Method Article

إنتاج ميكرووبوبي من الليسوبيد اتووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو

DOI:

10.3791/60907

⸱

March 3rd, 2020

 ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Queen's University Belfast

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم البروتوكول المعلمات المحسنة لإعداد الليبوزومات الحساسة للحرارة باستخدام جهاز ميكروميكس ميكروميكس الرنجة المتداخل. وهذا يسمح أيضا شارك في تغليف دوكسوروبيسين وindocyanine الخضراء في الليبوزومات والإفراج عن الإفراج عن الدوكسوروبيسين للرقابة / أثار المخدرات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح البروتوكول المقدم إعدادًا مستمرًا عالي الإنتاجية للدهون المنخفضة الحساسية لدرجة الحرارة (LTSLs) ، والقادرة على تحميل أدوية العلاج الكيميائي ، مثل دوكسوروبيسين (DOX). لتحقيق ذلك ، يتم حقن خليط الدهون الايثانولية ومحلول كبريتات الأمونيوم في جهاز ميكرومية عظم الرنجة (SHM) . يتم خلط الحلول بسرعة من قبل SHM ، مما يوفر بيئة مذيبة متجانسة للتجميع الذاتي للدهون. يتم أولاً تسيد الليبوزومات التي تم جمعها، ثم يتم رفعها لإزالة الإيثانول المتبقي. يتم إنشاء تدرج درجة الحموضة كبريتات الأمونيوم من خلال تبادل العازلة من الحل الخارجي باستخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. ثم يتم تحميل DOX عن بعد في الليبوزومات مع كفاءة تغليف عالية (> 80٪). الدهون التي تم الحصول عليها متجانسة في الحجم مع متوسط قطر Z من 100 نانومتر. فهي قادرة على إطلاق انفجار درجة الحرارة الناجمة عن DOX مغلفة في وجود ارتفاع الحرارة المعتدل (42 درجة مئوية). يمكن أيضا ً تحميل الإندوسياين الأخضر (ICG) في الليبوزومات لإطلاق DOX الذي يتم تشغيله بالليزر بالقرب من الأشعة تحت الحمراء. يضمن نهج microfluidic إعداد LTSLs عالي الإنتاجية والقابل للتكرار وقابلية التوسع.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صياغة LTSL هو منتج liposomal ذات الصلة سريريا التي تم تطويرها لتقديم المخدرات العلاج الكيميائي دوكسوروبيسين (DOX) ويسمح كفاءة انفجار إطلاق المخدرات في ارتفاع الحرارة خفيفة يمكن تحقيقها سريريا (T ☆ 41 درجة مئوية)1. تتكون تركيبة LTSL من 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), الليسوبيد 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidyl (MSPC كولين; M تقف على "أحادية") وPEGylated الدهون 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوإيثانولامين-N-[ميثوكسي (البولي إيثيلين جليكول)-2000] (DSPE-PEG2000). عند الوصول إلى درجة حرارة المرحلة الانتقالية (Tm - 41 درجة مئوية) ، يسهل الليسوبيد وDSPE-PEG2000 معًا تشكيل مسام الأغشية ، مما يؤدي إلى إطلاق انفجار الدواء2. إعداد LTSLs يستخدم في المقام الأول نهج السائبة من أعلى إلى أسفل، وهي ترطيب فيلم الدهون والبثق. يبقى تحديا لإعداد مجموعات كبيرة من الاستنساخ مع خصائص متطابقة وبكميات كافية للتطبيقات السريرية3.

Microfluidics هو تقنية الناشئة لإعداد الليبوزومات، وتقدم حجم الجسيمات النانوية tunable، والاستنساخ، وقابلية التوسع3. بمجرد تحسين معلمات التصنيع ، يمكن توسيع الإنتاجية عن طريق التوازي ، مع خصائص مطابقة لتلك التي أعدت على مقياس مقاعد البدلاء3،4،5. ميزة رئيسية من microfluidics على تقنيات السائبة التقليدية هو القدرة على التعامل مع أحجام السائل الصغيرة مع التحكم عالية في المكان والزمان من خلال تصغير، مما يسمح الأمثل أسرع، في حين تعمل بطريقة مستمرة وآلية6. إنتاج الليبوزومات مع الأجهزة microfluidic يتحقق من خلال نهج nanoprecipitation من أسفل إلى أعلى، وهو أكثر من الوقت وكفاءة الطاقة لأن عمليات التجانس مثل البثق وسونيكيشن غير ضرورية7. وعادة ما يختلط محلول عضوي (مثل الإيثانول) من الدهون (والحمولة الكارهة للماء) بغير مذيب غير قابل للامتزاج (مثل الماء والحمولة المائية). كما يمزج المذيبات العضوية مع غير المذيبات، يتم تقليل الذوبان للدهون. يصل تركيز الدهون في نهاية المطاف إلى تركيز حرج يتم فيه تشغيل عملية هطول الأمطار7. نانوراسب الدهون تنمو في نهاية المطاف في الحجم وقريبة من liposome. والعوامل الرئيسية التي تحكم حجم وتجانس الليبوزومات هي النسبة بين نسبة معدل التدفق غير المذيب ة والمذيبات (أي نسبة معدل التدفق المائية إلى العضوية؛ ونسبة العضوية ونسبة العضوية. FRR) وتجانس البيئة المذيبات خلال التجميع الذاتي للدهون في الليبوزومات8.

وبالتالي فإن خلط السوائل الفعالة في الموائع الدقيقة أمر ضروري لإعداد الليبوزومات المتجانسة ، وقد تم استخدام تصاميم مختلفة من الخلاطات في تطبيقات مختلفة9. يمثل الخلاط المجهري لعظم الرنجة (SHM) أحد الأجيال الجديدة من الخلاطات السلبية ، والتي تمكن من الإنتاجية العالية (في نطاق mL / min) مع عامل تخفيف منخفض. هذا هو متفوقة على أجهزة خلط الهيدروديناميكية microfluidic التقليدية8،10. وقد نقشSHM الأخاج الرنجة، والتي تخلط بسرعة السوائل عن طريق الإزالة الفوضوية9،11. يسمح مقياس الوقت القصير للخلط SHM (< 5 ms، أقل من مقياس وقت التجميع النموذجي من 10-100 مللي ثانية) بحدوث التجميع الذاتي للدهون في بيئة مذيبة متجانسة، مما ينتج جسيمات نانوية ذات توزيع حجم موحد3،12.

إعداد LTSLs مع microfluidics، ومع ذلك، ليست واضحة بالمقارنة مع تركيبات الدهون التقليدية بسبب عدم وجود الكوليسترول8،والتي بدونها ثنائيات الدهون عرضة للinterdigitation الناجم عن الإيثانول13،14،15. حتى الآن ، لم يكن تأثير الايثانول المتبقي يعرض خلال إنتاج microfluidic من الليبوزومات مفهومة جيدا. غالبية التركيبات المبلغ عنها هي بطبيعتها مقاومة للتوسيط (التي تحتوي على الكوليسترول أو الدهون غير المشبعة)16، والتي على عكس LTSLs على حد سواء المشبعة وخالية من الكوليسترول.

البروتوكول المعروض هنا يستخدم SHM لإعداد LTSLs لدرجة الحرارة التي أدت إلى إطلاق المخدرات التسليم. في الطريقة المعروضة ، تأكدنا من أن LTSLs المعدة microfluidic هي نانو الحجم (100 نانومتر) وموحدة (التشتت < 0.2) عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS). وعلاوة على ذلك، قمنا بتغليف DOX باستخدام طريقة تدرج كبريتات الأمونيوم عبر الغشاء (المعروف ة أيضًا باسم التحميل عن بعد)17 كتحقق من سلامة ثنائي الدهون LTSL. التحميل عن بعد من DOX يتطلب liposome للحفاظ على درجة الحموضة التدرج من أجل تحقيق كفاءة عالية التغليف (EE)، وهو ما من غير المرجح أن يحدث دون طبقة الدهون سليمة. في هذه الطريقة المقدمة ، المميزة من بروتوكولات إعداد الدهون المجهرية النموذجية ، يلزم اتخاذ خطوة الصلب قبل إزالة الإيثانول لتمكين القدرة على التحميل عن بعد ؛ أي لاستعادة سلامة طبقة الدهون.

وكما ذُكر سابقاً، يمكن أيضاً إدخال حمولات هيدروفيلية ومسعورة على الحلول الأولية للتغليف المتزامن للحمولات أثناء تشكيل الـ LTSLs. كدليل على مفهوم, indocyanine الأخضر (ICG), ووافقت ادارة الاغذية والعقاقير بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت, الذي هو أيضا عامل الحرارية الضوئية واعدة, يتم إدخال إلى خليط الدهون الأولية وبنجاح شارك في تحميلها في LTSLs. يتم استخدام ليزر 808 نانومتر لتشعيع الـ LTSLs المحملة بـ DOX /ICG ويحفز بنجاح إطلاق الاندفاع الحراري الضوئي الذي تسبب في إطلاق DOX في غضون 5 دقيقة.

جميع الأدوات والمواد متاحة تجاريا، جاهزة للاستخدام، ودون الحاجة إلى التخصيص. وبما أن جميع البارامترات لصياغة الـ LTSLs قد تم تحسينها، بعد هذا البروتوكول، فإن الباحثين الذين ليس لديهم معرفة مسبقة بالميكروسيوليمكن أيضاً أن يعدوا الـ LTSLs، الذي يعمل كأساس لنظام تسليم الأدوية الحساس للحرارة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد المعدات

  1. تجميع مضخات الحقنة وSHM على النحو التالي.
    1. توصيل "إلى الكمبيوتر" ميناء مضخة حقنة الثانوية (مضخة 02، للحل مائي) إلى ميناء "إلى الشبكة" من مضخة حقنة رئيسية (مضخة 01، لمحلول الدهون الإيثانول) باستخدام مضخة لضخ كابل الشبكة(الشكل 1،أصفر).
    2. توصيل منفذ "إلى الكمبيوتر" من المضخة الرئيسية إلى منفذ "RS232 المسلسل" من الكمبيوتر باستخدام جهاز الكمبيوتر إلى كابل شبكة مضخة(الشكل 1، الأزرق).
    3. ربط أنابيب إلى كل من مداخل ومنافذ من SHM باستخدام الجوز والفير. تحويل محطة الأنابيب لكلا المداخل إلى الإناث Luer باستخدام آخر الجوز والفير وجمعية الاتحاد. أطول أنابيب من مداخل يسمح أسهل المرفق إلى المحاقن(الشكل 2).
  2. إعداد برنامج التحكم في المضخة.
    1. تعيين عنوان مضخة الحقنة الرئيسية ومضخة الحقنة الثانوية إلى "Ad:01" و "Ad:02"، على التوالي، وذلك باستخدام زر "الإعداد" من مضخة الحقنة. هذا يحتاج فقط إلى القيام به للمرة الأولى.
    2. افتح برنامج التحكم في المضخة على الكمبيوتر. يجب الكشف عن مضختين الحقنة تلقائيًا ، متبوعًا بصوت الصفير. خلاف ذلك، انقر فوق مضخات والبحث عن مضخات لتحديث الاتصال. (الشكل3).
    3. تعيين القطر إلى 12.45 (ملم) عن طريق اختيار "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia = 12.45)".
    4. تعيين معدل إلى 0.25 مل / دقيقة لمضخة 01 (محلول الدهون الإيثانول) و 0.75 مل / دقيقة للمضخة 02 (محلول مائي). وتقابل معدلات التدفق معدل تدفق إجمالي قدره 1 مل/دقيقة ونسبة معدل تدفق مائي إلى إيثانول (FRR) قدرها 3.
    5. تعيين وحدة التخزين إلى أي قيم أعلى من 5 مل.
      ملاحظة: يتم تعيين حجم التسريب المستهدف أكبر من حجم السائل المحملة بالنظر إلى حجم الفراغ من الأنابيب.
    6. حدد وضع INF (التسريب) لكلا المضختين.
    7. اضغط على تعيين لتأكيد الإعدادات.

2. إعداد LTSLs

  1. إعداد خليط الدهون LTSL10 أو LTSL10-ICG (انظر الجدول 1).
  2. اسحب 1 مل من خليط الدهون وما لا يقل عن 3 مل من (NH4)2SO4 حل باستخدام اثنين من 5 مل محاقن قفل Luer.
  3. تثبيت اثنين من المحاقن على مضخات حقنة في وضع تستقيم عن طريق انزلاق شفة برميل من الحقنة إلى التجنيب حقنة من المضخة، وشفة المكبس من الحقنة إلى كتلة دافع من المضخة(الشكل 4).
  4. التفاف نهاية شريط التدفئة إلى الحقنة مع الحل مائي. التفاف الطرف الآخر من شريط التدفئة ودرجة الحرارة التحقيق من الحرارة حول الحقنة مع محلول الدهون. من المفيد ممارسة هذه الخطوة باستخدام المحاقن الفارغة في مكانها من أجل تسهيل عملية التجميع(الشكل 5A).
  5. ربط اثنين من المحاقن إلى محولات Luer الإناث من مداخل المقابلة من SHM. تأكد من أن المحاقن التي تحتوي على خليط الدهون و (NH4)2SO4 يتم توصيل محاليل الإيثانول والمياه، على التوالي. ضبط موقف المكبس لإزالة فقاعات الهواء من المحاقن(الشكل 5B).
    ملاحظة: تأكد من أن المحاقن لا تزال في وضع آمن على مُلتك المحاقن للمضخات.
  6. تسخين المحاقن إلى ما فوق 51 درجة مئوية باستخدام شريط التدفئة باستخدام جلسة التدفئة 10 s. السماح للحرارة لتحديث درجة حرارة المحاقن. كرر هذه الخطوة في الخطوات التالية للحفاظ على درجة الحرارة أثناء التسريب.
    تنبيه: قم بإيقاف تشغيل شريط التدفئة بعد 10 s لمنع تجاوز درجة الحرارة والسماح للحرارة بتحديث درجة الحرارة الفعلية. وينبغي أيضا أن يتم التعامل مع شريط التدفئة بعناية كما ترتفع درجة حرارته بسرعة كبيرة. التدفئة باستمرار قد تلف المعدات والمحاقن، وذلك بسبب التأخير الزمني للحرارة لتحديث درجة الحرارة المقاسة.
  7. مرة واحدة في درجة الحرارة فوق 51 درجة مئوية، تشغيل مضخات حقنة عن طريق الضغط على تشغيل الكل في برنامج التحكم في مضخة(الشكل 3).
  8. تأكد من تدفق السوائل خالية من فقاعات الهواء وأي تسرب. تخلص من الحجم الأولي (حوالي 0.5 مل) من السائل من المنفذ كنفايات.
    ملاحظة: حجم النفايات الأولي هذا غير محدد ويعتمد على الحجم الداخلي للإعداد، وهو حجم السوائل للسفر من المحاقن عبر الأنابيب وSHM إلى المنفذ.
  9. جمع بقية السائل كعينات الدهنية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق أو قارورة بيجو.
  10. وقفة / وقف التسريب عندما السائل في أي من المحاقن فارغة تقريبا.
    ملاحظة: يجب إيقاف المضخات يدويًا، نظرًا لأن المضخات قد لا تكتشف الموضع بدقة عندما تكون المحاقن فارغة.
  11. ضع الحلول الدهنية التي تم جمعها في حمام مائي 60 درجة مئوية إلى الصلب لمدة 1.5 ساعة.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية في تمكين تحميل المخدرات في الليبوزومات.
  12. نقل الحلول لأنابيب غسيل الكلى. دييز الحلول ضد 1 لتر من 240 mM (NH4)2SO4 في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة على الأقل للحصول على الليبوزومات المنقى.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. الدهون في هذه الخطوة هي في 5 ممل من الفوسفوليبيد. يمكن تخزين الليبوزومات المنقاة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  13. لتنظيف SHM للاستخدام المتكرر، مسح SHM بالتتابع مع الماء المؤين، والإيثانول والجافة مع غاز النيتروجين.

3. تحميل عن بعد من DOX في LTSLs عن طريق تدرج درجة الحموضة عبر الغشاء

  1. تبادل المخزن المؤقت الخارجي من LTSLs إلى خط السالين المؤقت HEPES (HBS) باستخدام اللونية استبعاد الحجم (SEC) لإنشاء تدرج درجة الحموضة عبر الغشاء.
    1. إضافة ما مجموعه 25 مل من HBS إلى أعلى عمود SEC لإعداد العمود. السماح لجميع eluent إلى elute من خلال العمود والتخلص من eluate.
    2. إضافة 1 مل من الليبوزومات dialyzed، أعدت من الخطوة 2.12، إلى العمود والتخلص من elute.
    3. إضافة 1.5 مل من HBS إلى العمود والتخلص من elute.
    4. إضافة 3 مل من HBS إلى العمود وجمع 3 مل من elute.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يتم جمع الليبوزومات في هذه الخطوة وهي في 1.67 مم من الفوسفوليبيد. يمكن تخزين الليبوزومات العازلة المتبادلة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. احتضان LTSLs مع دوكسوروبيسين (DOX) وتنقية LTSLs.
    1. إضافة محلول DOX في نسبة الأضراس من 1:20 DOX إلى الفوسفوليبيد إلى 1 مل من محلول الليبوزومات المخزنية المتبادلة (1.67 ملليمول) الموجودة في قارورة بيجو. ويمكن تحقيق ذلك بإضافة 48.4 ميكرولتر من محلول DOX 1 ملغم/مل (83.4 ميكرومول).
    2. ضع قارورة بيجو في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للسماح بتحميل DOX في الليبوزومات.
    3. مزيج 10 ميكرولتر من الليبوزومات مع 170 ميكرولتر من HBS و 20 ميكرولتر من 1٪ (v/v) ترايتون X-100 الحل في لوحة سوداء 96-جيدا. كرر لثلاثة آبار. هذه الآبار تتوافق مع "قبل تنقية" DOX المحتوى.
    4. في حالة إعداد LTSL10-ICG، اخلط 40 ميكرولتر من الليبوزومات مع 160 ميكرولتر من DMSO في لوحة واضحة 96-well. كرر لثلاثة آبار. وتتوافق هذه الآبار مع محتوى اللجنة الدولية لـ "قبل التنقية".
    5. تنقية محلول الدهنية كما هو موضح في الخطوة 3.1.
      ملاحظة: لإعادة استخدام العمود لتنقية المستقبل، قم بتنظيف العمود من DOX المجانية عن طريق إضافة 1 مل من محلول 0.5 M NaOH المخفف قبل تنفيذ الخطوة 3.1.1. سوف DOX الحرة باللون الأحمر بدوره البنفسجي الأزرق وelute من خلال العمود بسرعة.
    6. مزيج 30 ميكرولتر من محلول الليبوزومات المنقى مع 150 ميكرولتر من HBS و 20 ميكرولتر من 1٪ (v/v) ترايتون X-100 الحل في لوحة سوداء 96-جيدا. كرر لثلاثة آبار. هذه الآبار تتوافق مع "بعد تنقية" DOX المحتوى.
    7. في حالة LTSL10-ICG، اخلط 40 ميكرولتر من محلول الليبوزومات المنقى مع 160 ميكرولتر من DMSO في لوحة واضحة 96-well. كرر لثلاثة آبار. وتتوافق هذه الآبار مع محتوى اللجنة الدولية لـ "بعد التنقية".
    8. قياس كثافة الفلورسة DOX من الآبار قبل (الخطوة 3.2.3) وبعد (الخطوة 3.2.5) تنقية، وذلك باستخدام قارئ microplate(ο ex = 485 نانومتر،em = 590 نانومتر).
    9. حساب كفاءة تغليف DOX (DOX EE) عن طريق أخذ نسبة كثافة الفلورسينس قبل وبعد التنقية.
      figure-protocol-1
    10. قياس امتصاص ICG من الآبار قبل وبعد تنقية، وذلك باستخدام قارئ microplate (600 إلى 1000 نانومتر).
    11. احسب كفاءة التغليف لـ ICG (ICG EE) من خلال أخذ نسبة الامتصاص عند 792 نانومتر قبل وبعد التنقية ، مع الأخذ في الاعتبار عامل التخفيف (3 مرات) أثناء التنقية.
      figure-protocol-2

4. تشتت الضوء الديناميكي (DLS)

  1. أضف 50 ميكرولتر من محلول الليبوزومات (الخطوة 2.12) إلى 450 ميكرولتر من الماء المنزوع الأيونات.
  2. ضع الكوفيت داخل أداة DLS وانفذ القياس وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. تسجيل متوسط متوسط قطر وتشتت ثلاثة قياسات لكل عينة.

5- قياس السعرات الحرارية للمسح التفاضلي

  1. تركيز 1 مل من عينات الليبوزومات (الخطوة 2.12) مع وحدة تصفية الطرد المركزي إلى 0.5 مل (تركيز الدهون النهائي من 10 م. م. ). باستخدام دوار ثابت الزاوية، تدور في 7500 × ز لمدة 15 دقيقة تقريبا.
  2. نقل 20 ميكرولتر من (NH4)2SO4 الحل وعينات الليبوزومات إلى اثنين من المقالي DSC المعنية. ختم المقالي مع أغطية DSC المطبعية باستخدام طقم الصحافة عينة DSC.
  3. قياس العينة من 30 درجة مئوية إلى 60 درجة مئوية بمعدل تدفئة 1 درجة مئوية / دقيقة باستخدام مقياس السعرات الحرارية المسح يتفاضلي.
  4. تحليل البيانات باستخدام البرامج المناسبة. خذ درجة حرارة المرحلة الانتقالية (Tm)كبداية لانتقال المرحلة (ذروة الذوبان) ، والتي تقاس باعتراض x لظل نقطة المنحدر الأقصى.

6. دوكسوروبيسين الافراج

  1. سخني HBS في درجة حرارة محددة (37 أو 42 درجة مئوية) باستخدام حمام مائي. إعداد حمام ماء جليدي لإخماد العينات.
  2. أضف 100 ميكرولتر من الليبوزومات المنقاة المحملة من DOX (الخطوة 3.2.5) إلى 1.9 مل من HBS في أنبوب طرد مركزي صغير. ضع الأنبوب في حمام الماء في درجة الحرارة المعينة.
  3. سحب فورا 200 ميكرولتر من العينات من الأنبوب وبسرعة وضعه في حمام الماء المثلج لاخماد أي إطلاق المخدرات اللاحقة. تتوافق هذه العينة مع نقطة الوقت الأولية (t = 0).
  4. سحب 200 ميكرولتر من العينات في نقاط زمنية لاحقة (t = 5، 10، 15، 30، 60 دقيقة) وبسرعة وضعه في حمام الماء الجليدي لإخماد أي إطلاق المخدرات.
  5. مزيج 50 ميكرولتر من عينة من كل نقطة زمنية مع 150 ميكرولتر من HBS في لوحة سوداء 96-جيدا. قياس كثافة الفلورسة DOX باستخدام قارئ لوحة.
  6. أضف 20 ميكرولتر من 1% (v/v) تريتون X-100 إلى آبار عشوائية مختارة أعدت في الخطوة 6.5. قياس كثافة الفلورسة DOX من هذه الآبار باستخدام قارئ لوحة. تتوافق هذه القيم مع النقطة الزمنية التي تم إصدارها بالكامل (t = ☆; 100% الإصدار).
  7. حساب ورسم النسبة المئوية لـ DOX التي تم إصدارها عن طريق استيفاء كثافة الفلورية لكل نقطة زمنية (I (t))، مقارنة بالقيمة الأولية (I (0))، والقيمة التي تم إصدارها بالكامل (I().).
    figure-protocol-3

7. تسخين الليزر والإفراج أثار

  1. ضبط درجة حرارة حمام الماء إلى 37 درجة مئوية والسماح لدرجة الحرارة لتحقيق الاستقرار.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من DOX تحميل LTSL10-ICG ([ICG] = 10 ميكروغرام / مل) إلى لوحة واضحة 96 جيدا، ثم وضعه في حمام الماء، والحفاظ على الجزء السفلي مغمورة في الماء.
  3. تعيين تيار نظام الليزر إلى 2.27 A. ضع الكوليماتور لنظام الليزر في 5 سم عموديا فوق سطح لوحة 96-well، والذي يتوافق مع تدفق الطاقة من 0.5 W/cm2 [الشكل 6].
    تنبيه: يجب تشغيل نظام الليزر وفقًا لتدابير السلامة ذات الصلة بالليزر.
  4. قم بتشغيل الليزر وراقب درجة الحرارة كل دقيقة باستخدام مسبار درجة حرارة الألياف البصرية.
  5. في 5 و 10 دقيقة، اسحب 10 ميكرولتر من الليبوزومات المشععة بالليزر من لوحة 96-well واضحة في وتخلط مع 190 ميكرولتر من HBS لثلاث آبار في لوحة سوداء 96-well.
  6. مزيج 10 ميكرولتر من الليبوزومات مع 170 ميكرولتر من HBS و 20 ميكرولتر من 1٪ (v/v) ترايتون X-100 حل لثلاثة آبار في لوحة سوداء 96-جيدا. هذه الآبار تتوافق مع "100٪ صدر" DOX المحتوى. قياس كثافة الفلورسنت DOX وحساب الإفراج DOX كما هو موضح في الخطوة 6.7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد LTSLs بواسطة microfluidics يتطلب تكوين الدهون من DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, نسبة الأضراس; LTSL10). يوضح الشكل 7A (يسار) مظهر LTSL10 الجاهز من الخطوة 2.9، كسائل واضح وغير لزج. تم تطوير صياغة LTSL10 من الصياغة التقليدية ، LTSL4 (DPPC / MSPC / DSPE - PEG2000، 86/10/4 ، نسبة الأضراس) منذ LTSL4 يشكل عينة لزجة تشبه هلام ، كما هو مبين من قبل كمية كبيرة من فقاعات الهواء المحاصرين في العينة(الشكل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول المقدم إعداد الليبوزومات ذات الحساسية المنخفضة لدرجة الحرارة (LTSLs) باستخدام خلاط مجهري عظم الرنجة (SHM). صيغة LTSL10 تمكن من درجة الحرارة التي تسببها إطلاق انفجار من doxorubicin في غضون 5 دقائق في درجة حرارة hyperthermic يمكن تحقيقها سريريا من 42 درجة مئوية. Indocyanine الأخضر (ICG) يمكن أيضا أن تكون المشاركة في تحميل للتدفئة الحرارية الضوئية أثار الإفراج عن DOX. وتعتمد الطريقة على: '1' التجميع الذاتي للفوسفوليبيدات في الليبوزومات في إطار بيئة مذيبة متجانسة يوفرها الخلط السريع والفوضوي لمحلول الإيثانول و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر سرطان البروستاتا في المملكة المتحدة (CDF-12-002 Fellowship) ومجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية (EP/M008657/1) على التمويل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1،2-ديبالميتويل-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)LipoidPC 16: 0/16: 0 (DPPC)
1،2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [ميثوكسي (بولي إيثيلين جلايكول) -2000] (DSPE-PEG2000) LipoidPE 18: 0 / 18: 0-PEG 2000
(MPEG 2000-DSPE)
(MSPC)AvantiPolar Lipid855775P-500MGوزعت بواسطة سيجما أدريتش. يعرف أيضا باسم Lyso 16: 0 PC
(لا ينبغي الخلط بينه وبين 14: 0 / 18: 0 PC ، والذي يطلق عليه أيضا MSPC) 4
- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) محولاتSigma-AldrichH3375-100G
، قفل Luer أنثوي إلى 1/4 "-28UNFIDEX Health & يتطلب ScienceP-6242 وحدات. لمحولات المداخل
، تجميع الاتحاد ، 1/4 "-28UNFIDEX Health & يتطلب ScienceP-6302 وحدات. (وحدة واحدة تشمل 2 مكسرات و 2 حلقات)
كبريتات الأمونيوم ((NH4) 2SO4)سيجما ألدريتش31119-1KG-M
قارورة بيجوVWR216-09807 مل ، شفاف ، قارورة البوليسترين
وحدة تصفية الطرد المركزيسيجما ألدريتشUFC80100810 كيلو دالتون MWCO ، وحدة تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra-4
الطرد المركزيThermoFisher ScientificHeraeus Megafuge 8Rمع دوار
الزاوية الثابتة HIGHConic IIIكوفيتفيشر 11602609 العلميكوفيت البوليسترين القابل للتصرف ، حجم منخفض ، لقياس DLS
طقم غسيل الكلى - Pur-A-Lyzer MaxiSigma-AldrichPURX12015-1KT12-14 kDa MWCO
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-Aldrich34943-1L-M
DLS أداةMalvernPanalytical Zetasizer Nano ZS90
Doxorubicin Hydrochloride (دوكس)Apollo ScientificBID0120
DSC InstrumentTA InstrumentsTA Q200 DSC
DSC Tzero HermeticCapss TA Instruments901684.901لقياس
DSC DSC Tzero PansTA Instruments901683.901لقياس
DSC DSC Tzero Sample Press KitInstruments901600.901لقياس
الإيثانولVWR20821.330مطلق ، & ge ؛ 99.8٪
FC-808 نظام ليزر مقترن بالأليافCNI Optoelectronics TechFC-808-8W-181315FOC-01-B مصادم ألياف متضمن.
الطويق ، 1/4 "-28UNF إلى 1/16" ODIDEX Health & ScienceP-200
لمخرج مسبار درجة حرارة الألياف البصريةOsensaPRB-G40
زجاج متعرج متعرج (SHM)داروين Microfluidicsمتعرج خلاط - شريط تسخين رقاقة
زجاجية أوميغاDHT052020LDيمكن استبداله بسخان حقنة آخر مثل "HTC" أو "سلسلة SRT" للتسخين البطيء. الأسلاك اليدوية لقابس 3 سنون مطلوبة لطرازات 240 فولت
Indocyanine GreenAdooqA10473-100موزعة بواسطة Bioquote Limited (المملكة المتحدة)
حقنة قفل لور ، 5 ملVWR613-2043Hanke Sass Wolf SOFT-JECT محاقن من 3 قطع ، OD 12.45 مم
قارئ صفيحة دقيقةBMG LabtechFLUOstar Omegaمثبتة مع مرشحات 485 نانومتر (إثارة) و 590 نانومتر (انبعاث)
صفيحة دقيقة ، 96 بئر ، أسود ، مسطح القاعThermoFisher Scientific611F96BKلقياس التألق في قارئ الصفيحة الدقيقة
، 96 بئر ، 655101 Grenier شفاف ومسطح القاعلقياس الامتصاص قارئ الألواح الدقيقة
الجوز ، 1/4 "-28UNF إلى 1/16" ODIDEX Health & ScienceP-245بالنسبة
لمخرج الكمبيوتر إلى ضخ كابل الشبكة لعلاء الدين ، 7 أقداممن الأدوات الدقيقة العالميةNE-PC7اختياري: يمكن تشغيل مضخات الحقنة يدويا
برنامج التحكم في المضخة - SyringePumpPro ترخيص البرنامج ل 2من الأدوات الدقيقة العالميةSYRINGE-PUMP-PRO-02اختياري: يمكن تشغيل مضخات الحقن يدويا
كابل شبكة المضخة إلى المضخة لعلاء الدين ، 7 أقدامأدوات الدقة العالميةNE-NET7اختياري: يمكن تشغيل مضخات الحقن يدويا
الكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم (SEC)راتنج GE Life Science17085101Sephadex G-25 في أعمدة تحلية الصوديوم PD-10
كلوريد الصوديوم (NaCl)سيجما ألدريتش31434-1KG-M
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)سيجما ألدريتشS5881-500G
مضخات الحقن & كابل (DUAL-PUMP-NE-1000)أدوات الدقة العالميةALADDIN2-220 / AL1000-220
في درجة حرارة الترموستاتInkbirdITC-308يمكن استبدالها بمجموعة سخان حقنة أخرى / ترموستات
أنابيب Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
، ETFE (1/16 "OD) IDEXHealth & Science1516
USB إلى RS-232 محولWorld Precision InstrumentsCBL-USB-232اختياري: للكمبيوتر بدون منفذ RS-232
Water BathGrant Instruments Ltd.جي بي نوفا 12
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine أجهزة TA DSC عمود تحكم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
  2. Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
  3. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  4. Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
  5. Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
  6. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
  7. Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
  8. Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
  9. Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
  10. Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
  11. Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
  12. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).
  13. Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
  14. Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
  15. Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
  16. Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
  17. Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
  18. Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
  19. Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
  20. Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
  21. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  22. Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
  23. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
  24. Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29(2016).
  25. Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic Liposome ProductionTemperature Sensitive LiposomesLysolipid Containing LiposomesDoxorubicin Remote LoadingIndocyanine Green Co loadingStaggered Herringbone MicromixerSize Exclusion ChromatographyAmmonium Sulfate GradientDynamic Light ScatteringNear Infrared Laser Triggered Release

Related Articles