يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومتماسكة لتشفير جين من الاهتمام بشكل عابر باستخدام modRNA بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تسليم مرنا معدلة في نموذج الماوس احتشاء مايدق
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
احتشاء عضلة القلب (MI) هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في العالم الغربي. في العقد الماضي، أصبح العلاج الجيني خيار علاج واعد لأمراض القلب، نظرا لكفاءته وآثاره العلاجية الاستثنائية. في محاولة لإصلاح الأنسجة التالفة بعد MI، استخدمت دراسات مختلفة العلاج الجيني القائم على الحمض النووي أو الفيروسية ولكن واجهت عقبات كبيرة بسبب التعبير الفقير وغير المنضبط للجينات المسلمة، وذمة، وعدم انتظام ضربات القلب، وضمور القلب. الاصطناعية تعديل مرنا (MODRNA) يقدم نهج العلاج الجيني رواية التي تقدم عالية, عابرة, آمنة, غير مناعة, والسيطرة على تسليم مرنا إلى أنسجة القلب دون أي خطر من التكامل الجينومي. بسبب هذه الخصائص الرائعة جنبا إلى جنب مع الدوائية على شكل جرس في القلب، أصبحت وزارة الدفاع الأميركية نهج جذاب لعلاج أمراض القلب. ومع ذلك، لزيادة فعاليتها في الجسم الحي، يجب اتباع طريقة تسليم متسقة وموثوقة. وبالتالي، لتحقيق أقصى قدر من كفاءة التسليم MODRNA والاتساق العائد في استخدام MODRNA في التطبيقات في مجال المعلومات الحية، يتم تقديم طريقة الأمثل لإعداد وتسليم حقن داخل القلب modRNA في نموذج MI ماوس. وهذا البروتوكول سيجعل من تسليم وزارة الدفاع الأمريكية أكثر سهولة للأبحاث الأساسية والترجمة.
المقدمة
العلاج الجيني هو أداة قوية تنطوي على تقديم الأحماض النووية لعلاج, علاج, أو الوقاية من الأمراض البشرية. على الرغم من التقدم المحرز في الأساليب التشخيصية والعلاجية لأمراض القلب، كان هناك نجاح محدود في توصيل الجينات في احتشاء عضلة القلب (MI) وفشل القلب (HF). كما واضحة كما يبدو عملية العلاج الجيني، بل هو نهج معقد بشكل ملحوظ بالنظر إلى العديد من العوامل التي تحتاج إلى تحسين قبل استخدام وسيلة تسليم معينة. يجب أن يكون ناقل التسليم الصحيح غير مناعيًا وفعالًا ومستقرًا داخل جسم الإنسان. وقد أدت الجهود المبذولة في هذا المجال إلى توليد نوعين من نظم الإيصال: الفيروسية أو غير الفيروسية. وقد أظهرت النظم الفيروسية المستخدمة على نطاق واسع، بما في ذلك نقل الجينات عن طريق الفيروس الغدي،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المبينة هنا من قبل كلية إيكان للطب في لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية في جبل سيناء.
1. توليفة من وزارة الدفاع
ملاحظة: يمكن الاطلاع على تفاصيل توليف MODRNA في كوندرات وآخرون13.
- طلب القوالب plasmid(جدول المواد)وتوليد منتج PCR نظيفة لاستخدامها كقالب مرنا.
- إعداد modRNAs عن طريق النسخ في المختبر مع مزيج ribonucleoside مخصصة من التالي (جدول المواد):T7 النسخ عدة، 6 mM المضادة للتآكل تناظري (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G، 75 mM guanosine ثلاثي الفوسفات، 75 mM أدينوسين ثلاثي الفوسفات، 75 mM cytidin....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تخدير الفئران التي يبلغ عمرها ثمانية إلى عشرة أسابيع باستخدام الأيزوفلوران والمخاتنة. بعد أن كان الحيوان تحت التخدير، تم حلق المنطقة الصدرية اليسرى وتعقيمها بالإيثانول، وتعرض القلب لأربطة LAD. تم انسداد الشريان التاجي الأيسر من قبل عقدة بحزم خياطة تحت الشريان (الرسم البياني الشكل 1A). بعد احتشاء ناجحة (المشار إليها من ابال الجدار الحر البطين الأيسر)، تم تسليم حقن مباشر من 100 ميكروغرام لوك أو كري MODRNA حل في عازلة سيترات السكروز مباشرة في عضلة القلب في ثلاثة مواقع مختلفة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد أظهرت العلاج الجيني إمكانات هائلة لدفع كبير في علاج أمراض القلب. ومع ذلك, الأدوات التقليدية المستخدمة في التجارب السريرية الأولية لعلاج HF أظهرت نجاحا محدودا وترتبط بآثار جانبية شديدة. الحمض النووي الريبي المعدل يقدم تسليم الجينات غير الفيروسية التي تكتسب شعبية باستمرار كأداة نقل الجينات في القلب. ModRNA لا يتطلب توطين النووية الجينات للترجمة، وبالتالي يوفر تعبير فعال وسريع من البروتين. وعلاوة على ذلك، بما أن الرنا لا يندمج في مستضيف الجينوم، فإن تسليم الجينات من قبل وزارة الدفاع يتخطى خطر الطفرات. ونتيجة لذلك، ونظرا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يعترف المؤلفان بـ آن أنو كوريان لمساعدتها في هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بدء أمراض القلب التي قدمت لمختبر زنجي وكذلك من قبل المعاهد القومية للصحة منحة R01 HL142768-01
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أدينوسين ثلاثي الفوسفات | Invitrogen | AMB13345 | مدرج في مجموعة Megascript |
| أنتاركتيكا فوسفاتيز | نيو إنجلاند Biolabs | M0289L | |
| التناظرية المضادة للانعكاس ، 30-O-Mem7G (50) ppp (50) G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| نظام التصوير Bioluminescense | Perkin Elmer | IVIS100 124262 نظام تصوير الجهاز المقترن بالشحن | |
| ضام حاد | FST | 18200-09 | |
| تروبنين القلب I | Abcam | 47003 | |
| سيتيدين ثلاثي الفوسفات | Invitrogen | AMB13345 | متضمن في مجموعة Megascript |
| نظام التخدير المزدوج | جهاز هارفارد | 75-2001 | |
| ملقط- Adson | FST | 91106-12 | |
| ملقط - Dumont # 7 | FST | 91197-00 | |
| جوانوزين ثلاثي الفوسفات | Invitrogen | AMB13345 | متضمن في مجموعة Megascript |
| طقم النسخ في المختبر | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| قنية التنبيب | جهاز | ||
| مجموعة Megaclear | الحياة | ||
| جهاز التنفس الصناعي للماوس | جهاز هارفارد | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle with stub sext مقص خياطة | FST | 12002-12 | |
| قوالب البلازميد | GeneArt ، Thermo Fisher Scientific | ||
| مقص تشريح حاد مدبب | FST | 14200-12 | |
| مجهر مجسم | خيوط Zeiss | ||
| Ethicon | Y433H | 5.00 | |
| خيوط | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| خيوط | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase إنزيم | Invitrogen | AMB13345 | مدرجة في محطة شريط مجموعة |
| MegascriptAligent | 4200 | ||
| طقم تنظيف النسخ | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 مرشحات الطرد المركزي 10k | Amicon UFC801096 |
المراجع
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
