مجسات البروتين الهندسية داخل الخلايا في خلايا الثدييات

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لهندسة مستشعر البروتين داخل الخلايا المشفر وراثيا. يكتشف الجهاز على وجه التحديد البروتينات المستهدفة من خلال الأجسام المضادة داخل الخلايا (الأجسام الداخلية) ويستجيب عن طريق تشغيل إخراج النسخ الجيني. تم بناء إطار عام لاستبدال الأجسام الداخلية بسرعة ، مما يتيح الكشف السريع عن أي بروتين مرغوب فيه ، دون تغيير البنية العامة.

الملخص

يمكن أن تعمل البروتينات كمؤشرات حيوية للحالات المرضية ، مثل الأمراض التنكسية العصبية أو الالتهابات أو متلازمات التمثيل الغذائي. قد تساعد هندسة الخلايا لاستشعار هذه المؤشرات الحيوية والاستجابة لها في فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض ، وكذلك في تطوير علاجات جديدة قائمة على الخلايا. بينما تم تطوير العديد من الأنظمة التي تكتشف البروتينات خارج الخلية ، كان هناك إطار معياري يمكن إعادة هندستته بسهولة لاستشعار البروتينات المختلفة داخل الخلايا مفقود.

هنا ، نصف بروتوكولا لتنفيذ منصة وراثية معيارية تستشعر البروتينات داخل الخلايا وتنشط استجابة خلوية معينة. يعمل الجهاز على الأجسام المضادة داخل الخلايا أو الببتيدات الصغيرة لاستشعار البروتين محل الاهتمام بخصوصية عالية ، مما يؤدي إلى تنشيط النسخ لجينات الإخراج ، من خلال وحدة التشغيل القائمة على البروتياز TEV (TEVp). TEVp هو بروتياز فيروسي يشق بشكل انتقائي الببتيدات القصيرة المتشابهة ويستخدم على نطاق واسع في التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية لتعامده العالي مع موقع الانقسام. على وجه التحديد ، قمنا بتصميم أجهزة تتعرف على المؤشرات الحيوية البروتينية للعدوى الفيروسية والأمراض الوراثية وتستجيب لها ، بما في ذلك هنتنغتين المتحور ، وبروتينات سيرين بروتياز NS3 ، وبروتينات Tat و Nef للكشف عن مرض هنتنغتون وفيروس التهاب الكبد C (HCV) وعدوى فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ، على التوالي. الأهم من ذلك ، يمكن تصميم النظام يدويا للنتيجة الوظيفية المرغوبة للمدخلات والمخرجات ، مثل قراءات الفلورسنت لأجهزة الاستشعار الحيوية ، أو تحفيز عرض المستضد للاستجابة المناعية ، أو بدء موت الخلايا المبرمج للقضاء على الخلايا غير الصحية.

المقدمة

تعد دراسة وتعديلات الاستجابات الخلوية عبر دوائر جينية هندسية يمكن التحكم فيها أهدافا رئيسية في البيولوجيا التركيبية^1،2،3 لتطوير أدوات مستقبلية ذات تطبيقات بيولوجية أو طبية ذات صلة في السرطان⁴ ، والالتهابات⁵ ، وأمراض التمثيل الغذائي⁶ ، وعلم المناعة⁷.

تتطلب إعادة برمجة وظائف الخلية استجابة لإشارات محددة تصميم واجهات ذكية تربط استشعار التغييرات الديناميكية خارج الخلية أو داخل الخلية (المدخلات) بالمعالجة النهائية ، مما يؤدي ....

البروتوكول

1. مبادئ التصميم للبناء واختبار جهاز الاستشعار المحرك

1. حدد البروتين الذي يثير الاهتمام.
   ملاحظة: لقد صممنا نظاما للبروتينات الموجودة في السيتوبلازم أو التنقل بين السيتوبلازم والمقصورات الأخرى.
2. حدد جسمين داخليين يربطان حواتم مختلفة من البروتين المستهدف. في دراستنا اخترنا البروتينات التي تم تطوير الأجسام الداخلية لها بالفعل^{واختبارها 28،29،30،31}. عندما لا تكون الأجسام الداخلية متوفرة ، يجب تطويرها حديثا.
   ملاحظة: يمكن أن يكون البديل للأجسام الداخلية هو الجزيئات الأخرى التي تتفاعل مع الب....

النتائج

بنية للكشف المعياري عن البروتين داخل الخلايا
كما هو موضح في الشكل 1 ، يتكون الجهاز من: 1) داخل الجسم 1 متصل بعلامة الفلورسنت المربوطة بالغشاء (mKate) وموقع انقسام TEVp (TCS) ، متبوعا بمنشط النسخ GAL4VP16 (TF) ؛ 2) داخل الجسم 2 منصهر مع البروتياز TEV (TEVp) ، حر في العصارة الخلوية ؛ 3) مروج اصطناعي يستجيب ل GAL4VP16 ، مما يؤدي إلى التعبير عن جين المراسل. يتم ضمان النمطية من خلال الأجسام الداخلية التي يمكن تغييرها بطريقة التوصيل والتشغيل لاستهداف أي بروتين مرغوب. أيضا ، يمك.......

المناقشة

حتى وقت قريب ، تم إجراء استجواب الخلايا بناء على البيئة داخل الخلايا باستخدام أنظمة تم تطويرها من جديد لأهداف محددة. يصف البروتوكول الحالي مثالا على أحدث نهج هندسة الخلايا لاستشعار البروتين وتشغيله في جهاز واحد ، والذي يمكن تكييفه بسرعة مع المؤشرات الحيوية الجديدة المرغوبة.

هذا النظام الرائد يستشعر البروتينات داخل الخلايا ويوفر مخرجات محددة لاكتشاف المرض أو تحييده. تتمثل ميزة هذه الفئة من الدوائر الجينية في النمطية التي توفرها الأجسام الداخلية وإمكانية استخدام.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
AlexaFluor 647 الفأر المضاد للإنسان HLA-A ، B ، C استنساخ الأجسام المضادة W6 / 32	Biolegend	311414	الأجسام المضادة
Annexin V	LifeTechnologies	A35122	علامة موت الخلايا المبرمج
Attractene	Qiagen	301005 كاشف	التعداء
BD Falcon Round-Bottom Tubes	BD Biosciences	352053	أنابيب FACS
Doxycycline	Clonetech	-	زراعة الخلايا: أدوية
Dulbecco's Eagle medium	Cellgro	10-013-CM	Cell Culture: Medium
Evos Cell Imaging	Technology	EVOS M5000	Imaging Systems ؛ المستنسخة الجزيئية المعدية
برنامج FACSDiva8	BD Biosciences	659523	برنامج FACS
سريع SYBR Green Master Mix	ThermoFisher Scientific	4385612	تفاعل qPCR
FBS (مصل بوفين الجنين)	ثقافة الخلايا Atlanta BIO	S11050	:
حياة نظام البوابة		المتوسطة -	بناء البلازميد
البوابة الذهبية نظام			للبلازميد
HEK 293FT	Invitrogen	R70007	ثقافة الخلايا:
نظام استنساخ التسريب	للخلايا Clonetech	638920	بناء البلازميد
كاشف JetPRIME	Polyplus التعداء	114-15	كاشف Transcfection
Jurkat Cells	ATCC	TIB-152	ثقافة الخلايا: الخلايا
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100ML	ثقافة الخلايا:
Lipofectamine LTX متوسط مع كاشف Plus	Thermo Fisher Scientific	15338030	كاشف التعداء
LSR Fortessa مقياس التدفق الخلوي (405 و 488 و 561 & thinsp ؛ ليزر نانومتر)	BD Biosciences	649225	مقياس التدفق الخلوي
MicroAmp لوحة تفاعل بصرية سريعة 96 بئر (0.1 & thinsp ؛ مل)	ThermoFisher Scientific	4346907	تفاعل qPCR
حياة نظام التعداء النيون		MPK10025	كاشف التعداء
الأحماض الأمينية غير الأساسية	HyClone	SH3023801	ثقافة الخلايا: متوسط
Opti-MEM I مخفضة مصل متوسط	العمر	تقنيات 31985070
تعداء البنسلين / الستربتومايسين	Sigma-Aldrich	P4458-100ML	زراعة الخلايا:
مجموعة النسخ العكسي Medium QuantiTect	Qiagen	205313	Rev Transcriptase Kit
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	طقم استخراج الحمض النووي الريبي
RPMI-1640	ATCC	ATCC 30 &sche; 2001	ثقافة الخلية: Medium
Shield	Clonetech	632189	زراعة الخلايا: المخدرات
SpheroTech RCP-30-5-A حبات	Spherotech	RCP-30- 5A-2	إعداد التعويض
StepOnePlus 7500 آلة سريعة	للأنظمة الحيوية التطبيقية	4351106	تفاعل qPCR

System Life تقنيات البناء الداخلي تقنيات وسط