Method Article

مخصص متعدد الصور المجهر منصة للتصوير الحي من القرنية ماوس وConjunctiva

DOI:

10.3791/60944

⸱

May 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا هو منصة مجهرية متعددة الصور للتصوير حية سطح العين الماوس. الماوس الفلوري المحورة تمكن من تصور نواة الخلية، أغشية الخلية، والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. توفر إشارات الجيل التوافقي الثاني غير الخطي المشتقة من الهياكل الكولاجينية تصويرًا خاليًا من التسمية لبنيات ال stromal.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحليل النسيجي التقليدي ونظم زراعة الخلايا غير كافية لمحاكاة في الحركية الفسيولوجية والمرضية تماما. أصبح المجهر متعدد الصور (MPM) واحدة من أكثر طرائق التصوير شعبية لدراسة الطب الحيوي في المستويات الخلوية في الجسم الحي، وتشمل مزايا عالية الدقة، اختراق الأنسجة العميقة والحد الأدنى من السمية الضوئية. لقد قمنا بتصميم منصة تصوير MPM مع حامل عين الماوس المخصصة ومرحلة ستيريو لسطح العين التصوير في الجسم الحي. يتيح الماوس ثنائي البروتين الفلوري تصور نواة الخلية وأغشية الخلايا والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. بالإضافة إلى إشارات الفلورس متعددة الصور، واكتساب الجيل التوافقي الثاني (SHG) يسمح في وقت واحد لتوصيف بنية السترومال الكولاجينية. يمكن استخدام هذه المنصة للتصوير داخل الرحم مع تحديد المواقع الدقيقة عبر سطح العين بأكمله، بما في ذلك القرنية والملتحمة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحمي هياكل سطح العين، بما في ذلك القرنية والملتحمة، الأنسجة الأخرى الأعمق من الاضطرابات الخارجية. تعمل القرنية، الجزء الأمامي الشفاف للعين، كعدسة انكسارية لتوجيه الضوء إلى العين وكحاجز وقائي. ظهارة القرنية هي الطبقة الخارجية من القرنية وتتكون من طبقات متميزة من الخلايا السطحية وخلايا الجناح والخلايا القاعدية. يتكون القرنية ستروما من اللامي كولاجينوسي معبأة متطورة جزءا لا يتجزأ من القرنية. إن بطانة القرنية، وهي طبقة واحدة من الخلايا سداسية مسطحة، لها دور مهم في الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الحفاظ على السترما القرنية في حالة جفاف نسبي من خلال وظائف الضخ1. ليفوس يشكل الحدود بين القرنية والملتحمة، وهو خزان الخلايا الجذعية الظهارية القرنية2. تساعد الملتحمة الوعائية العالية على تليين العينين عن طريق إنتاج المخاط والدموع3.

تتم دراسة ديناميات الخلايا في هياكل سطح القرنية بشكل تقليدي إما عن طريق التحليل النسيجي أو في زراعة الخلايا في المختبر ، والتي قد لا تحاكي بشكل كاف ديناميات الخلايا الحية. وبالتالي، فإن نهج التصوير الحي غير الغازي يمكن أن يسد هذه الفجوة. نظرا لمزاياها، والتي تشمل دقة عالية، والحد الأدنى من الصور وعمق عمق التصوير، MPM أصبحت طريقة قوية في مجالات مختلفة من البحوث البيولوجية4،5،6،7،8. بالنسبة لتصوير القرنية، توفر MPM معلومات خلوية من الفلورا الذاتية الجوهرية المستمدة من NAD (P)H داخل الخلايا. الجيل التوافقي الثاني (SHG) إشارات المستمدة من نوع غير centrosymmetric أنا ألياف الكولاجين تحت femtosecond ليزر المسح يوفر هياكل السترومال الكولاجين دون إجراءات تلطيخ إضافية9. في السابق، ونحن وغيرها من الجماعات قد استغلت MPM لتصوير القرنيات الحيوانية والبشرية9،10،11،12،13،14،15.

خطوط الماوس المعدلة وراثيا عرض البروتينات الفلورية في مجموعات خلايا محددة وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسات مختلفة في بيولوجيا الخلية, بما في ذلك التنمية, الأنسجة التوازن, تجديد الأنسجة, وتولد السرطان. استخدمنا سلالات الماوس المعدلة وراثيا وصفت مع البروتينات الفلورية لفي التصوير في مجال المعلومات الحية من القرنيات9،10، بصيلات الشعر10 والبشرة10 بواسطة MPM. يتم تربيت سلالة الماوس الفلورية المزدوجة مع غشاء الخلية المسمى مع tdTomato ونواة الخلية الموسومة مع EGFP من سلالات الماوس اثنين: R26R-GR (B6؛ 129-gt (روزا) 26Sortm1Ytchn/J،#021847)16 وmT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP،#007676) 17. يحتوي خط الماوس المعدل وراثيا R26R-GR على ثنائية الفلورسنت البروتين مراسل ينبني، بما في ذلك الجينات الانصهار H2B-EGFP ومشري-GPI مرساة مرساة مرساة الجينات الانصهار إشارة، إدراجها في gt (روزا) 26Sor locus. سلالة mT-mG المعدلة وراثيا هي tdTomato غشاء الخلية المستهدفة وGFP الفئران الفلورسنت كري مراسل. قبل إعادة الكومبينيشن Cre، بروتين غشاء الخلية مع tdTomato التعبير المفلور موجود على نطاق واسع في مختلف الخلايا. هذه السلالة الماوس المعدلة وراثيا تمكننا من تصور nuclei-EGFP والغشاء مع tdTomato دون الإثارة Cre. ولدت اثنين من الإناث (R26R-GR+/+) و ذكر واحد (mT-mG+/+)الماوس المعدل وراثيا معا لإنتاج فئران كافية للتجارب. ذريتهم مع R26R-GR+/-mT-mG+/- النمط الجيني، سلالة الفئران الفلورية المزدوجة، استخدمت في هذه الدراسة. بالمقارنة مع واحد الفلورسنت خط الماوس مراسل كما هو موضح سابقا9،10، وهذا مزدوج الفلورسنت المصابيح الماوس سلالة يوفر لنا 50 ٪ تخفيض الحصول على وقت التصوير.

في هذا العمل، نحن وصف بروتوكول تقني مفصل للتصوير في الجسم الحي من سطح العين بطريقة خطوة بخطوة باستخدام منصة التصوير لدينا والفئران المعدلة وراثيا الفلورسنت المزدوج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد اجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للاجراءات التى وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات التابعة لجامعة تايوان الوطنية ومستشفى تشانغ جونج التذكارى .

1. إعداد المجهر متعدد الصور

  1. بناء نظام يقوم على المجهر تستقيم مع غمر الماء 20x 1.00 NA الهدف (الشكل 1A).
  2. استخدام Ti: الليزر الياقوت (مع الطول الموجي tunable) كمصدر الإثارة. تعيين طول موجة إخراج الليزر في 880 نانومتر لEGFP و 940 نانومتر لthdTomato(الشكل 1A).
  3. وتشمل اثنين من المرايا dichroic (495 نانومتر و 580 نانومتر) لفصل SHG / EGFP وGFP / tdTomato (الشكل 1A). يفصل بشكل طيفي إشارات SHG، EGFP و tdTomato بواسطة شريط مرشحات 434/17nm، 510/84nm و585/40nm(الشكل 1A).
  4. من أجل تحسين جودة الصورة وتجنب تلف الأنسجة وphotobleaching، تعيين قوة الليزر لتكون حوالي 35 ميغاواط للقرنية التصوير و 50 ميغاواط ل-limbus. قياس قوة الليزر قبل أن يمر الليزر النظام البصري. قوة الليزر الدقيقة على العينات حوالي 8-9 ميغاواط. يتم عرض التصميم المجهري الكامل في الشكل 1A.
    ملاحظة: يتم تعيين الحد الأعلى من قوة الليزر إلى 70 ميغاواط لتجنب تبييض الصور وتلف الأنسجة.

2. إعداد الحيوان للتصوير الحي

  1. استخدام الفئران 8-12 أسبوعا من العمر لهذه التجربة. حقن عضليا 50-80 ملغ / كغ من تيلاتامين HCl وZolazepam HCl للتخدير العام. تحقق من عدم وجود استجابة لردود الفعل الانسحاب عن طريق قرص إصبع القدم. يكفي التخدير المهم للسماح مستقرة مراقبة معدل التنفس.
    ملاحظة: يوصى بالفئران في عمر 8 أسابيع أو أكثر لأن مقل العيون نضجت.
  2. ضع الماوس تحت التخدير على مرحلة ساخنة وأدخل مسبار مراقبة درجة الحرارة في فتحة الشرج.
    تنبيه: يجب إدخال المسبار بالكامل في تجويف الشرج دون التعرض للهواء ، لتجنب ارتفاع درجة حرارة السخان وتحريض ضربة الحرارة.

3. العين عقد للتصوير الحية من سطح العين

  1. للتصوير الحي لسطح العين، استخدم حامل الماوس المُصمم المُصمم خصيصاً والذي يتكون من جزأين: حامل رأس لتثبيت الرأس وحامل العين لسحب الجفون وفضح سطح العين بأكمله(الشكل 1B-D).
  2. أدخل قضبان الأذن في اللحم السمعي الخارجي وحافظ على تثبيت ثلاث نقاط لحامل الرأس(الشكل 1B, D).
  3. موضعيا تطبيق حل من 0.4٪ هيدروكلوريد أوكسيبوبروكاين في المالحة وتركها لمدة 3 دقائق ل التخدير سطح العين.
  4. تأكد من بروز مقلة العين عن طريق التراجع اليدوي السليم للجفن. خلاف ذلك، يمكن أن يحدث نقص التروية ونزيف مقلة العين.
  5. ضع بعناية حلقة من أنبوب البولي إيثيلين من حامل العين على طول هامش الجفن لفضح سطح العين. تحقيق الاستقرار في مقلة العين مع صاحب العين تتألف من ملقط Dumont رقم 5 مع نصائحه مغطاة حلقة من أنبوب البولي ايثيلين(الشكل 1C, D).
  6. مسامير ملقط باستخدام مقبض في ملقط قاصي من صاحب العين للحفاظ على مقلة العين مستقرة (الشكل 1D).
  7. ضع جل العين مع معامل الانكسار 1.338 على سطح القرنية كوسيلة غمر للحفاظ على رطوبة سطح العين كل ساعة. بالإضافة إلى ذلك، فإن التطبيق المنتظم لجل العين كل ساعة تجنب التعتيم في القرنية أثناء التصوير.
  8. تدوير مقلة العين مع حامل التي مؤمن على مرحلة السائر الآلية للتصوير عبر سطح القرنية بأكمله من القرنية المركزية إلى المنطقة الطرفية(الشكل 1C, D).
    تنبيه: يمكن أن تؤثر كميات الجل الزائد وغير الكافي على جودة الصور أثناء التصوير. لذلك، مكملة جل العين كل ساعة للحفاظ على سطح رطبة بانتظام مهم للتصوير.

4. Z - تسلسلي الحصول على صورة

ملاحظة: تعيين الشريحة الأولى والأخيرة في كل مكدس لتقليل النتائج الملموسة الحركة إسقاط.

  1. قبل التقاط الصور، صورة حقل الاستهداف مع مصدر ضوء الزئبق.
  2. انقر فوق رمز برنامج المجهر لتشغيل البرنامج.
  3. حدد كسب PMT المناسب والحصول الرقمي لتصور هيكل الخلوية في سطح العين.
  4. تعيين الشريحة الأولى والشريحة الأخيرة للحصول على مكدس.
  5. أدخل القيم الرقمية لدقة الصورة وخطوة z، على سبيل المثال، 512 × 512 و1 ميكرومتر كخطوة z.
  6. انقر على زر ابدأ لجمع الصور z-المسلسل.
  7. الحصول على صور حية مرتين في نفس المنطقة، الأولى في 880 نانومتر الإثارة لجمع إشارات SHG / EGFP والثانية في 940 نانومتر الإثارة لجمع إشارات EGFP/tdTomato.
    ملاحظة: يوفر تركيبة مكدسات اثنين صور القنوات 3. وكان حجم دقة الصورة وتنسيق المسح الضوئي 512 × 512 بكسل و 157 ميكرومتر x 157 ميكرومتر، على التوالي.

5. معالجة الصور وإعادة الإعمار 3D

  1. تحميل الصور z-المسلسل في فيجي البرمجيات18.
  2. حدد البرنامج المساعد متوسط 3D مرشح في فيجي للحد من الضوضاء الخلفية.
  3. حدد عامل تصفية حزمة "حزمة قناع Unsharp" في فيجي لتشذيب الصور.
  4. انقر فوق "تلقائي" في السطوع / التباين لتحسين جودة الصور تلقائيًا.
  5. حفظ الصور كتسلسل الصورة لتكون قادرة على تصدير الصور z-المسلسل.
  6. تحميل الصور z -المسلسل في البرمجيات التجارية (على سبيل المثال، Avizo لايت) لإعادة الإعمار 3D باستخدام عرض حجم.
  7. في جميع الصور MPM، وGFP الحالية، tdTomato، وإشارات SHG باللون الأخضر الزائف، الأحمر، السماوي اللون على التوالي.
  8. التقاط صور هيكل 3D من قبل لقطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذه المنصة التصوير الحية، يمكن تصور سطح العين الماوس في المستويات الخلوية. لتصور الخلايا الفردية الفردية في سطح العين، ونحن تستخدم الفئران المعدلة وراثيا الفلورية المزدوجة مع EGFP أعرب في نواة وddTomato أعرب في غشاء الخلية. تم تسليط الضوء على السترما القرنية الغنية بالكولاجين من خلال إشارات SHG.

في ظهارة القرنية، تم تصور الخلايا السطحية وخلايا الجناح والخلايا القاعدية(الشكل 2). في الفئران الفلورية المزدوجة المعدلة وراثيا، كنا قادرين على رسم خريطة خلايا وا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام هذه المنصة التصويرية MPM المبنية خصيصًا مع برنامج تحكم للتصوير داخل الرحم للأعضاء الظهارية للماوس ، بما في ذلك الجلد10، بصيلات الشعر10 وسطح العين9،10 (الشكل 1A). تم استخدام النظام المصنوع خصيصًا لمرونته في تغيير المكونات البصرية لمختلف التجارب ، منذ بداية مشروعنا. هذه المنهجية التصوير هي متعددة لمنتجات MPM التجارية. يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة للتصوير داخلة من سطح الماوس ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر دعم المنحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (106-2627-M-002-034، 107-2314-B-182A-089، 108-2628-B-002-023، 108-2628-B-002-023)، مستشفى جامعة تايوان الوطنية (NTUH108-T17) ومستشفى تشانغ جونج التذكاري، تايوان (CMRPG3G1621، CMRPG3G1622، CMRPG3G1623).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
برنامج AVIZO LiteThermo Fisherالإصدار العلمي
مرشحات ممر النطاقSemrockFF01-434 / 17
FF01-500 / 24
FF01-585 / 40
مرايا ثنائية اللونSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
برنامج التحكم GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIOشركة ساوثبورتاليشم BIO
أوكسي بوبروكائين هيدروكلوريدسيجماO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
أنبوب البولي استيثيلينبكتون ديكنسون427401
حامل الماوس التجسيميخطوة التكنولوجيا المحدودة000111
Ti:أطياف الليزر الياقوت الفيزياءماي تاي DeepSee
المجهر المستقيمأوليمبوسBX51WI
جل فيديسيكدكتور جيرهارد مان كيم فارم. فابريك جي ام بي إتشD13581
زولتيلفيرباكVR-2831
: 2019.3.0

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013(2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171(2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiphoton MicroscopyOcular Surface ImagingMouse Cornea ImagingSecond Harmonic GenerationDual Fluorescent ReporterCustom Eye HolderStereotaxic StageZ Serial ImagingFluorescent Protein VisualizationCorneal Stroma Analysis

Related Articles