مقالة منهجية

فصل الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجياً، الببتيدات من المصادر الطبيعية والبروتينات من الميكروبات بواسطة طريقة التركيز الأيزوئي الإعدادي (IEF)

DOI:

10.3791/61101

⸱

يونيو 14, 2020

 ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف هو تجزئة وعزل الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا، والببتيدات من مستخلصات نباتية معقدة، والبروتينات من الميكروبات المسببة للأمراض عن طريق استخدام طريقة التركيز الأيزوفلوري (IEF) على مراحل السائل. وعلاوة على ذلك، تم تحديد الجزيئات المنفصلة وأكد نشاطها الحيوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المنتجات الطبيعية المشتقة من النباتات والميكروبات هي مصدر غني للجزيئات النشطة بيولوجيا. قبل استخدامها، يجب تنقية الجزيئات النشطة من مستخلصات معقدة لتطبيقات المصب. هناك طرق كروماتوغرافية مختلفة متاحة لهذا الغرض حتى الآن لا يمكن لجميع المختبرات تحمل أساليب عالية الأداء والعزلة عن العينات البيولوجية المعقدة يمكن أن يكون من الصعب. هنا نثبت أن التركيز الايزويتريك للمرحلة السائلة (IEF) يمكن أن يفصل الجزيئات، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة والببتيدات من مستخلصات نباتية معقدة، بناء على نقاطها الأيزوفلوريتية (pI). وقد استخدمنا هذه الطريقة في تجزئة العينات البيولوجية المعقدة وتوصيفها. كدليل على المفهوم، ونحن مجزأة استخراج مصنع Sylvestre Gymnema، وعزل عائلة من الجزيئات الصغيرة السابونين تيربينويد والببتيد. كما أظهرنا فصل البروتين الميكروبي الفعال باستخدام فطر المبيضات ألبيكان كنظام نموذجي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنقية الجزيئات الحيوية من العينات البيولوجية المعقدة هي خطوة أساسية وصعبة في كثير من الأحيان في التجارب البيولوجية1. تركيز الأزوية (IEF) هو مناسب تماما لفصل عالية الدقة من الجزيئات الحيوية المعقدة حيث يسافر أمبيروليت الناقل وفقا لشحنتها وإنشاء التدرج درجة الH في مجال كهربائي3. تم تطوير أول ناقلة تجارية أمفوليت لـ IEF من قبل أولوف فيستربيرغ في عام 1964 وبراءة اختراع4،5. ampholytes الناقل هي أليفاتية ألتيجو أمينوية oligo-carboxylic حمض جزيئات متفاوتة الطول والمتفرعة6. في وقت لاحق، فيستربرغ وغيرها تحسين أمبيروليت الناقل لاستخدامها الموسع في فصل الجزيئات الحيوية6،7.

وتشمل أساليب فصل الجزيئات الحيوية agarose و polyacrylamide هلام الكهربائي، ثنائي الأبعاد هلام electrophoresis (2-DE)، تركيز isoelectric، الشعيرات الكهربائية، isotachophoresis وغيرها من تقنيات الكروماتوغرافي (على سبيل المثال، TLC، FPLC، HPLC)2. تم اختراع المرحلة السائلة IEF التي أجريت في أداة تسمى "Rotofor" من قبل ميلان بير8. وكان رائدا في مفهوم وتصميم هذه الأداة وساهم على نطاق واسع في نظرية الهجرة الكهربائية. كما طور فريقه نموذج رياضي لعملية الفصل الكهربائي للمحاكاة الحاسوبية9.

جهاز IEF في المرحلة السائلة هو خلية أسطوانية دوارة أفقيًا تتكون من نواة نايلون مقسمة إلى 20 مقصورة مسامية وقضيب سيراميك تبريد مياه متداول. تسمح الغرف المسامية للجزيئات بالهجرة عبر المرحلة مائي بين الأقطاب الكهربائية وتسمح بجمع العينات النقية تحت فراغ في الكسور. يمكن أن يوفر نظام التنقية هذا ما يصل إلى 1000 ضعف تنقية جزيء معين في < 4 ساعات. ومن السمات القيمة لهذا الصك هو أنه يمكن تطبيقه كخطوة أولى لتنقية من خليط معقد أو كخطوة نهائية لتحقيقنقاء 10. إذا كان جزيء الفائدة هو بروتين ، فإن ميزة أخرى هي أنه سيتم الحفاظ على تركيبها الأصلي أثناء الفصل.

وقد تم الإبلاغ عن استخدام السائل المرحلة IEF على نطاق واسع للبروتينات والإنزيمات وتنقية الأجسام المضادة6,10,11,12,13,14. هنا وصفنا استخدام هذا النهج لفصل وتنقية الجزيئات الصغيرة والببتيدات من النبات الطبي Gymnema sylvestre. سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على تركيز وتنقية الجزيئات الصغيرة النشطة من مستخلص نباتي لتطبيقات المصب بتكلفة منخفضة. بالإضافة إلى ذلك، نبرهن أيضًا على أن إثراء البروتينات من مستخلص بروتين معقد من فطر المبيضات ألبيكان 15 في هذا النظام القائم على IEF كمثال ثان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الإعداد والطور المسبق لوحدة IEF القياسية السائلة المرحلة

  1. تجميع الأقطاب الكهربائية IEF السائل المرحلة (زر الأنود الأحمر وزر الكاثود الأسود) مع أغشية التبادل الخاصة بها وفقا لدليل التعليمات (انظر جدول المواد). اكويت أغشية تبادل أنيون مع 0.1 M NaOH وأغشية تبادل الموجبة مع 0.1 M H3PO4 على الأقل لمدة 16 ساعة عند استخدام أغشية جديدة.
    1. تخزين الأغشية في الشوارد (0.1 M NaOH أو 0.1 M H3PO4) بين أشواط ولا تسمح لتجف.
  2. تجميع الجزء الداخلي والخارجي من القطب الكهربائي عن طريق محاذاة ثلاثة ثقوب مستطيلة في الحشيات تبادل الأيونات. تعبئة الأقطاب الكهربائية مع الشوارد على التوالي (~ 25-30 مل) لمنع أغشيتها من الجفاف.
    1. لا تضيف فائض (أكثر من 1/3rd من حجم غرفة القطب) المنحل بالكهرباء التي قد تزيد الضغط داخل القطب الكهربائي وتسبب التسرب.
  3. تغطية المنافذ مجموعة عينة مع ختم الشريط الذي يأتي مع أجزاء تجميع الصك (انظر جدول المواد). يمكن تحديد جانب منافذ تجميع العينات بواسطة دبابيس محاذاة المعادن العمودية. بدلاً من ذلك، استخدم شريط الختم القياسي لختم المنافذ.
  4. تجميع جميع أجزاء من الجمعية غرفة التركيز في تسلسل (القطب القطب، النايلون غشاء الأساسية، والتركيز غرفة وكاثود القطب) على إصبع التبريد السيراميك.
  5. املأ غرفة التركيز بالماء المقطر المُبرَّر (الحجم الإجمالي 60 مل لخلية IEF القياسية) باستخدام حقنة 50 مل.
  6. قم بتوصيل جهاز IEF السائل المرحلة إلى مياه التبريد المتداولة في 4 درجة مئوية وprerun الوحدة في 15 واط و 3000 V لمدة 3-5 دقيقة أو حتى يستقر الجهد.
    ملاحظة: عموما، في غضون دقيقة واحدة، وسوف يصل الجهد إلى أقصى القيم المحددة. يساعد الركض المسبق مع الماء المقطر على إزالة الأيونات المتبقية من غرفة التركيز ولب غشاء النايلون.
  7. قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وإزالة الماء من الخلية باستخدام جامع الكسور. إعادة ختم منافذ جمع مع ختم الشريط.
    ملاحظة: الآن الصك جاهز للاستخدام في الخطوة 2.4.

2. فصل وتنقية الجزيئات الصغيرة والببتيدات من استخراج sylvestre Gymnema

  1. قياس 0.6 غرام من استخراج النبات وتذوب في الماء المقطر (60 مل) عن طريق خلط في أنبوب الأسطوانة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي عينة بيولوجية قابلة للذوبان وخالية من الملح للفصل والتنقية باستخدام أداة IEF هذه. ويمكن استخدام عينات مع تركيز الملح التخزين المؤقت تصل إلى 10 mM مع انخفاض طفيف في القرار. نحن مهتمون في عائلة سابونين من مركبات ثلاثية التربيربنويد، والأحماض الرياضية، من مصنع G. Sylvestre لخصائصها المضادة للفطريات فريدة من نوعها16.
  2. الطرد المركزي مستخلص مصنع solubilized في 10،000 س ز لمدة 5 دقائق لإزالة الجسيمات غير قابلة للذوبان.
  3. نقل فائقة (~ 60 مل) إلى أنبوب 80 مل الطرد المركزي، ومزجها مع 0.6 مل من أمفوليت (pH 3-10) إلى 1٪ (v/v).
  4. اتبع الخطوات 1.1 - 1.7 لإعداد وحدة IEF في المرحلة السائلة. الغرفة الآن جاهزة لتحميل العينة.
  5. استخدام حقنة 50 مل مع 1-1/2 بوصة 19 غ إبرة نهاية حادة (يأتي مع الصك) وتحميل العينة المعدة مع أمفوليت (60 مل مجموع) في الخلية من خلال منافذ جمع العينة.
  6. إزالة فقاعات الهواء من خلية العينة عن طريق إزالة خلية التركيز من موقف والتنصت على غرفة القطب لإزاحة الفقاعات. وجود فقاعات الهواء سوف يسبب الجهد والتقلبات الحالية وتؤثر على المدى.
  7. قم بتوصيل الوحدة بمبرد الماء (4 درجات مئوية) وابدأ تجزئة التيار الكهربائي مع التيار الكهربائي عند 15 واط ثابت.
  8. تشغيل الجهاز لمدة 3 ساعة أو حتى يصل الجهد إلى قيمة ثابتة.
    ملاحظة: مع بدء التركيز على العينة، سيبدأ الجهد في التسلق تدريجياً حتى يصل إلى قيمة ثابتة.
  9. بعد المدى، والاستعداد لجمع الكسور في مربع الحصاد (التي تحتوي على 20 أنابيب بلاستيكية، 12 مم × 75 ملم، 5-6 مل حجم) متصلة مضخة فراغ عن طريق الضغط على زر الحصاد على في وحدة IEF.
  10. محاذاة دبابيس مجموعة 20 مع منافذ مجموعة 20 من الخلية التركيز التي يتم مختومة مع الشريط.
  11. دفع دبابيس جمع من خلال الشريط ختم وتحويل مضخة فراغ ON في وقت واحد (انظر الشكل 2B، 2C و 2D).
    ملاحظة: سيتم جمع حوالي 3 مل كسور من كل غرفة في الأنابيب في كل مرة. ويمكن استخدام الكسور في التطبيقات اللاحقة للمصب (SDS-PAGE من أجل القياس الكمي للببتيد، TLC والباس الحيوي للجزيئات الصغيرة).

3. فصل وتنقية البروتينات من C. albicans

  1. تنمو مستعمرة واحدة من c. albicans في الخميرة بيبتون ديكستروز (YPD) مرق16 في 30 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) لليلة واحدة.
  2. جمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي (10000 س ز لمدة 5 دقائق).
  3. تعليق C. albicans خلايا الخميرة في كربونات الأمونيوم (1.89 ز / لتر) العازلة التي تحتوي على 1٪ (الخامس / الخامس) بيتا mercaptoethanol (β-ME) (1/10th من حجم الثقافة) وتدوير في أنبوب الأسطوانة لمدة 1 ساعة في 5 °C15.
  4. إزالة خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي (10،000 س ز لمدة 5 دقائق) وتصفية استخراج البروتين من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر.
    ملاحظة: يمكن إعداد عينات البروتين من السيتوبول اليبيكان، والغشاء أو جدار الخلية واستخدامها لتجزئة IEF. وبالمثل، يمكن استخدام البروتينات من البكتيريا أو العينات البيولوجية الأخرى (مستخلص الأنسجة الحيوانية) بعد إزالة أي ملح بالطرق المناسبة(على سبيل المثال،عن طريق غسيل الكلى أو باستخدام أعمدة إزالة ماء).
  5. Dialyze استخراج البروتين في أنابيب غسيل الكلى (3500 MWCO) ضد المياه لمدة 15 ساعة في 4 درجة مئوية. تقدير تركيز البروتين بواسطة طريقة برادفورد صبغ ملزمة باستخدام غاما الجلوبيولين كمعيار17.
  6. استخدام 500 ملغ من البروتين الكلي في 60 مل من الماء التي تحتوي على 1٪ (v/v) أمفوليت (درجة الHH 5-8) للكسر.
    ملاحظة: منذ ampholyte واسعة النطاق (pH 3-10) لا يثري بعض غير جلوكان الخلوية المرفقة بروتينات جدار من C. albicans جيدا، واستخدام ampholyte ضيق النطاق (pH 5-8) ampholyte. ويمكن استخدام تركيز الأمفوليت بنسبة تصل إلى 2٪ إذا كان تركيز البروتين العينة أكثر من 2 ملغ / مل; وهذا يقلل من تجميع البروتين أثناء التركيز. دائماً إبقاء العينات، أمبيركوليتس، والمياه مُبَرَّكة على الجليد.
  7. كرر الخطوات 1.1-1.7 لإعداد وحدة IEF واستخدام محلول البروتين من الخطوة 3.6 لتحميل في خلية IEF.
  8. بعد 4 ح من التركيز على ثابت 15 W، وجزئ البروتين الحصاد (1-20) كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.9-2.11) وتحليل على 12.5٪ SDS-PAGE بعد تقليل وغليان عينات البروتين18.
  9. وصمة عار البروتينات حلها عن طريق تلطيخ هلام SDS-PAGE مع صبغة زرقاء Coomassie (0.01٪) حل ل 2-3 ح في درجة حرارة الغرفة على الروك. Destain هلام وتسجيل صورة هلام باستخدام صورة هلام.
    ملاحظة: صبغة كوزقة Coomassie (0.01%) يمكن إعدادها عن طريق خلط 0.01 غرام من مسحوق Coomassie الأزرق في محلول destaining تحتوي على 40٪ الميثانول و 10٪ حمض الخليك.

4. النشاط الحيوي من الجزيئات الصغيرة النقية من استخراج النباتات Gymnema sylvestre

  1. زراعة C. albicans في خلايا الخميرة كما هو الحال في الخطوة 3.1.
  2. لإعداد تعليق الخلية، وتمييع ثقافة بين عشية وضحاها من C. albicans خلايا الخميرة (1/1000 تخفيف) في خلية جديدة من الخلايا المتخصصة في الزرع المتوسطة تكملها مع 50 mM الجلوكوز.
    ملاحظة: C. albicans يحول من نمو الخميرة إلى الواصلة تحت ظروف تحريض الواصلة (RPMI في 37 درجة مئوية). وتظهر جزيئات صغيرة حمض Gymnemic لمنع تحويل خلايا الخميرة في hyphae تحت شروط تحريض hypha16. ونحن تهدف إلى تحديد ما إذا كان السائل المرحلة IEF فصل استخراج Sylvestre تحتوي على هذه الجزيئات النشطة بيولوجيا.
  3. من نظام التعليق الخلوي المعد، أضف 90 ميكرولتر إلى كل بئر من الـ 96 بئر.
  4. من كل كسر (1-20 الكسور المقطوعة من استخراج G. Sylvestre التي تم الحصول عليها من المرحلة السائلة IEF، الشكل 4)،إضافة 10 ميكرولتر في الآبار مع 90 ميكرولتر من تعليق الخلية أعلاه (الخطوة 4.2). إجراء المقايسة في ثلاث ة.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من الماء الذي يحتوي على أمبيروليت (1%) في آبار منفصلة مع 90 ميكرولتر من C. albicans تعليق خلية الخميرة كتحكم سلبي.
    ملاحظة: ampholytes لديها إمكانية النشاط الحيوي، ولذلك فمن الضروري أن تشمل السيطرة على أمفورسليت أثناء تنفيذ أي بيوراسا19.
  6. احتضان لوحة 96-well في 37 °C لمدة 12 ساعة ومراقبة تثبيط C. albicans الخميرة إلى hypha التحويل تحت المجهر16. أيضا، تحديد النسبة المئوية لتثبيط تحويل الخميرة إلى هيفا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فصل وتنقية الجزيئات الصغيرة والببتيدات من استخراج مصنع سيمانيما
باستخدام طريقة IEF المرحلة السائلة المحض، نحن كسور مستخلصات النباتات الطبية والبروتينات سطح الخلايا من الفطريات المسببة للأمراض البشرية، C. albicans. يتم عرض مخطط من بروتوكولات الكسر هذه في الشكل 1.

من 20 كسور من استخراج G. Sylvestre التي تم الحصول عليها من المرحلة السائلة IEF، تم العثور على جزيئات داكنة اللون (السابونينات تيربينويد) للهجرة وإثراء في نهاي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشمل الجزيئات الصغيرة من مصادر المنتجات الطبيعية (مثل النباتات) نواتج مستقلبات ثانوية معقدة شديدة التنوع في التركيب الكيميائي. ويعتقد أنها تشارك في آليات الدفاع النباتية. وبالإضافة إلى ذلك، توجد أيضا في الأنسجة النباتية polypeptides22. هذه الجزيئات الصغيرة المنتج الطبيعي هي مصادر غنية من جزيئات الاختبار لاكتشاف المخدرات والتنمية. ومع ذلك، فإن الطرق الصعبة والمملة اللازمة لعزلها وتنقيتها تحد من استخدامها للتطبيقات العلاجية. ويُبرز نهج المرحلة السائلة من IEF المستخدم في هذا التقرير القدرة على فصل ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود أصحاب البلاغ أن يعلنوا عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون لمصادر التمويل من شعبة علم الأحياء ومركز جونسون لأبحاث السرطان لجوائز BRIEF و IRA ، على التوالي إلى GV. كما نشكر جائزة K-INBRE ما بعد الدكتوراه إلى RV. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل جائزة التنمية المؤسسية (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم منحة P20 GM103418. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة أو المعاهد الوطنية للصحة. نشكر المراجعين المجهولين على تعليقاتهم المفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.45 وميكرو ؛ مرشح المحقنة mفيشر ساينتفيك09-720-004
2-MercaptoethanolSigmaM3148
كربونات الأمونيومSigma-Aldrich207861-500
Bio-Lyte 3/10 AmphollyteBio-Rad163-1113
Bio-Lyte 5/8 AmphollyteBio-Rad163-1192
ترموستات درجة حرارة منخفضة مدمجLauda - BrinkmannRM 6Tاضبط تبريد المياه على 4 درجة مئوية ويمكن تشغيله حتى عند 0 درجة مئوية كما هو الحال عندما يمر عبر قلب التبريد Rotofor ، ستكون درجة حرارة الماء المتداولة حوالي 5 أو أكثر حسب الجهد.
Coomassie Brilliant Blue RSigma-AldrichB7920
(3,500 MWCO)Spectrum Spectra / Por132112T
مسحوق مستخلص أوراق نبات Gymnema (>25٪ أحماض الجمباز)سوان فارما ، رفيق مختبر حاضنة نيوجيرسي الولايات المتحدة
الأمريكية SI 300R
مجهرLeicaDM 6B
Mini protean مقياس الأس الهيدروجيني للرحلانالكهربائي Bio-Rad
Mettler ToledoS20مفيد لتحديد درجة الحموضة لأجزاء Rotofor (IEF ذات الطور السائل)
RotoforBio-Rad170-2972http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (دليل تعليمات Rotofor لتجميع الوحدة)
RPMI-1640 MediumHyCloneDH30255.01
شريط الختمBio-Rad170-2960سكوتش.
Sorvall legend micro 17 جهاز طرد مركزيThermo Scientific75002432
TPP لوحة ثقافة الأنسجة -96 بئر قاعمسطح TPPTP92696
أنابيب غسيل الكلى يمكن أيضا استخدام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
  2. Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
  3. Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
  4. Vesterberg, O. A. Y. Method of Isoelectric Fractionation. , US3485736A (1964).
  5. Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
  6. Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , Elsevier Science. 1(1983).
  7. Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
  8. Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
  9. Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
  10. Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
  11. Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
  12. Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
  13. Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
  14. Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
  15. Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
  16. Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189(2013).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  19. Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
  20. Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
  21. Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
  22. Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
  23. Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
  24. Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
  25. Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328(2019).
  26. Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS

مقالات ذات صلة