مقالة منهجية

طريقة فحص لتحديد العقاقير المعززة للهيتروكروماتين باستخدام دروسوفيلا

5.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60917

⸱

مارس 12, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of California San Diego

في هذه المقالة

ملخص

Drosophila هو نموذج تجريبي يستخدم على نطاق واسع ومناسب لفحص الأدوية مع التطبيقات المحتملة لعلاج السرطان. هنا، ونحن نصف استخدام الأنماط الظاهرية لون العين المتنوعة Drosophila كوسيلة لفحص مركبات الجزيئات الصغيرة التي تعزز تشكيل الهيتروكروماتين.

الملخص

Drosophila هو كائن نموذجي ممتاز يمكن استخدامه لفحص المركبات التي قد تكون مفيدة لعلاج السرطان. الطريقة الموصوفة هنا هي فعالة من حيث التكلفة في طريقة الجسم الحي لتحديد المركبات المعززة للتغاير باستخدام Drosophila. سلالة DX1 في Drosophila ، وجود نمط ظاهري لون العين المتنوعة التي تعكس مدى تكوين الهيتروكروماتين ، وبالتالي توفير أداة لشاشة المخدرات تعزيز التغاير. في طريقة الفحص هذه ، يتم قياس تنوع العين على أساس مساحة سطح التصبغ الأحمر الذي يشغل أجزاء من العين ويتم تسجيله على مقياس من 1 إلى 5. طريقة الفحص واضحة وحساسة وتسمح باختبار المركبات في الجسم الحي. فحص المخدرات باستخدام هذه الطريقة يوفر وسيلة سريعة وغير مكلفة لتحديد الأدوية المعززة للتغاير التي يمكن أن يكون لها آثار مفيدة في علاجات السرطان. تحديد المركبات التي تعزز تشكيل الهيتروكروماتين يمكن أن يؤدي أيضا إلى اكتشاف آليات اللاجينية لتطوير السرطان.

المقدمة

هيتروكروماتين هو شكل مكثف من الحمض النووي الذي يلعب دورا مركزيا في التعبير الجيني، في تنظيم الفصل الكروموسوم أثناء انقسام الخلايا، وفي الحماية من عدم استقرار الجينوم1. وقد اعتبر Heterochromatin أن يكون منظم قمع الجينات وحماية سلامة الكروموسوم خلال الانقسام الخلية2،3. ويرتبط مع دي- وثلاثي ميثيلمن الهيستون H3 ليسين 9 (H3K9me) خلال التزام النسب4،,5. وعلاوة على ذلك، يعتبر أيضا تجنيد البروتين اتيروكروماتين 1 (HP1) البروتينات اللونية لتكون مرتبطة مع التغايرية وقمع اللاجينية للتعبير الجيني6. هذه البروتينات هي المكونات الأساسية وعلامات تشكيل الهيتيروكروماتين.

منذ عدم الاستقرار الجينومي تمكن الخلايا من الحصول على التعديلات الوراثية التي تعزز التسرطن، الهيتيروكروماتين أصبحت أكثر المعترف بها في تطور السرطان، ويمكن أن تكون مستهدفة لعلاج السرطان7،,8. حاليا، لا توجد أدوية راسخة في مساعدة تكوين الهيتروكروماتين. هنا، نقدم طريقة بسيطة وسريعة ولكنها فعالة لفحص مركبات الجزيئات الصغيرة التي تعزز تكوين الهيتروكروماتين. يتم الفحص عن طريق علاج Drosophila مع مكتبة من الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة. هذه الطريقة تستفيد من النمط الظاهري لون العين المتنوعة في سلالةDROSophila DX1التي تتأثر مستويات الهيتيروكروماتين. يحتوي ذباب DX1 على صفيف ة مترادفة من سبعة جينات من نوع P [lac-w] ، والتي لها التعبير / الاكتئاب المتنوع اعتمادًا على تغاير اللون ، وبالتالي ، فإن مدى التنوع في لون العين يعكس مستوى التغاير. على وجه التحديد، يمكن الكشف عن زيادة التغاير كروماتين من قبل ارتفاع نسبة لون العين المتنوعة (العين البيضاء). على العكس من ذلك ، سيتم الكشف عن انخفاض الهيتروكروماتين من قبل ارتفاع نسبة التعبير P [lac-w] transgene (العين الحمراء)9،10،11،12.

ولذلك، فإننا نستفيد من هذا النظام ترانسجين Drosophila التي تنتج نمط الظاهري لون العين المتنوعة منذ التعبير يرتبط مباشرة إلى كمية من الهيتروكروماتين الحالي. عند اكتشاف المركبات التي يشتبه في تعزيز تشكيل الهيتروكروماتين، قد نؤكد هذا الشك باستخدام أساليب أخرى مثل لطخة الغربية. ويمكن تطوير هذه المواد تعزيز التغاير للتجارب السريرية في المرضى في المستقبل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1- إعداد مكتبة المخدرات

  1. تحديد وإعداد مكتبة المخدرات ليتم فحصها باستخدام المذيبات المناسبة بالتركيز المطلوب (على سبيل المثال، 10 mM في DMSO).
    ملاحظة: مثال محدد لمكتبة الأدوية هو مجموعة الأورام الثالثة من برنامج العلاجات التنموية للمعهد الوطني للسرطان (NCI). يتم توفير المركبات في هذه المجموعة كـ 20 ميكرولتر في 10 mM في 100٪ DMSO في اثنين من لوحات 96-جيدا PP U-bottom وتخزينها في -20 درجة مئوية. يمكن العثور على خرائط NCI Plate والبيانات الكيميائية الأساسية لكل دواء في المواقع التالية:
    NCI لوحة رقم 4740
    NCI لوحة رقم 4741

2- شاشة للعقاقير التي تروج للتغاير باستخدام دروسوفيلا

  1. دروسوفيلا استراتيجية التربية(الشكل 1A)
    1. اليوم الأول: عبر ثلاثة ث1118/Y; DX1/CyO الذباب الذكور وثلاثة أو أكثر من العذراء ث1118 ذباب الإناث في 25 ملم × 95 ملم قارورة الغذاء مع 9 مل من وسائل الإعلام الغذائية دروسوفيلا القياسية (وصفة بلومينغتون). إعداد ثلاث قوارير تكرار لكل دواء وعنصر تحكم واحد للشاشة.
      ملاحظة: تم توفير الذباب DX1 بلطف من قبل جيمس بيرشلر (جامعة ميسوري)9،13.
    2. اليوم الثاني واليوم الثالث: اسمح للذباب بوضع البيض لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية).
    3. اليوم الرابع: استخدم دفعة قصيرة منغاز ثاني أكسيد الكربون لتنويم الذباب الأم والتخلص من الذباب الأم في "مشرحة الذباب" (زجاجة تحتوي على 70٪ كحول).
  2. تغذية المخدرات إلى دروسوفيلا للفحص.
    1. تمييع كل مركب دواء من المخزون الأصلي (20 ميكرولتر في 10 مل في 100٪ DMSO في 96-well PP U-bottom plates) إلى تركيز نهائي 10 ميكرومتر مع 33٪ DMSO في الماء. استخدام 33٪ DMSO في الماء دون أي دواء كتحكم.
      ملاحظة: بعض الأدوية سيئة الذوبان في الماء وتم إذابة في DMSO. 100٪ DMSO سامة للذباب. 33% مقبول.
    2. اليوم 4: ماصة 60 ميكرولتر من محلول المخدرات 10 ميكرومتر أو السيطرة على الجزء العلوي من الغذاء يطير. عند هذه النقطة ، تأكد من أن الذباب الأم قد أزيلت وهناك بيض الذباب والزحف يرقات أول instar على الطعام.
    3. اليوم 6: تكرار pipetting 60 ميكرولتر من نفس محلول المخدرات 10 ميكرومتر إلى قارورة الطعام.
      ملاحظة: بما أن الأدوية أضيفت إلى طعام الذبابة، فإن الطعام السطحي العلوي يحتوي على تركيز 10 ميكرومتر تقريبًا ولا يمكن اختراق الطعام السفلي بالكامل. كل الذباب وضع البيض على رأس الطعام وأكل الطعام السطحي العلوي.
  3. مراقبة وتسجيل التغيرات لون العين.
    1. بعد يومين من ظهور ذباب F1 (في اليوم 14 تقريبًا) ، افحص الذباب. استخدم دفعة قصيرة من ثاني أكسيد الكربون2 لتنويم ذباب F1 وإزالة الذباب من قنينته على وسادة تشريح مسامية مع CO2 يحتسي من تحت ورقة التصفية.
    2. تفقد الذباب على هذه الوسادة تحت مجهر تشريح. فحص الذبابة بأكملها وتحديد جميع ث1118/ Y؛ DX1/+ heterozygous الذكور من قبل افتقارهم إلى CyO المهيمنة الجناح المجعد النمط الظاهري.
    3. تسجيل لون العين لكل من ث1118/ Y; DX1/+ ذباب ذكر يروزيغوس على مقياس من 1 إلى 5(الشكل 1B). تم تصنيف النسبة المئوية للون العين الأبيض على النحو التالي:
      1. <5% العين الحمراء المتناثرة المساحة الإجمالية للسطح
      2. 6٪ - 25٪ بقع حمراء العين المساحة الإجمالية للسطح
      3. 26٪ - 50٪ بقع حمراء العين المساحة الإجمالية للسطح
      4. 51٪ - 75٪ بقع حمراء العين المساحة الإجمالية للسطح
      5. > 75٪ بقع حمراء العين المساحة الإجمالية للسطح
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، التجانس رؤساء ذبابة في الميثانول 100% واستخدام مطياف لقياس تصبغ العين في OD 450 نانومتر. حدد الذكور فقط لأن PEV هو أكثر pronouced في الذكور DX1. يسجل أكثر من 10 ذكور في كل قارورة.
    4. حساب متوسط مؤشر اللون لجميع الذكور من كل قارورة سجل. تنفيذ ثلاثية لكل مركب(الشكل 1C).
      ملاحظة: نظرًا لأن لون العين يختلف باختلاف العمر، فهذه خطوة حساسة للوقت. يجب حساب لون العين في نفس العمر – 2 أيام من العمر. عادة > 10 الذباب ينبغي أن يسجل في كل قارورة.
    5. للتأكد من أن المركبات في الواقع تعزيز تشكيل الهيتيروكروماتين، واستخدام تقنية مختلفة مثل النشاف الغربية للتحقق من صحة(الشكل 1G).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لفحص المركبات التي تعزز تشكيل الهيتيروكروماتين في Drosophila، وهو فعال ومنخفض التكلفة في نظام الجسم الحي لتطوير المخدرات(الشكل 1). فحصنا مكتبة المخدرات جزيء صغير، الأورام المجموعة الثالثة، والتي تتكون من 97 ادارة الاغذية والعقاقير أذن أدوية الأورام، وذلك باستخدام سلالة DX1 من ددروسوفيلا melanogaster (الشكل 1B). تم تمثيل نتائج دواء مهم في رسم بياني شريطي(الشكل 1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الهيتروكروماتين هو شكل مكثف من الحمض النووي الذي يلعب دورا مركزيا في تنظيم التعبير الجيني. هو أصبح بدرجة متزايدة أكثر يميّز في سرطان ويمكن كنت بمثابة هدف محتملة للسرطان علاج15,,16,,17,,18. وتستخدم عادة مركبات الجزيئات الصغيرة في تطوير المخدرات بسبب مزايا في التصنيع والحفظ والتمثيل الغذائي في الهيئات البشرية. لتحديد مركبات الجزيئات الصغيرة المعززة للتغاير ، تم تصميم طريقة فعالة وتقديمها باستخدام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

نشكر J. Birchler, E. باخ ومركز بلومينغتون دروسوفيلا للمخزون لسلالات Drosophila المختلفة; المعهد الوطني للسرطان (NCI) برنامج العلاجات التنموية لمكتبة الأدوية الصغيرة الجزيئات الصغيرة الأورام؛ طلاب جامعة كاليفورنيا في لوس أنج بما في ذلك إيمي تشانغ، Taesik أنت، جيسيكا سينغ بانغا، راشيل ميزا، وأليكس شافيز. تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من خلال منحة بحثية من جمعية الصدر الأمريكية إلى J.L. والتمويل من المعاهد القومية للصحة: R01GM131044 إلى W.X.L.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ذبابة الفاكهة< م > DX1 < / em > سلالة< م > DX1 < / em > تم توفير الذباب من قبل جيمس بيرشلر (جامعة ميسوري)
<م >ذبابة الفاكهة < م > وسائل الإعلام الغذائيةUCSD يطير المطبخ
ميثوتريكساتNCI مكتبة
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجماD2650
إيثيل كحولسيجماE7023-500ML
الأدوية

المراجع

  1. Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
  2. Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).
  3. Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
  4. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  5. Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
  6. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  7. Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
  8. Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
  9. Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
  10. Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
  11. Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
  12. Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
  13. Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
  14. Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).
  15. Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
  16. Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
  17. Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
  18. Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DX1

مقالات ذات صلة