيز عالية من الكوليسترول يمكن أن يؤدي إلى تشكيل المجاميع في حل الخلية الاصطناعية النهائية.
      تنبيه: يتم تصنيف الكلوروفورم على أنه مهيج وضار وبالتالي يجب علاجه بعناية وفي المناطق التي يتم استخراج الأبخرة فيها.

3. الاستعدادات من الحلول الخارجية، ما قبل الداخلية والتغذية

  1. إعداد حلول الأسهم
    1. إعداد حلول الأسهم المدرجة في الجدول 2 باستخدام المياه فائقة النقاء (UPW).
      ملاحظة: يجب إعداد حلول المخزون مسبقًا وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي. الكاشف 7 يميل إلى تشكيل المجاميع. التدفئة إلى 37 درجة مئوية سوف تقلل من التجميع. لن يؤثر التجميع الطفيف على رد الفعل بشكل كبير. محلول كاشف 8 هو حليبي وتعكر.
  2. الحل الخارجي
    1. حل الجلوكوز في DNase / RNase خالية H2O إلى تركيز نهائي من 200 mM.
    2. ل100 ميكرولتر من المحلول الداخلي، قم بإعداد 1.6 مل من المحلول الخارجي.
  3. حل ما قبل الداخلية
    1. إضافة الكواشف 1-14 وفقا للكميات والتركيز المذكورة في الجدول 2. على سبيل المثال، بالنسبة لحجم الخلية الاصطناعية النهائي البالغ 100 ميكرولتر، قم بإعداد 100 ميكرولتر من المحلول الداخلي.
      ملاحظة: يجب إضافة UPW لإكمال وحدة التخزين المطلوبة النهائية. في هذه المرحلة، يمكن تخزين الخليط في 4 درجة مئوية لبضع ساعات.
  4. محلول التغذية
    1. إضافة جميع الكواشف وفقا للكميات والتركيز المدرجة في الجدول 3.
      ملاحظة: استخدام نسبة 1:1 من محلول التغذية: الحل الداخلي. لحجم الخلية الاصطناعية النهائي من 100 ميكرولتر، وإعداد 100 ميكرولتر من محلول التغذية. فمن المستحسن لإعداد حجم زائد صغير من الخارجي والداخلي والتغذية الحل.

4- إعداد الخلايا الاصطناعية

ملاحظة: يتم تعديل المجلدات التالية لإعداد 100 ميكرولتر من الخلايا الاصطناعية.

  1. الخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين
    1. في أنبوب 15 مل، ضع 12 مل من الحل الخارجي وأضف ببطء، على أعلى طبقة، 500 ميكرولتر من الدهون في محلول الزيت. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    2. لوضع اللمسات الأخيرة على إعداد الحل الداخلي: اخلطي مكونات الحل الداخلي على الجليد المطحون إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر عن طريق إذابة وإضافة S30-T7 Lysate (كاشف 15) والحمض النووي البلازميد (كاشف 16) إلى الخليط المخزن.
    3. إلى الثانية 2 مل قارورة زجاجية مع 500 ميكرولتر من الدهون في محلول النفط، إضافة 100 ميكرولتر من الحل الداخلي. بيزيت صعودا وهبوطا بقوة لمدة 1 دقيقة ودوامة لمدة دقيقة أخرى على المستوى الخامس.
      1. الاحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد المسحوق وإضافة ببطء المستحلب الناتج على رأس مرحلة النفط في أنبوب 15 مل (من 4.1.1).
    4. الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة عند 100 × غرام و 4 درجات مئوية ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة عند 400 × غرام و 4 درجات مئوية. بحلول نهاية الطرد المركزي ، يجب ملاحظة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
      ملاحظة: يُفضل استخدام دوار الطرد المركزي المتأرجح للدلو هنا للحصول على تغطية أفضل لطبقة ثانية من الدهون أثناء مرور قطرات الماء في الزيت عبر الطور البيني. في حالة عدم وجود بيليه ملحوظ ، يمكن زيادة سرعة الطرد المركزي إلى 1000 × ز. وإلا، راجع قسم المناقشة الذي يشير إلى الخطورة المحددة للحل الخارجي.
    5. استخراج بيليه.
      1. إزالة طبقة الزيت الزائدة.
      2. استخدم طرف ماصة مشذب محملًا بما يقرب من 400 ميكرولتر من المحلول الخارجي لاستخراج البيليه. الافراج عن الحل الخارجي أثناء مرورها من خلال مرحلة النفط من أجل جمع فقط بيليه في المرحلة المائية.
        1. مسح الطرف بعد استخراج بيليه لتجنب نقل بقايا النفط ونقل بيليه إلى أنبوب 1.5 مل نظيفة.
    6. الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة عند 1000 × ز و 4 درجات مئوية ، قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من محلول التغذية (نسبة 1:1 من حلول التغذية الداخلية).
      ملاحظة: يمكن استخدام دوار طرد مركزي بزاوية ثابتة هنا أيضًا.
    7. للتعبير عن البروتين، واحتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية دون اهتزاز.
      ملاحظة: يختلف وقت الحضانة الأمثل بين البروتينات المختلفة.
    8. تقييم كمية البروتين المنتجة باستخدام طريقة مناسبة وفقا لخصائص البروتين المستهدفة.
  2. مجموعات التحكم الموصى بها
    1. الحل الداخلي وتأكيد النشاط المنحل
      1. إعداد حل داخلي كامل (مع الحمض النووي وS30-T7 lysate).
      2. احتضان رد الفعل أعلاه على الفور باستخدام شاكر حاضنة الكلمة في 250 دورة في الدقيقة أو ثيرمالخلاط في 1200 دورة في الدقيقة، في درجة حرارة ثابتة من 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
        ملاحظة: ضبط وقت الحضانة لتتناسب مع وقت حضانة الخلايا الاصطناعية.
    2. الخلايا الاصطناعية
      1. مجموعة التحكم السلبي: قم بإعداد البروتوكول المقدم في 4.1 مع الحل الداخلي بدون الحمض النووي.
      2. التحكم الإيجابي: قم بإعداد البروتوكول المقدم في 4.1 مع حل داخلي يحتوي على ترميز بلازميد T7 لجين مراسل.
        ملاحظة: أضف مجموعة تحكم إيجابية تتكون من جين مراسل، مثل sfGFP، إلى جانب مجموعات الاختبار لضمان خطوة كفاءة التغليف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم بروتوكوللإعداد الخلايا الاصطناعية عن طريق تغليف نظام S30-T7 CFPS على أساس BL21 E. القولونية داخل الحويصلات الدهنية. ويرد في الشكل 2وصف تخطيطي لعملية الإعداد يتضمن صورة لكل مرحلة . يعتمد نجاح عملية إعداد الخلايا الاصطناعية على الأداء المناسب لكل مرحلة ويتأثر بمعلمات مختلفة. وينبغي تعديل البروتوكول لاستيعاب إنتاج بروتين معين.

تم إدخال Plasmids التعبير عن نموذج البروتين فائقة المجلد البروتين الفلورسنت الأخضر (sfGFP) ورينيلا Luciferase تحت T...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة وبأسعار معقولة لإنتاج كميات كبيرة من الخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين. تعتمد غلة الخلايا النشطة على التنفيذ الدقيق والدقيق للبروتوكول مع التركيز على العديد من الخطوات الحاسمة. في قسم إعداد الليكل من هذه الطريقة ، من الضروري الوصول إلى كثافة البكتيريا المناسبة قبل تحليل الخلايا لتحقيق كمية كافية من البروتينات في الانزلات البكتيري. ثانيا، يجب أن يتم إجراء عملية الانزل عند 4 درجة مئوية وتجمد الليسات بسرعة مع النيتروجين السائل للحفاظ على نشاط البروتين. وعلاوة على ذلك، في هذا البروتوكول استخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل ERC-STG-2015-680242.

ويعترف المؤلفون أيضا بدعم مركز تكنيون المتكامل للسرطان( TICC)؛ معهد راسل بيري للتكنولوجيا النانوية؛ مركز لوري لوكي متعدد التخصصات لعلوم الحياة والهندسة؛ وزارة الاقتصاد الإسرائيلية لمنحة كامين (52752)؛ وزارة تكنولوجيا العلوم والفضاء الإسرائيلية - مكتب كبير العلماء (3-11878)؛ المؤسسة الإسرائيلية للعلوم (1778/13، 1421/17)؛ الجمعية الإسرائيلية للسرطان (2015-0116)؛ المؤسسة الألمانية الإسرائيلية للبحث العلمي والتطوير من أجل منحة من شركة GIF Young (I-2328-1139.10/2012)؛ برنامج الاتحاد الأوروبي FP-7 IRG لمنحة الاندماج الوظيفي (908049)؛ منحة مركز أبحاث فوسفوليبيد؛ (أ) مؤسسة روزنبلات لبحوث السرطان، منحة مؤسسة الأسرة في مالات؛ ومؤسسة عائلة (أونغر) أ. شرودر يعترف زمالتي ألون وتاوب. O. Adir يعترف زمالات شيرمان وغوتويرث. ز. تشين يعترف زمالة شيرمان. ن. كرينسكي يعترف البارونة أريان دي روتشيلد برنامج الدكتوراه النسائية من مؤسسة روتشيلد قيصرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>أ. الكواشف المطلوبة للخطوة 1 (تحضير المحللة S30-T7)
E.coli BL21 (DE3) NEBC2527الإشريكية القولونية BL21 (DE3).
pAR1219SigmaT2076ناقل TargeTron للتحول.
محلول مخزون 50 مجم / مل أمبيسلينسيجماA9518مخزن عند -20 درجة مئوية.
10 جم / لتر باكتو تريبتونBD Bioscience  ؛211705لتحضير لوحة أجار لوريا بيرتاني (LB) (1.5٪).
10 جم / لتر كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)Bio-Lab19030591
5 جم / لتر مستخلص الخميرة البكتوBD Bioscience   ؛212750
15 جم / لتر أجار أجار منقىميرك1.01614.5007
50 & مايكرو ؛ جم / مل أمبيسلينسيجماA9518
10 جم / لتر باكتو تريبتونBD Bioscience   ؛211705لتحضير وسائط لوريا بيرتاني (LB) (20 مل).
10 جم / لتر كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)Bio-Lab19030591
5 جم / لتر مستخلص الخميرة البكتوBD Bioscience   ؛212750
50 & جم / مل أمبيسلينسيجماA9518
12 جم / لتر باكتو تريبتونBD Bioscience   ؛211705لتحضير وسائط المرق الرائع (TB) (1 لتر).
24 جم / لتر مستخلص الخميرة BDBioscience   ؛212750
4٪ (حجم / حجم) مختبر حيوي لا مائي من الجلسرين7120501
2.32 جم / لتر K2HPO4كيميائي طيفP1383
12.54 جم / لتر KH2PO4كيميائي الطيفP1380
  ؛ 50 وميكرو ؛ جم / مل أمبيسلينسيجماA9518
محلول مخزون من 100 ملي مولار من الأيزوبروبيل بيتا ؛ -D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG)   ؛INALCOINA-1758-1400تمت تصفيته باستخدام 0.2 & micro ؛ م مرشح حقنة PVDF محب للماء.
محلول مخزون 0.1 M dithiothreitol (DTT)   ؛TCID1071تمت تصفيته باستخدام 0.2 & micro ؛ م مرشح حقنة PVDF محب للماء.
10 ملي مولار ثلاثية الأسيتات عند الرقم الهيدروجيني = 7.4سيجماT1503S30 محلول عازلة (1.5 لتر)
14 ملي أسيتات المغنيسيومميرك1.05819.0250
60 ملي أسيتات البوتاسيومكارلو إربا470147
1 ملي متر DTTTCID1071
0.5 مل / لتر 2-mercaptoethanolSigmaM6250
المعدات المطلوبة للخطوة 1< / قوي>
100 مل قوارير Erlenmeyer معقمةThermo Scientific50-154-28462 قارورة
2 لتر قوارير Erlenmeyer معقمة مع حواجزKIMAX-KIMBLE256302 قوارير
شاكر حاضنة الأرضيةMRCTOU-120-2حاضنة شاكر المختبر 450x450mm ، 400 دورة في الدقيقة ، 70 درجة ؛ C
الطرد المركزيالحرارية العلمية75004270(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX دوار بزاوية ثابتة.
يجب أن تمكن ما لا يقل عن 13,000 × g.  ؛       * مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
الخالط عالي الضغطAVESTINEmulsiFlex-C3مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
-80 < سوب > < / سوب> ج فريزرSO-LOWU85-18
بلاستيكية معقمة 1.5 ملEppendorf30120086يفضل تبريدها مسبقا إلى -20 درجة مئوية.
مقياس الطيفالضوئي TECANIN-MNANOInfinite M200 pro
96 جيدا لوحة شفافة167008حراري علمي
أسطوانة متدرجةمعقمة أنابيب أجهزة
Eppendorf30120086يفضل أن يتم تبريدها مسبقا إلى -20 درجة مئوية.
أطراف ماصة معقمةكورنينجيفضل تبريدها مسبقا إلى -20 درجة مئوية.
دلو الثلج المجروشBel-ArtM18848-4001
خزان نيتروجين سائل صغيرNALGENE4150-4000
B. الكواشف المطلوبة للخطوة 3 (الدهون في تحضير محلول الزيت): < / قوي>
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Lipoid556400مسحوق
الكوليسترولSigmaC8667مسحوق
الكلوروفورمBio-Lab3082301
الزيوت المعدنيةSigmaM5904الزيت الخفيف
< قوي > المعدات المطلوبة للخطوة 2 < / قوي>
خلاط دوامةالصناعات العلميةSI-0256
كتلة التدفئةTECHNEFDB03ADيسخن مسبقا إلى 80 درجة مئوية
يجب أن يتيح التحكم في درجة الحرارة.
2 مل قوارير زجاجية برغي برغيCSI Analytical InnovationsVT009M-1232على نطاق أوسع ، استخدم 50 مل من الصقور وتبخر الكلوروفورم باستخدام المبخر الدوار.
9 مم غطاء لولبيCSI الابتكارات التحليليةC395R-09LC
strong>C. الكواشف المطلوبة للخطوة 3 (مخاليط التفاعل الداخلية والتغذية): < / قوي>
طيفHEPESH10891 M HEPES-KOH (الرقم الهيدروجيني = 8) - عازلة الأس الهيدروجيني
هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)Frutarom55290
1 M أسيتات المغنيسيومميرك1.05819.0250مساعد ومثبت الشحنة السالبة.
1 م أسيتات البوتاسيومكارلو إربا470147مثبت الشحنة السالبة.
5.2 M أسيتات الأمونيومMerck1.01116.1000يستقر الشحنة السالبة.
50٪ (وزن / حجم) بولي إيثيلين جلايكول 6000 (PEG)ميرك8.07491.1000يزيد من تركيز الجزيئات الكبيرة.
0.5 م 3-فوسفوغليسرات (3-PGA)سيجماP8877مصدر طاقة ثانوي.
50 ملي مولار خليط الأحماض الأمينية ISigmaLAA21-1KTمضافات الأحماض الأمينية
يحتوي على: 50 ملي مولار من كل من الأحماض الأمينية الطبيعية ال 17   التالية - ألانين ، أرجينين ، أسباراجين ، حمض الأسبارتيك ، السيستين ، الجلوتامين ، حمض الجلوتاميك ، الجلايسين ، الهيستيدين ، الأيزولوسين ، الليوسين ، ليسين ، الميثيونين ، البرولين ، السيرين ، ثريونين ، والفالين.
50 ملي مولار خليط الأحماض الأمينية IISigmaLAA21-1KTمضاف للأحماض الأمينية
يحتوي على: 50 ملي مولار من كل من الأحماض الأمينية الطبيعية الثلاثة التالية - التربتوفان والفينيل ألانين والتيروزين.
100 ملي مولار أدينين ثلاثي الفوسفات (ATP)سيجماA3377النيوكليوتيدات ومصدر الطاقة.
50 ملي مولار غوانيدين ثلاثي الفوسفات (GTP)سيجماG8877النيوكليوتيدات ومصدر الطاقة.
100 ملي مولار يوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP) ACROSORGANICS226310010مضافات النيوكليوتيدات.
100 ملي مولار إيزوبروبيل & بيتا ؛ -D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG)INALCOINA-1758-1400تحريض تعبير الجينات.
2 م السكروزجي تي بيكر1933078توليد تدرج الكثافة.
2 م جلوكوزسيجما16301توليد تدرج كثافة.
H2O مياه فائقة النقاء (UPW)Bio-Lab2321777500DNase & RNase خال
من S30-T7 lysate__Prepared في الخطوة 1.                                                                                                                                              مصدر النسخ & مكونات الترجمة.
تخزين في -80 & deg; ج, ذوبان الجليد على الجليد المحطم قبل الاستخدام مباشرة.
مخزون بلازميد الحمض النووي المفضل__يحتوي على تسلسل البروتين المطلوب.
تحت T7 promotor
D. المعدات المطلوبة للخطوة 4 (تحضير الخلايا الاصطناعية) < / قوي >
شاكر حاضنة الأرضية أو ThermomixerMRCTOU-120-2حاضنة شاكر المختبر 450x450mm ، 400 دورة في الدقيقة ، 70 درجة ؛ C
PHMT Grant Bio PSC18خلاط
حراري الطرد المركزيالحراريالعلمي 75004270(75003629) - TX-400 4 × 400 مل دلو متأرجح دوار.
مناسب للأنابيب بحجم 15 مل.
يفضل أن تكون الدلاء المتأرجحة.
يجب أن تمكن ما لا يقل عن 1000 × g.
المبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
جهاز طرد مركزي للطاولة75002420 علمي حراري(75003424) - دوار 24 × 1.5 / 2.0 مل مع ClickSeal.
مناسب لقوارير Eppendorf.
مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
خلاط دوامةالصناعات العلميةSI-0256
دلو الثلج المجروشBel-ArtM18848-4001
2 مل قوارير زجاجية برغي العنقCSI الابتكارات التحليليةVT009M-1232
بلاستيكية معقمة 15 ملأنابيب بلاستيكية339651
1.5 مل أنابيب بلاستيكيةEppendorf30120086
أطراف ماصة معقمةCorningمعقمة بواسطة الأوتوكلاف.
أنابيب الطرد المركزي المعقمة < عامل أنابيب معقمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
  2. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
  3. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  4. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  5. Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
  6. Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
  7. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  8. Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
  9. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  10. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  11. He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
  12. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  13. Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
  14. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  15. Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
  16. Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
  17. Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
  18. Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
  19. Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163(2018).
  20. Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
  21. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
  22. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  23. Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
  24. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578(2014).
  25. Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
  26. Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
  27. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  28. Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
  29. Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  31. Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137(2016).
  32. Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79(2006).
  33. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  34. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  35. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).
  36. Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167(2017).
  37. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة