مقالة منهجية

عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز

10.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61167

⸱

مايو 10, 2020

 ,  , 
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

في هذه المقالة

ملخص

قدم هو بروتوكول لعزل القلب البطيني البشري والحيواني من شرائح عضلة القلب قطع هزاز. يمكن الحصول على غلة عالية من الخلايا المتحملة للكالسيوم (تصل إلى 200 خلية/ملغ) من كميات صغيرة من الأنسجة (<50 ملغ). البروتوكول ينطبق على عضلة القلب المعرضة لاقفوية البرد لمدة تصل إلى 36 ساعة.

الملخص

إن عزل الخلايا العضلية القلبية البطينية عن قلوب الحيوانات والبشر هو طريقة أساسية في أبحاث القلب. عادة ما يتم عزل الخلايا القلبية الحيوانية عن طريق التسريب التاجي مع الإنزيمات الهضمية. ومع ذلك، فإن عزل عضلة القلب البشرية يشكل تحدياً لأن عينات عضلة القلب البشرية عادة لا تسمح بالانكسار التاجي، وتؤدي بروتوكولات العزل البديلة إلى نقص الغلة للخلايا القابلة للحياة. بالإضافة إلى ذلك، فإن عينات عضلة القلب البشرية نادرة ولا تتوفر إلا بانتظام في المؤسسات التي جراحية في القلب في الموقع. وهذا يعوق ترجمة النتائج من الحيوانات إلى أمراض القلب البشرية. هو موضح هنا بروتوكول موثوق به التي تمكن من عزل فعالة من myocytes البطينية من عضلة القلب الحيوانية والبشرية. لزيادة نسبة السطح إلى الحجم مع تقليل تلف الخلايا، يتم توليد شرائح أنسجة عضلة القلب 300 ميكرومتر سميكة من عينات عضلة القلب مع هزاز. ثم يتم هضم شرائح الأنسجة مع البروتياز والكولاجيناز. تم استخدام عضلة القلب الجرذ لإنشاء البروتوكول وقياس غلة الخلايا myocytes القابلة للحياة والمتحملة للكالسيوم عن طريق عد الخلايا الخلوية المتدفقة. وأظهرت المقارنة مع طريقة قطعة الأنسجة المستخدمة بشكل شائع عوائد أعلى بكثير من خلايا القلب على شكل قضيب (41.5 ± 11.9 مقابل 7.89 ± 3.6٪، p < 0.05). وقد تُرجم البروتوكول إلى عضلة القلب البشرية الفاشلة وغير الفاشلة، حيث كانت الغلة مماثلة كما في عضلة القلب الجرذ، ومرة أخرى، أعلى بشكل ملحوظ مما كانت عليه مع طريقة قطعة الأنسجة (45.0 ± 15.0 مقابل 6.87 ± 5.23 خلية/ملغم، p < 0.05). وتجدر الإشارة إلى أنه مع تقديم البروتوكول من الممكن عزل أعداد معقولة من خلايا القلب القلبية البشرية القابلة للحياة (9-200 خلية/ملغ) من كميات دنيا من الأنسجة (<50 ملغ). وبالتالي، فإن الطريقة تنطبق على عضلة القلب صحية وفشل من قلوب الإنسان والحيوان على حد سواء. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لعزل myocytes مثير وانكماشية من عينات الأنسجة البشرية المخزنة لمدة تصل إلى 36 ح في حل القلب النابل البارد، مما يجعل الأسلوب مفيدا بشكل خاص للمختبرات في المؤسسات دون جراحة القلب في الموقع.

المقدمة

تقنية المنوية التي مهدت الطريق إلى رؤى هامة في علم وظائف الأعضاء cardiomyocyte هو عزل القلب البطيني الحية من قلوب سليمة1. يمكن استخدام خلايا القلب المعزولة لدراسة الهيكل الخلوي الطبيعي والوظيفة ، أو عواقب التجارب الحية. على سبيل المثال، لتقييم التغيرات في الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية أو اقتران الإثارة والانكماش في النماذج الحيوانية لمرض القلب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام خلايا القلب المعزولة لثقافة الخلايا، والتدخلات الدوائية، ونقل الجينات، وهندسة الأنسجة، والعديد من التطبيقات الأخرى. ولذلك، أساليب فعالة لعزل القلب و القلب هي ذات قيمة أساسية للبحوث القلب الأساسية والترجمة.

عادة ما يتم عزل الخلايا القلبية من الثدييات الصغيرة ، مثل القوارض ، ومن الثدييات الكبيرة ، مثل الخنازير أو الكلاب ، عن طريق ضخ القلب التاجي مع حلول تحتوي على الكولاجين الخام و / أو البروتياز. وقد وصفت هذه الطريقة بأنها "معيار الذهب" لعزل القلب والخلايا العضلية، مما أدى إلى غلة تصل إلى 70٪ من الخلايا القابلة للحياة2. وقد استخدمت أيضا النهج مع قلوب الإنسان، مما أدى إلى نتائج القلب وكوسومييت مقبولة3،4،5. ومع ذلك، لأن الضخ التاجي هو ممكن فقط إذا كان القلب سليمة أو إسفين كبير عضلة القلب التي تحتوي على فرع الشريان التاجي هو متاح، معظم العينات القلبية البشرية ليست مناسبة لهذا النهج نظرا لصغر حجمها وعدم وجود الأوعية الدموية المناسبة. ولذلك ، فإن عزل القلب البشري هو التحدي.

عينات عضلة القلب الإنسان تتكون في الغالب من قطع الأنسجة ذات الحجم المتغير (حوالي 0.5 × 0.5 × 0.5 سم إلى 2 × 2 × 2 سم) ، تم الحصول عليها من خلال الخزعات الرحمية6، استئصالات الحاجز7، زرع VAD8، أو من قلوب explanted9. تبدأ الإجراءات الأكثر شيوعًا لعزل القلب والأنسجة باستخدام المقص أو المشرط. ثم يتم تعطيل الاتصالات من خلية إلى خلية عن طريق الانغماس في مخازن خالية من الكالسيوم أو منخفضة الكالسيوم. ويتبع ذلك خطوات الهضم المتعددة مع مستخلصات الإنزيم الخام أو الإنزيمات المنقية مثل البروتياز (مثل التربسين) والكولاجيناز والهيلورونيداز أو الإلستاز مما يؤدي إلى تفكك المصفوفة خارج الخلية وتحرير خلايا القلب. في الخطوة النهائية، الحرجة، تركيز الكالسيوم الفسيولوجية يجب أن يتم استعادتها بعناية، أو يمكن أن يحدث تلف الخلوية بسبب الكالسيوم مفارقة10،11،12. وهذا النهج العزلي ملائم ولكنه غير فعال عادة. على سبيل المثال، وجدت إحدى الدراسات أن ما يقرب من 1 غرام من أنسجة عضلة القلب كان مطلوبا للحصول على عدد كاف من خلايا القلب المناسبة للتجارب اللاحقة13. أحد الأسباب المحتملة لانخفاض الغلة هو طريقة قاسية نسبيا من مفروم الأنسجة. وهذا قد يضر بشكل خاص cardiomyocytes الموجودة على حواف قطعة على الرغم من أن هذه myocytes هي الأكثر احتمالا أن يطلق سراحه عن طريق الهضم الأنزيمي.

جانب آخر قد يؤثر على كفاءة العزل وجودة الخلايا التي تم الحصول عليها من عينات الإنسان هو مدة نقص التروية الأنسجة. تذكر معظم البروتوكولات أوقات النقل القصيرة إلى المختبر كشرط مسبق لتحقيق نتائج جيدة. هذا يحد من دراسة القلب البطينية البشرية إلى المختبرات مع مرافق جراحة القلب القريبة. معا، هذه القيود تعوق التحقق من النتائج الهامة من النماذج الحيوانية في أمراض القلب البشرية. بروتوكولات العزل المحسنة التي تسمح لعوائد القلب و القلب عالية من كميات صغيرة من الأنسجة، ويفضل دون أضرار جسيمة بعد تمديد أوقات النقل، ولذلك من المرغوب فيه.

وصف هنا هو بروتوكول العزل على أساس الهضم الأنزيمي من شرائح رقيقة الأنسجة عضلة القلب ولدت مع هزاز14،15. نثبت أن العزلة عن شرائح الأنسجة أكثر كفاءة بكثير من تلك التي من قطع الأنسجة المفروم مع مقص. الطريقة الموصوفة لا يسمح فقط لغلة عالية من القلب البشري قابلة للحياة من كميات صغيرة من أنسجة عضلة القلب ولكن ينطبق أيضا على العينات المخزنة أو المنقولة في محلول القلب النابل البارد لمدة تصل إلى 36 ساعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب مع الفئران من قبل لجنة العناية الحيوانية واستخدام ميتيلفرانكنكن، بافاريا، ألمانيا. وقد وافقت مجالس المراجعة المؤسسية لجامعة إرلانغن - نورمبرغ وجامعة روهر بوخوم على جمع عينات من أنسجة القلب البشرية واستخدامها. أجريت الدراسات وفقا للمبادئ التوجيهية إعلان هلسنكي. أعطى المرضى موافقتهم الخطية المستنيرة قبل جمع الأنسجة.

تم الحصول على فئران Wistar (150-200 غرام) تجارياً، وتم تخديرها عن طريق حقن 100 ملغم/كغم من الثيوبنتال-الصوديوم داخل التوازن، والقتل الرحيم بخلع عنق الرحم يليه استئصال الصدر واستئصال القلب. تم جمع عينات الأنسجة القلبية البشرية من القلب البطيني الأيسر أثناء زرع أجهزة المساعدة الميكانيكية ، من استئصال النخاع الحاجز ، من رباعية الجراحة التصحيحية Fallot ، أو من الجدار البطيني الأيسر الحر للقلوب explanted. يصف البروتوكول التالي العزلة عن الأنسجة البطينية البشرية. تم إجراء عزل الجرذان cardiomyocytes وفقا لذلك، ولكن مع إنزيمات مختلفة (انظر جدول المواد). ويوضَّح في الشكل 1سير عمل تخطيطي للبروتوكول.

1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول والإنزيمات

  1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول كما هو موضح في الجدول 1.
  2. الاحماء حلول 1، 2، 3 والحل Tyrode المعدلة إلى 37 درجة مئوية. تخزين الحل القطع في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: بالنسبة لشرائح عضلة القلب 1-2 يلزم ما مجموعه 15 مل و8 مل و5 مل من الحلول 1 و2 و3 لعزل طبق زراعة الأنسجة 35 مم. توسيع نطاق وفقا لعزل myocyte في وقت واحد في أطباق متعددة. يمكن تجميد حل القطع والاحتفاظ به عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
  3. تزن 1 ملغ من البروتينات 24 (انظر جدول المواد)في أنبوب الطرد المركزي 15 مل قبل التل وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. هذا لمعالجة عينة واحدة. رفع حجم المبلغ وفقا لذلك. لا تخلط البروتينات والكولاجيناز.
  4. تزن 8 ملغ من الكولاجين CLSI (انظر جدول المواد)في أنبوب الطرد المركزي 15 مل prechilled وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. هذا لمعالجة عينة واحدة. رفع حجم المبلغ وفقا لذلك. لا تخلط البروتينات والكولاجيناز.
    تنبيه: ارتدي قناع الوجه أو اعمل تحت غطاء الدخان لتجنب استنشاق مسحوق الإنزيم.
    ملاحظة: قد يختلف نشاط الإنزيم في حصص مختلفة. ولذلك، قد تختلف التركيز الأمثل وينبغي تحديد مع كل انزيم شراؤها حديثا16.

2. تخزين ونقل الأنسجة عضلة القلب

  1. تخزين ونقل عينات القلب الإنسان في تبريد، 4 ° C حل القطع(الجدول 1).
  2. استخدم نفس الحل لمزيد من معالجة الأنسجة وتشريح الاهتزاز.
    ملاحظة: يجب نقل الخزعات وعينات القلب الجراحية على الفور إلى محلول القطع عند 4 درجات مئوية ويمكن بعد ذلك تخزينها أو نقلها عند 4 درجات مئوية بحد أقصى 36 ساعة قبل تطبيق هذا البروتوكول.

3. تجهيز وتقطيع الأنسجة

ملاحظة: بروتوكول تشريح الأنسجة يتبع فيشر وآخرون15.

  1. تقليم كتلة الأنسجة
    تنبيه: أنسجة القلب البشرية قد تكون معدية. استخدم التآكل الواقي دائمًا واتبع لوائح السلامة في مؤسستك. التعامل بعناية مع شفرات المستخدمة والتخلص في حاويات السلامة.
    1. ضع العينة في طبق ثقافة الأنسجة 100 مم المليء بمحلول القطع البارد 20 مل والحفاظ على لوحة تبريد 4 درجات مئوية.
    2. إزالة الأنسجة الليفية الزائدة والدهون الايكليفية مع مشرط. في حالة وجود عينة عبر الطبيعة، إزالة الترابيكولا وطبقات الأنسجة بالقرب من بطانة القلب.
      ملاحظة: الأنسجة الليفية قاسية ويبدو أبيض. الدهون عادة لينة ويظهر الأبيض إلى الأصفر. يمكن تحديد طبقات الأنسجة الترابيكولاية والأنسجة الداخلية من تكوين الأنسجة الفضفاضة واتجاه الألياف غير المناصفة مقارنة بـ myocardium من الطبقات الايقعية
    3. لمعالجة الاهتزاز الأمثل، قطع كتل الأنسجة المستطيلة من حوالي 8 مم × 8 مم × 8 مم مع مشرط من عينة الأنسجة أكبر. بالنسبة للخزعات الصغيرة، تخطي هذه الخطوة والانتقال إلى agarose تضمين.
  2. تضمين أنسجة القلب في أغاروز منخفض الذوبان
    1. يغلي 400 ملغ من نقطة ذوبان منخفضة agarose في 10 مل من حل القطع في كوب زجاجي.
      تنبيه: ارتدي القفازات ونظارات السلامة لتجنب الحروق. التعامل مع الأواني الزجاجية الساخنة فقط مع ارتداء الحماية من الحرارة.
    2. ملء حقنة 10 مل مع الساخنة، هلام agarose المذاب. ختم الحقنة والسماح agarose لتكواسير في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    3. استخدام ملقط لوضع العينة القلبية أو خزعة قلصت في نظيفة 35 ملم طبق زراعة الأنسجة مع epicardium التي تواجه أسفل وإزالة السوائل الزائدة مع مسحة معقمة.
    4. صب agarose توازنها (الخطوة 3.2.2) على الأنسجة عن طريق تفريغ الحقنة. تأمين الأنسجة ضد الحركة مع ملقط في حين صب agarose. تأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما في agarose.
    5. وضع على الفور الطبق على الجليد والسماح لأغاروز ترسيخ لمدة 10 دقيقة.
  3. تشريح عضلة القلب
    1. قم بتركيب شفرة حلاقة جديدة إلى حامل الشفرة من الاهتزاز ومعايرة الاهتزاز عن طريق ضبط انحراف z-من النصل إذا كان ذلك ممكنا.
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول اهتزازًا مع جهاز معايرة بمساعدة الأشعة تحت الحمراء لمحاذاة النصل في موضع أفقي مع الحد الأدنى من انحراف z (الانحراف المقاس < 0.1 ميكرومتر).
    2. استخدام مشرط لمعالجة كتلة agarose الأنسجة التي تناسب حامل العينة من هزاز. لضمان الاستقرار، تأكد من أن الأنسجة لا تزال مغمورة بما فيه الكفاية في agarose (أجاروز هوامش ≥ 8 مم).
    3. إصلاح كتلة agarose إلى حامل العينة مع طبقة رقيقة من الغراء سيانوكريلات والضغط لطيف.
    4. ضع حامل العينة مع الأنسجة في حمام الاهتزاز. ملء الحمام مع حل القطع والحفاظ على 4-6 درجة مئوية في جميع أنحاء تجهيز مع الثلج سحقت، مليئة في خزان التبريد الخارجي من هزاز.
    5. توليد 300 ميكرون شرائح سميكة مع سرعة تقدم من ≤ 0.1 مم / ث، وتواتر متذبذب من 80 هرتز، و واسعة جانبية من 1.5 ملم، وزاوية شفرة من 15 درجة. عند التعامل مع شرائح, عقد agarose بدلا من الأنسجة نفسها لتجنب تلف الأنسجة. تخزين شرائح في الحل القطع في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها 2 ساعة، إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يتم توجيه Cardiomyocytes بالتوازي مع epicardium. ولذلك، من المهم أن تقطع بالتوازي مع epicardium لتجنب الضرر myocyte المفرط. فمن المستحسن أن نتخلص من أول 1-3 شرائح، كما ينبغي استخدام شرائح موحدة فقط من سمك ثابت لعزل. بالنسبة للخزعات النسيجية الصغيرة، مع ذلك، تخلص فقط من الشريحة الأولى.
    6. تحقق من محاذاة cardiomyocyte تحت مجهر ضوء قياسي مع تكبير 40-100x.

4. هضم الأنسجة

  1. وضع لوحة الحرارة على شاكر المختبر والدفء إلى 37 درجة مئوية. بدء شاكر المختبر في 65 دورة في الدقيقة.
  2. قم بحل البروتينات (المعدة في الخطوة 1.3) في 2 مل من الحل 1 (الخطوة 1.1 و 1.2) واحتضان في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. لا تخلط البروتينات والكولاجيناز.
  3. قم بحل الكولاجيناز (المعد في الخطوة 1.4) في 2 مل من الحل 1 (الخطوة 1.1 و 1.2) واحتضان في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. لا تخلط البروتينات والكولاجيناز.
    تنبيه: ارتداء النظارات الواقية والقفازات، لأن الإنزيمات المذابة يمكن أن تسبب إصابات في الجلد والعين.
  4. إضافة كلوريد الكالسيوم (CaCl2) إلى محلول الكولاجين الذي يحتوي على (المعد في الخطوة 4.3) إلى تركيز نهائي من 5 ميكرومتر.
  5. استخدام ملقط لنقل شريحة من الأنسجة من حمام هزاز نظيف 60 ملم طبق ثقافة الأنسجة مليئة 5 مل من محلول القطع prechilled (الخطوة 1.1 و 1.2) والحفاظ على الجليد.
  6. قم بإزالة الأاروز بعناية من أنسجة عضلة القلب مع شفرة أو ملقط.
    ملاحظة: تجنب التوتر الزائد والإجهاد القص على شرائح عضلة القلب، لأنها يمكن أن تلحق الضرر بتي في عضلة القلب.
  7. لتنفيذ الغسيل الأولي، ضع طبق زراعة الأنسجة 35 مم على لوحة الحرارة وملئه بـ 2 مل من محلول ما قبل ال تدفئة (37 درجة مئوية) 1. نقل 1-2 شرائح عضلة القلب إلى طبق المعدة مع ملقط. استلهم الحل مع ماصة 1 مل وتنفيذ خطوات الغسيل 2x لإزالة بقايا الحل القطع.
    ملاحظة: لا تتبخر شرائح القلب. يجب أن تبقى الحلول والشرائح عند درجة حرارة ثابتة 35 درجة مئوية على لوحة الحرارة المهتاجة. ضبط درجة حرارة لوحة الحرارة إذا لزم الأمر.
  8. إزالة الحل 1 من الطبق وإضافة 2 مل من محلول البروتينات (الخطوة 4.2). احتضان لمدة 12 دقيقة على لوحة الحرارة في 65 دورة في الدقيقة.
  9. غسل 2x مع 2 مل من محلول ما قبل الدفء 1 (37 درجة مئوية).
  10. إزالة الحل 1 من الطبق وإضافة 2 مل من محلول الكولاجيناز (الخطوتين 4.3 و 4.4). احتضان ما لا يقل عن 30 دقيقة على لوحة الحرارة في 65 دورة في الدقيقة.
  11. تحقق من وجود myocytes الفردية مجانا في 30، 35، 40 دقيقة، الخ، عن طريق وضع الطبق تحت المجهر الخفيف. العمل بسرعة لتجنب تبريد كبير من الحل.
    ملاحظة: قد يختلف وقت الهضم المطلوب وفقًا لدستور الأنسجة ودرجة التليف. بمجرد أن يحصل على الأنسجة لينة بشكل واضح ويفصل بسهولة عندما سحبت بلطف، وقد تم التوصل إلى وقت الهضم الأمثل. إذا كان هناك ما يكفي من الأنسجة المتاحة، يمكن هضم عدة شرائح بالتوازي مع أوقات الهضم متفاوتة.
  12. عندما يتم هضم الأنسجة و myocytes الفردية مرئية (الخطوة 4.11)، 2x غسل مع 2 مل من محلول ما قبل الدفء 2 (37 درجة مئوية) وملء مرة أخرى مع 2 مل.

5. تفكك الأنسجة

  1. افصل شرائح الأنسجة المهضمة بالملقط عن طريق سحب الألياف عن بعضها البعض بعناية.
  2. دقيق الماصة عدة مرات مع ماصة باستور واحدة الاستخدام (قطر الافتتاح> 2 مم).
    ملاحظة: يمكن استخدام ملقط و pipetting الحث على الإجهاد الميكانيكية وتسبب تلف القلب. ومع ذلك، فهي خطوة حاسمة لفصل الخلايا. استخدام ملقط غرامة للحد من تلف الخلايا وتفكك بعناية شرائح إلى قطع أصغر.
  3. تحقق من وجود القلب على شكل قضيب المحررة تحت المجهر الخفيف.

6. إعادة إدخال تركيز الكالسيوم الفسيولوجي

  1. زيادة تركيز الكالسيوم ببطء من 5 μM إلى 1.5 mM بينما يهيج عند 35 درجة مئوية على لوحة الحرارة. استخدم 10 mM و 100 mM CaCl2 حلول الأسهم. الخطوات الموصى بها: 20، 40، 80، 100، 150، 200، 400، 800، 1،200، 1500 ميكرومتر.
  2. إزالة قطع الأنسجة غير مهضومة بعناية مع ملقط أو تصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون مع حجم المسام 180 μm في نهاية زيادة الكالسيوم.

7. إزالة عامل فك الميكانيكية

  1. وقف الانفعالات وإزالة ببطء ثلث المحلول (~ 700 ميكرولتر) من الأعلى مع ماصة 1000 ميكرولتر. تجنب طموح عضلة القلب.
    ملاحظة: إذا تمت إزالة الأنسجة غير المهضومة، سوف تتراكم في وسط الطبق، مما يسهل الطموح من محلول خال من الخلايا. إذا لم يكن كذلك، نقل محلول الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل والسماح للخلايا إلى الرواسب لمدة 10 دقيقة في 35 درجة مئوية، ثم الpirate 700 μL من عظمى والتخلص، resuspend الخلايا، ونقلها مرة أخرى إلى طبق ثقافة الأنسجة 35 ملم والمضي قدما في الخطوة 7.2.
  2. إضافة 700 μL من الحل 3 إلى الخلايا، واستئناف الانفعالات على لوحة الحرارة واحتضان لمدة 10 دقيقة.
  3. كرر الخطوات 7.1 و 7.2.
  4. نقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل والسماح للقلب العضلي إلى الرواسب لمدة لا تقل عن 10 دقيقة والحد الأقصى من 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو تدور في 50 × ز لمدة 1 دقيقة. إزالة supernatant تماما وإعادة تعليق في حل Tyrode تعديل أو المخزن المؤقت التجريب المطلوب.
    ملاحظة: يمكن تخزين اِكُناء القلب في محلول تيرود المعدل(الجدول 1)لعدة ساعات عند 37 درجة مئوية و5% CO2 قبل الاستخدام.
  5. تحقق من جودة الخلية باستخدام مجهر ضوء قياسي عند 40x و 200x تكبير.
    ملاحظة: يجب أن يكون حوالي 30-50٪ من خلايا القلب على شكل قضيب، على نحو سلس دون غشاء blebs، وعرض واضحة عبر التصدعات. فقط 5-10% من الخلايا القابلة للحياة يجب أن تظهر تقلصات عفوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتحقق من كفاءة العزل ، تم استخدام البروتوكول مع عضلة القلب الفئران ، وتمت مقارنة العدد الناتج من الخلايا myocytes قابلة للحياة مع الأرقام التي تم الحصول عليها عن طريق العزل عن طريق التسريب التاجي والعزلة عن قطع الأنسجة الصغيرة (عزل قطعة ، الشكل 2). تم إجراء عزل القطعة والعزلة عن شرائح الأنسجة من نفس القلوب. لعزل عن طريق الضخ التاجي، ومع ذلك، تم استخدام القلب كله. أسفرت الضخ التاجية في الغالب على شكل قضيب وعبرtriated cardiomyocytes. مع العزل من شرائح عضلة القلب لوحظت نسبة أقل من الخلايا على ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من أن عزل أمراض القلب الحية تأسست منذ أكثر من 40 عاما، ولا يزال شرطا مسبقا للعديد من النهج التجريبية في أبحاث القلب، فإنه لا يزال تقنية صعبة مع نتائج لا يمكن التنبؤ بها. يتم استخدام عزل Cardiomyocyte عن طريق ضخ الشرايين التاجية مع محلول الإنزيم عادة لقلوب الحيوانات الصغيرة ويسفر عن أعداد كبيرة من الخلايا القابلة للحياة. غير أن هذا يتطلب نظاماً وخبرة معقدين نسبياً. وعلاوة على ذلك، فإن معظم عينات الأنسجة البشرية ليست مناسبة لهذه الطريقة، نظرا لصغر حجمها أو عدم وجود فروع الشريان التاجي، مما يجعل أساليب جديدة لعزل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر أندرياس ديندورفر من مركز والتر بريندل للطب التجريبي، LMU ميونيخ، للمساعدة في بروتوكول تشريح. لتوفير عينات الأنسجة عضلة القلب البشرية نود أن نشكر الغزالي ميناباري وكريستيان هايم من قسم جراحة القلب، مستشفى جامعة إرلانجن، هندريك ميلتينج من معهد إريك وحنا كلسمان، جامعة روهر بوخوم ومهند الكسار من قسم أمراض القلب لدى الأطفال، مستشفى إرلانجن الجامعي. للحصول على الدعم مع تدفق cytometry نود أن نشكر سيمون فولكل وزملاؤه من مركز البحوث الترجمة (TRC)، مستشفى جامعة إرلانجن. ونود أيضا أن نشكر لورينز ماكارغو وسيلين غرونينغر من معهد علم وظائف الأعضاء الخلوية والجزيئية إرلانجن على الدعم الفني الممتاز.

وقد دعم هذا العمل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية، والمركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) في المستشفى الجامعي في جامعة إرلانغن نورنبرغ، وجامعة إرلانغن نورنبرغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > كيميائي < / قوي >
2،3-بوتانيديون مونوكسيمكارل روث3494.1نقاء > 99٪
ألبومين مصل بقريكارل روث163.2
CaCl 2< / sub>كارل روث5239.2
الكرياتين أحادي الهيدراتألفا إيسارB250009
الجلوكوزميرك50-99-7
هيبسكارل روث9105.3
KClكارل روثP017.1
KH2< / sub>PO4< / sub>Carl Roth3904.2
L-glutamicacid Fluka Biochemica49450
نقطة انصهار منخفضة الاغاروزكارلروث 6351.5
MgCl2< / sub> × 6H2< / sub>Oكارل روثA537.1
MgSO4< / sub>Sigma AldrichM-7506
NaClCarl Roth9265.1
NaHCO3< / sub>Carl Roth8551.2
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
Taurineسيجما ألدريتشT8691
< قوي > أصباغ < / قوي >
- 8 - ANEPPSثيرمو فيشر العلميD3167
فلو -4 صباحاثيرمو فيشر العلميF14201
فلوفولتثيرمو فيشر العلميF10488
< قوي > إنزيمات < / قوي>
كولاجيناز CLS النوع الأولورثينجتونLS004196يستخدم للأنسجة البشرية عند 4 مجم / مل < br / > (النشاط: 280 U / mg)
الكولاجيناز CLS النوع الثانيWorthingtonLS004176يستخدم لأنسجة الفئران عند 1.5 مجم / مل
(النشاط 330 U / mg)
البروتياز الرابعسيجما ألدريتشP8038يستخدم لأنسجة الفئران عند 0.5 مجم / مل
(النشاط & ge; 3.5 U / mg)
البروتيناز الرابع والعشرونSigma AldrichP5147يستخدم للأنسجة البشرية عند 0.5 مجم / مل
(النشاط: 7-14 U / mg)
<قوي > مادة < / قوي >
محلل خلية (LSR Fortessa) أنبوبBD Bioscience649225
Corning430790
، 50 ملCorning430829
شاكر مدمجإدموند ب & أومل. hlerKS-15 B التحكمفي اتجاه التحريض:
ماصات بلاستيكية أفقية يمكن التخلص منهاCarl RothEA65.1لخلية الخلية ، استخدم فقط الماصات ذات القطر الداخلي & ge ؛ ملقط 2 مم
FST11271-30
HeatblockVWRBARN88880030
مرشح نايلون صافي ، 180 وميكرو ؛ مMerckNY8H04700
TC Dish 100 ،Sarstedt83.3902
TC Dish 35 ،Sarstedtالقياسي 83.3900
TC Dish 60 ،Sarstedtالقياسي 83.3901
Vibratome (VT1200S)Leica1491200S001يتضمن VibroCheck لتصحيح الانحراف z بمساعدة الأشعة تحت
عشر الطرد المركزي ، أنبوب طرد مركزي الحمراء

المراجع

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116(2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47(2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة