Method Article

مخصص متعدد الصور المجهر منصة للتصوير الحي من القرنية ماوس وConjunctiva

DOI:

10.3791/60944

⸱

May 17th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center, National Taiwan University, 4Department of Dermatology, National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine, National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology, Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine, Chang Gung University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا هو منصة مجهرية متعددة الصور للتصوير حية سطح العين الماوس. الماوس الفلوري المحورة تمكن من تصور نواة الخلية، أغشية الخلية، والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. توفر إشارات الجيل التوافقي الثاني غير الخطي المشتقة من الهياكل الكولاجينية تصويرًا خاليًا من التسمية لبنيات ال stromal.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحليل النسيجي التقليدي ونظم زراعة الخلايا غير كافية لمحاكاة في الحركية الفسيولوجية والمرضية تماما. أصبح المجهر متعدد الصور (MPM) واحدة من أكثر طرائق التصوير شعبية لدراسة الطب الحيوي في المستويات الخلوية في الجسم الحي، وتشمل مزايا عالية الدقة، اختراق الأنسجة العميقة والحد الأدنى من السمية الضوئية. لقد قمنا بتصميم منصة تصوير MPM مع حامل عين الماوس المخصصة ومرحلة ستيريو لسطح العين التصوير في الجسم الحي. يتيح الماوس ثنائي البروتين الفلوري تصور نواة الخلية وأغشية الخلايا والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. بالإضافة إلى إشارات الفلورس متعددة الصور، واكتساب الجيل التوافقي الثاني (SHG) يسمح في وقت واحد لتوصيف بنية السترومال الكولاجينية. يمكن استخدام هذه المنصة للتصوير داخل الرحم مع تحديد المواقع الدقيقة عبر سطح العين بأكمله، بما في ذلك القرنية والملتحمة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحمي هياكل سطح العين، بما في ذلك القرنية والملتحمة، الأنسجة الأخرى الأعمق من الاضطرابات الخارجية. تعمل القرنية، الجزء الأمامي الشفاف للعين، كعدسة انكسارية لتوجيه الضوء إلى العين وكحاجز وقائي. ظهارة القرنية هي الطبقة الخارجية من القرنية وتتكون من طبقات متميزة من الخلايا السطحية وخلايا الجناح والخلايا القاعدية. يتكون القرنية ستروما من اللامي كولاجينوسي معبأة متطورة جزءا لا يتجزأ من القرنية. إن بطانة القرنية، وهي طبقة واحدة من الخلايا سداسية مسطحة، لها دور مهم في الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الحفاظ على السترما القرنية في حالة جفاف نسبي من خلال وظائف الضخ1. ليفوس يشكل الحدود بين القرنية والملتحمة، وهو خزان الخلايا الجذعية الظهارية القرنية

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد اجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للاجراءات التى وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات التابعة لجامعة تايوان الوطنية ومستشفى تشانغ جونج التذكارى .

1. إعداد المجهر متعدد الصور

  1. بناء نظام يقوم على المجهر تستقيم مع غمر الماء 20x 1.00 NA الهدف (الشكل 1A).
  2. استخدام Ti: الليزر الياقوت (مع الطول الموجي tunable) كمصدر الإثارة. تعيين طول موجة إخراج الليزر في 880 نانومتر لEGFP و 940 نانومتر لthdTomato(الشكل 1A).
  3. وتشمل اثنين من المرايا dichroic (495 نانومتر و 580 نانومتر) لفصل SHG / EGFP وGFP / tdTomato (الشكل 1A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذه المنصة التصوير الحية، يمكن تصور سطح العين الماوس في المستويات الخلوية. لتصور الخلايا الفردية الفردية في سطح العين، ونحن تستخدم الفئران المعدلة وراثيا الفلورية المزدوجة مع EGFP أعرب في نواة وddTomato أعرب في غشاء الخلية. تم تسليط الضوء على السترما القرنية الغنية بالكولاجين من خلال إشارات SHG.

في ظهارة القرنية، تم تصور الخلايا السطحية وخلايا الجناح والخلايا القاعدية(الشكل 2). في الفئران الفلورية المزدوجة المعدلة وراثيا، كنا قادرين على رسم خريطة خلايا وا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام هذه المنصة التصويرية MPM المبنية خصيصًا مع برنامج تحكم للتصوير داخل الرحم للأعضاء الظهارية للماوس ، بما في ذلك الجلد10، بصيلات الشعر10 وسطح العين9،10 (الشكل 1A). تم استخدام النظام المصنوع خصيصًا لمرونته في تغيير المكونات البصرية لمختلف التجارب ، منذ بداية مشروعنا. هذه المنهجية التصوير هي متعددة لمنتجات MPM التجارية. يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة للتصوير داخلة من سطح الماوس ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر دعم المنحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (106-2627-M-002-034، 107-2314-B-182A-089، 108-2628-B-002-023، 108-2628-B-002-023)، مستشفى جامعة تايوان الوطنية (NTUH108-T17) ومستشفى تشانغ جونج التذكاري، تايوان (CMRPG3G1621، CMRPG3G1622، CMRPG3G1623).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
برنامج AVIZO LiteThermo Fisherالإصدار العلمي
مرشحات ممر النطاقSemrockFF01-434 / 17
FF01-500 / 24
FF01-585 / 40
مرايا ثنائية اللونSemrockFF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
برنامج التحكم GalvanoThorlabsGVS002
Jade BIOشركة ساوثبورتاليشم BIO
أوكسي بوبروكائين هيدروكلوريدسيجماO0270000
PMTHamamatsuH7422A-40
أنبوب البولي استيثيلينبكتون ديكنسون427401
حامل الماوس التجسيميخطوة التكنولوجيا المحدودة000111
Ti:أطياف الليزر الياقوت الفيزياءماي تاي DeepSee
المجهر المستقيمأوليمبوسBX51WI
جل فيديسيكدكتور جيرهارد مان كيم فارم. فابريك جي ام بي إتشD13581
زولتيلفيرباكVR-2831
: 2019.3.0

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiphoton MicroscopyOcular Surface ImagingMouse Cornea ImagingSecond Harmonic GenerationDual Fluorescent ReporterCustom Eye HolderStereotaxic StageZ Serial ImagingFluorescent Protein VisualizationCorneal Stroma Analysis

Related Articles