Method Article

التنشيط البصري الوراثي للمسارات الوراثية في شرائح الدماغ وتعديل الاستجابات بواسطة التخدير المتطاير

DOI:

10.3791/61333

⸱

July 23rd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Wisconsin, 2Department of Anesthesiology, Rambam Health Care Campus, the Ruth and Bruce Rappaport Faculty of Medicine, Technion - Israel Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام شرائح الدماغ خارج الجسم الحي لدراسة آثار التخدير المتطاير على الاستجابات المستحثة للمدخلات القريبة. يتم استخدام علم البصريات الوراثي لتنشيط القشرة المهادية والقشرية بشكل مستقل إلى القشرة المخية الجديدة غير الأولية ، ويتم تعديل الاستجابات المشبكية والشبكة باستخدام الأيزوفلوران.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤثر التخدير على الوعي جزئيا من خلال أفعالهم على الدوائر القشرية المهادية. ومع ذلك ، فإن مدى تأثير التخدير المتطاير على المكونات الخلوية والشبكية المتميزة لهذه الدوائر لا يزال غير واضح. توفر شرائح الدماغ خارج الجسم الحي وسيلة يمكن للمحققين من خلالها التحقيق في المكونات المنفصلة للشبكات المعقدة وفك تشابك الآليات المحتملة الكامنة وراء آثار التخدير المتطاير على الاستجابات المستحثة. لعزل التأثيرات الدوائية المحتملة الخاصة بنوع الخلية ومسارها في شرائح الدماغ ، يجب أن يكون الباحثون قادرين على تنشيط مسارات الألياف القريبة بشكل مستقل ، وتحديد المجموعات غير المتداخلة من الخلايا ، وتطبيق التخدير المتطاير على الأنسجة في محلول مائي. في هذا البروتوكول ، يتم وصف طرق لقياس الاستجابات المستحثة بصريا لمسارين مستقلين مرتبطين بالقشرة المخية الجديدة في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي. يتم تسجيل الاستجابات خارج الخلية لفحص نشاط الشبكة ويتم إجراء تسجيلات مشبك رقعة الخلية الكاملة المستهدفة في الخلايا العصبية الداخلية الإيجابية للسوماتوستاتين والبارفالبومين. يتم وصف توصيل تركيزات الأيزوفلوران ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية عبر السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي لتعديل الاستجابات الخلوية والشبكية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام التخدير المتطاير في كل مكان في مجموعة متنوعة من الإعدادات السريرية والأكاديمية لأكثر من قرن. فئات متميزة من التخدير لها أهداف جزيئية فريدة من نوعها ، وغالبا ما تكون غير متداخلة1،2،3 ، ولكن جميعها تقريبا تنتج فقدان الوعي. في حين أن آثارها السلوكية يمكن التنبؤ بها تماما ، فإن الآليات التي يحفز بها التخدير فقدان الوعي غير معروفة إلى حد كبير. قد يؤثر التخدير في نهاية المطاف على كل من مستوى الوعي ومحتوياته من خلال الإجراءات على الدوائر القشرية ، مما يعطل تكامل المعلومات في جميع أنحاء التسلسل الهرمي القشري4،5،6،7،8،9. على نطاق أوسع ، قد يلعب تعديل الدوائر القشرية دورا في10 أو دوائيا 11 حالة وعي متغيرة تجريبيا ، وقد يكون متورطا أيضا في النوم 12 وفي الاضطرابات الفسيولوجية المرضية للوعي 13,14.

يمكن أن يعزى مراوغة الآليات الكامنة وراء فقدان الوعي وعودته أثناء التخدير جزئيا إلى الإجراءات غير الخطية والتآزرية للتخدير على المستويات الخلوية والشبكة والأنظمة15. على سبيل المثال ، يثبط الأيزوفلوران النشاط داخل مناطق الدماغ المختارة 16،17،18 ، ويضعف الاتصال بين مناطق الدماغ البعيدة 19،20،21،22،23 ، ويقلل من الاستجابات المشبكية بطريقة خاصة بالمسار24،25 . ما هي آثار التخدير ، من الجزيئي إلى مستوى الأنظمة ، ضرورية أو كافية لإحداث فقدان الوعي لا تزال غير واضحة. بالإضافة إلى التحقيقات السريرية الموضوعية للوعي باستخدام التقنيات غير الغازية19،20،26 ، من المهم أن يسعى التجريبيون إلى فك تشابك التفاعلات الخلوية والشبكة المتميزة التي تخدم التجربة الواعية.

من خلال تبسيط التفاعلات المعقدة الموجودة في الدماغ السليم ، تسمح شرائح الدماغ خارج الجسم الحي بدراسة المكونات المعزولة للأنظمة الديناميكية للدماغ9. يجمع إعداد الشريحة المخفضة بين فوائد الهياكل التشريحية السليمة نسبيا للدوائر العصبية المحلية مع تنوع التلاعب في المختبر. ومع ذلك ، حتى وقت قريب ، حالت القيود المنهجية دون دراسة الخصائص المتشابكة والدائرة للمدخلات طويلة المدى في شرائح الدماغ27,28 ؛ جعل المسار المتعرج لمسالك الألياف القشرية تنشيط المسارات المستقلة القريبة مستحيلا عن طريق التحفيز الكهربائي.

يمثل التحقيق في آثار عوامل التخدير على مستحضرات شريحة الدماغ تحديات إضافية. في غياب الجهاز التنفسي والدورة الدموية السليم ، يجب تطبيق عوامل التخدير على الحمام ، ومطابقة التركيزات بعناية مع تركيزات موقع التأثير المقدرة. بالنسبة للعديد من عوامل التخدير الوريدي ، فإن المعدل البطيء للتوازن في الأنسجة يجعل التحقيقات الدوائية التقليدية شاقة29,30. يعد التحقيق في تأثيرات تخدير الغاز المتطاير في الاستعدادات خارج الجسم الحي أكثر قابلية للسحب ، ولكنه يمثل أيضا تحديات. وتشمل هذه تحويل جرعات الضغط الجزئي المستنشقة إلى تركيزات مائية ، والحاجة إلى نظام توصيل معدل للدواء إلى الأنسجة عبر السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي31.

هنا ، يتم وصف الطرق التي يمكن للمحققين من خلالها الاستفادة من الخصائص الفيزيائية والكيميائية الموثقة جيدا للإيزوفلوران المخدر المتطاير لتوصيل الدواء إلى شرائح الدماغ خارج الجسم الحي ، وتنشيط المدخلات الخاصة بالمسار والطبقة إلى منطقة قشرية ذات أهمية ذات دقة مكانية زمانية عالية ، وإجراء تسجيلات صفائحية متزامنة وتسجيلات مشبك التصحيح المستهدفة من مجموعات مختارة من الخلايا العصبية. تسمح هذه الإجراءات مجتمعة للباحثين بقياس التغيرات المتطايرة الناجمة عن التخدير في العديد من خصائص الاستجابة الكهروفسيولوجية التي يمكن ملاحظتها ، من المشبكي إلى مستوى الشبكة المحلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل كلية الطب بجامعة ويسكونسن ماديسون ولجنة رعاية واستخدام الحيوانات والصحة العامة.

1. تربية الفئران للتعبير عن بروتين مراسل الفلورسنت في المجموعات الفرعية interneuron

  1. قم بإقران الفأر الذكري المتجانس ، المعتمد على Cre ، مع أنثى SOM-Cre متماثلة الزيجوت أو أنثى PV-Cre متماثلة الزيجوت.
    ملاحظة: يمكن استهداف مجموعات عصبية محددة أخرى باستخدام خطوط Cre المناسبة.
  2. اسمح للنسل غير المتجانس بالنضج إلى عمر 3 أسابيع على الأقل قبل المتابعة. بالنسبة للتجارب الموصوفة هنا ، فإن التنميط الجيني ليس ضروريا ، حيث ينتج الآباء المتجانسون ذرية كلها متغايرة الزيجوت لكل من كري ريكومبيناز الخاصة بنوع الخلية وأليلات المراسل المعتمدة على كري.

2. إجراء الحقن المجسمة من جانب واحد من بناء الفيروسية

  1. اضبط إعدادات مجتذب الماصة الدقيقة لماصات الحقن كما هو موضح في دليل مستخدم الأداة (انظر الجدول 1 للاطلاع على الإعدادات الموصى بها). اسحب الماصة الزجاجية الدقيقة.
  2. كسر طرف الطرف الحاد من ماصة بحيث يكون قطر الطرف حوالي 30 ميكرومتر مع الحد الأدنى من تفتق أكثر من عدة ملليمترات.
  3. باستخدام إجراءات موثقة سابقا ، حدد العيار المناسب وحجم الفيروس المراد حقنه. في التجارب الموصوفة هنا ، حقن 1.0 ميكرولتر (العيار: 3.1-5.7 وحدة حرارية بريطانية / مل) حقن من جانب واحد نتائج جيدة.
  4. ردم الحجم الكامل للماصة بالزيوت المعدنية. قم بتحميل الماصة على المحقنة الدقيقة وتدفق كمية صغيرة من الزيت المعدني عبر الطرف لضمان عدم انسداد الطرف.
  5. Frontfill ما لا يقل عن 1.0 ميكرولتر من البناء الفيروسي. كان الناقل الفيروسي المرتبط بالغدي المؤتلف المستخدم في هذه التجارب هو AAV2-hSyn-hChR2 (H134R)-EYFP.
  6. رتب ستارة معقمة في منطقة جراحية. تعقيم أدوات الإجراء التجسيمي ووضعها على الستائر.
  7. تخدير SOM-tdTomato أو PV-tdTomato غير متجانس الزيجوت باستخدام الأيزوفلوران (3٪ للحث ، 1.5-2٪ للصيانة) وخليط الأكسجين. تأكد بشكل دوري من المستوى الجراحي للتخدير مع قرصة إصبع القدم طوال الجراحة. تأكد من أن الحيوان لا يتجاوز الخطة الجراحية للتخدير من خلال مراقبة التنفس كل 10-15 دقيقة.
  8. حلق الجزء العلوي من رأس الحيوان. ضع 70٪ من كحول الأيزوبروبيل والمحلول القائم على اليود بحرية على المنطقة الجراحية ومرهم العيون على مآخذ العين لمنع تجفيف الغشاء. إدارة بوبيفاكايين / يدوكائين (نسبة 1: 1 ، 1.0 ملغ / كغ) تحت الجلد إلى الموقع الجراحي للتخدير الموضعي.
  9. تناسب الحيوان في إطار مجسم.
  10. استخدم المشرط لعمل شق على طول المحور السهمي للجلد الذي يغطي السطح الظهري للجمجمة. اسحب الجلد باستخدام الملقط. ترطيب الجمجمة بنسبة 0.9٪ محلول ملحي حسب الضرورة.
  11. على سطح الجمجمة ، ضع علامة خفيفة على تقاطع الإحداثيات الأمامية والجانبية بصليب في قلم رصاص. حفر ثقب في الإحداثيات المناسبة في المستوى العرضي (بالملم بالنسبة إلى Bregma ، لحقن القشرة الحزامية (Cg): الأمامي 0.2 ، الجانبي 0.3 ؛ لحقن المهاد الخلفي (Po): الخلفي 2.25 ، الجانبي 3.4).
    ملاحظة: يجب أن تمتد العلامات إلى ما وراء حدود ثقب اللدغ لتوفير إرشادات لوضع الماصة بدقة.
  12. قم بتشغيل طاولة الهواء وموازنتها.
  13. تغيير موضع القطب الكهربائي المتلاعب بالإطار المجسمة عند 0 درجة للحقن في Cg ، أو 45 درجة في المستوى الإكليلي للحقن في Po.
  14. قم بتوصيل مضخة المحقنة بجهاز مناور القطب الكهربائي. قم بتوصيل وحدة التحكم في مضخة المحقنة الدقيقة بمضخة المحقنة.
  15. تنقل طرف الماصة بالقرب من (ولكن لا تلمس) سطح الدماغ، عند تقاطع العلامات التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.11. تقدم الماصة بسرعة 1 مم / ثانية تقريبا على طول محورها الطولي في الدماغ إما 0.9 مم (الحقن في Cg) أو 3.1 مم (الحقن في Po). انتظر لمدة 10 دقائق قبل المتابعة.
  16. حقن 1.0 ميكرولتر من البناء الفيروسي على مدى 10 دقائق (100 نانولتر / دقيقة). إذا لوحظ تسرب الفيروس من موقع إدخال الماصة ، فقم بإبطاء معدل الحقن إلى 50 nL / min.
  17. بعد الحقن ، انتظر لمدة 10 دقائق قبل سحب ماصة الحقن ببطء.
  18. خياطة لإغلاق شق فروة الرأس وإدارة 2-5 ملغ / كغ ميلوكسيكام تحت الجلد.
  19. التوقف عن الايزوفلوران ومراقبة الحيوان أثناء الخروج من التخدير. السماح بالتعافي وفقا للإجراءات التي وصفتها لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسة ، بما في ذلك مزيد من إدارة المسكنات.

3. إعداد شرائح الدماغ الحادة

  1. اسمح لمدة 3 أسابيع على الأقل للتعبير عن البنية الفيروسية قبل حصاد الأنسجة.
  2. تحضير 1 لتر من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي لإجراء التقطيع (تقطيع السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي ، sACSF). انظر الجدول 2 للاطلاع على المكونات.
  3. طوال عملية التقطيع ، قم بتزويد sACSF بخليط 95٪ O 2/5٪ CO2 المذاب ، الذي يتم تسليمه عبر أنبوب تشتت الغاز.
  4. تحضير حمام بارد مثلج لاهتزاز شفرة microtome. قم بتركيب مرحلة عينة الجليد البارد على microtome وقم بتثبيت شفرة الياقوت في مكانها لتقسيم الأنسجة.
  5. تخدير الفأر مع 3 ٪ من الايزوفلوران والأكسجين حتى فقدان رد الفعل الصحيح.
  6. قطع رأس الماوس باستخدام المقصلة وغمر الرأس على الفور في 4 درجات مئوية sACSF. للحفاظ على صحة الأنسجة ، أكمل الخطوات التالية في أسرع وقت ممكن.
  7. افتح تجويف الجمجمة عن طريق إجراء شق صغير في قاعدة الجمجمة وإزالة كل صفيحة جمجمة برفق. أزيلي الأم الجافية الأساسية برفق.
  8. بينما لا يزال الدماغ في تجويف الجمجمة ، استخدم شفرة الحلاقة لإزالة المخيخ. قم بعمل قطع رأسي ثان على طول المستوى السهمي في نصف الكرة الأيسر ، فقط جانبي إلى خط الوسط.
  9. تحضير كتلة الأنسجة للتقسيم.
    1. ارفع الدماغ بلطف من تجويف الجمجمة. ضع الدماغ على ورقة الترشيح مع الطائرة السهمية المسطحة لأسفل. قم بتوجيه ورقة الترشيح فوق قالب الحظر ومحاذاة الدماغ مع مخطط القالب الأساسي (الشكل التكميلي 1).
    2. قم بإجراء قطعتين متوازيتين في المستوى الإكليلي كما هو موضح في الأسطر الموجودة في القالب. أضف قطرة صغيرة من sACSF للحفاظ على ورق الترشيح رطبا ، إذا لزم الأمر.
    3. ضع كتلة الأنسجة في sACSF 4 درجات مئوية لفترة وجيزة أثناء إجراء الخطوة 3.8.4.
    4. ضع كمية صغيرة من الغراء الفائق على مرحلة العينة الباردة الثلجية.
    5. ارفع كتلة الأنسجة من sACSF الباردة. استخدم زاوية منشفة ماصة للتخلص من sACSF الزائد. قم بلصق المستوى الإكليلي الخلفي لكتلة الأنسجة إلى مرحلة العينة ، مع مواجهة السطح الظهري للدماغ لشفرة الياقوت.
  10. جمع 500 ميكرومتر شرائح الدماغ الإكليلي السميكة. ضع شرائح ذات أهمية على شبكة نايلون (الشكل التكميلي 2) في 34 درجة مئوية sACSF واسمح للحاوية بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بالنسبة للتجارب الموصوفة هنا، تم جمع التسجيلات الكهروفسيولوجية من قسم إكليلي يتمركز حول 2.25 مم من الخلف إلى البريجما لدراسة منطقة حسية غير أولية، وهي القشرة البصرية الثانوية الإنسية (V2MM).

4. تحضير أكياس تجريبية من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (eACSF) تحتوي على إيسوفلوران مخدر متطاير مذاب

  1. تحضير 300 مل من خليط المرق من 3.0 ٪ isoflurane.
    1. في كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين مغلق ، أضف ~ 100 مل من خليط غاز 95٪ O 2/5٪ CO2 إلى 20-30 مل من الأيزوفلوران السائل وكمية صغيرة من محلول ملحي بنسبة 0.9٪. انتظر لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح بتوازن الأيزوفلوران بين مرحلتي السائل والغاز.
    2. أوجد كمية غاز الأيزوفلوران المشبع، Vsat، لإضافتها إلى كيس المخزون باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-1
      حيث P٪ stock هو التركيب المستهدف لغاز المخزون (3٪ في هذه الحالة) ،والمخزون V هو الحجم النهائي لكيس غاز المخزون ، Pisoflurane هو الضغط الجزئي للإيسوفلوران في درجة حرارة الغرفة (~ 240 مم زئبق) ، و Pالإجمالي هو الضغط الجوي (~ 760 مم زئبق).
    3. أضف الكمية المحسوبة من الغاز المشبع إلى كيس غاز فارغ واملأ الكيس بحجم 95٪ O 2/5٪ CO2 خليط الغاز ليصل الحجم الإجمالي لكيس المخزون إلى 300 مل.
  2. تحضير 2 لتر من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي لتروية الشريحة أثناء التجربة (ACSF التجريبي ، eACSF). انظر الجدول 2 للاطلاع على المكونات. يذوب 95٪ O 2/5٪ CO2 خليط الغاز في محلول.
  3. قم بإعداد حقيبتين منفصلتين من حلول التحكم و Isoflurane.
    1. إلى كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين فارغ ، أضف 600 مل eACSF و 600 مل من خليط غاز 95٪ O2/5٪ CO2 . قم بتسمية هذه الحقيبة باسم التحكم.
    2. إلى كيس غاز بولي تترافلورو إيثيلين فارغ آخر ، أضف 300 مل من eACSF. ضع علامة على هذه الحقيبة على أنها أيسوفلوران.
    3. اختر تركيز الطور الغازي المتوازن ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية للأيزوفلوران. أجريت التجارب باستخدام تركيزات الغاز التي تعادل 1.3٪ من الأيزوفلوران. تفقد الفئران رد الفعل الصحيح ، ويفترض الوعي ، بنسبة 0.9٪ استنشقت الأيزوفلوران.
    4. استخدم المعادلة التالية لحساب تركيز الطور الغازي المكافئ في درجة حرارة الغرفة، P٪ (Troom)31:
      figure-protocol-2
      حيث P٪ (T body) هو تركيز مرحلة الغاز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية المختار في الخطوة 4.3.3 ،وغرفة T هي 25 درجة مئوية ،والجسم T هو 37 درجة مئوية.
    5. استخدم المعادلة التالية لتحديد حجم الغاز من كيس غاز المخزون ،مخزون V ، لإضافته إلى محلول Isoflurane.
      figure-protocol-3
      حيثالحل V هو حجم eACSF في كيس ISOFLURANE (300 مل) ، يتم إدخال P٪ (غرفة T) من المعادلة (2) ، λ هو معامل تقسيم Ostwald الملحي / الغازي للإيسوفلوران (λ = 1.232) ، و P٪ stock هو تركيز الطور الغازي لكيس غاز المخزون (P٪ stock = 3.0٪).
    6. إلى كيس محلول Isoflurane ، أضف حجم الغاز من كيس غاز المخزون، مخزون V ، محسوبا في الخطوة 4.3.5.
    7. إلى كيس محلول Isoflurane ، أضف حجما قدره 95٪ O 2/5٪ CO2 خليط الغاز ليصل الحجم الإجمالي للغاز في كيس محلول Isoflurane إلى 300 مل.
  4. رج كل من أكياس Control و Isoflurane على الخلاط لمدة 1 ساعة على الأقل للسماح بتوازن طور الأيزوفلوران.
  5. بعد جمع جميع البيانات ، يمكن التحقق من التركيز الصحيح باستخدام جهاز مراقبة غاز مخدر لقياس تركيز الغاز المتوازن من الأيزوفلوران فوق المحلول المتبقي في الكيس.
  6. الإبلاغ عن التركيزات التجريبية للغازات المتطايرة في الوحدات المائية، حيث أن تركيزات الملليمولات أكثر قوة للتغيرات في درجة الحرارة. استخدم المعادلة التالية لتحويل تركيز الطور الغازي في درجة حرارة الغرفة، P٪ (غرفة T)، إلى تركيز مائي مكافئ (Cمائي، بالملليمتر)31:
    figure-protocol-4
    حيث α هو معامل تقسيم بنسن المالحة / الغازية للأيسوفلوران عند 25 درجة مئوية32.

5. إعداد الأجهزة والبرامج للتسجيلات متعددة القنوات

  1. قم بإعداد نظام الحصول على البيانات المكون من 16 قناة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام العديد من مكبرات الصوت المتاحة تجاريا وأنظمة الحصول على البيانات لجمع التسجيلات متعددة القنوات. في التجارب الموصوفة هنا ، يتم تسليم الإشارات التناظرية عبر لوحة مرجعية قطب كهربائي إلى اثنين من مكبرات الصوت ، حيث يتم تضخيمها (2000x) وتصفيتها (0.1-10kHz). يتم رقمنة المدخلات التناظرية لنظام الحصول على البيانات عند 40 كيلو هرتز.
  2. اربط محول المسرح الرئيسي المناسب المكون من 16 قناة بجهاز ميكرومبهور مجهري. قم بتوجيه المحول بحيث تكون منافذ الموصل الأنثوية متجهة لأسفل.
  3. اضبط زاوية تشغيل هذا المتلاعب الدقيق بحيث يتم توجيهه لأسفل نحو غرفة التسجيل ، بزاوية حوالي 70 درجة بالنسبة إلى أفقي.
  4. قم بتوصيل مدخل المنصة بمسبار 16 × 1 للفيزيولوجيا الكهربية في المختبر عبر محول المنطلخ الرئيسي المثبت على المتلاعب الدقيق.
  5. قم بتوصيل موصل إخراج المرحلة الرئيسية بنظام الحصول على البيانات.
  6. قم بتثبيت البرامج المناسبة للحصول على البيانات. قم بتكوين 15 قناة إدخال لتتوافق مع إشارات الإدخال من أول 15 جهة اتصال متعددة القنوات للمسبار. قم بتكوين القناة المتبقية لتلقي المدخلات من القطب داخل الخلايا.
    ملاحظة: احرص على النظر في خرائط القطب الكهربائي والمحول عند جمع البيانات وتحليلها ، للتأكد من أن الإشارة المناسبة تتوافق مع اتصال القطب الكهربائي الذي تم جمعها منه.

6. تكوين بروتوكولات تحفيز الضوء

  1. قم بإعداد نظام توصيل الضوء وتثبيت البرنامج المصاحب.
  2. افتح البرنامج. اختر تكوين أسلاك الأجهزة حيث يوفر مصدر الزناد (رقمي / TTL Out) إشارة Trigger In إلى نظام توصيل الضوء ، ويوفر نظام توصيل الضوء إشارة Trigger Out إلى LED 470 نانومتر.
  3. قم بتركيب عدسة موضوعية عالية الطاقة. باستخدام الكاميرا الرقمية ، قم بمعايرة الهدف عالي الطاقة للاستخدام مع نظام توصيل الضوء.
  4. إنشاء تسلسل ملف تعريف جديد لملفات تعريف تحفيز الضوء.
    1. إنشاء نمط من الاختيار. في التجارب الموصوفة هنا ، يتم استخدام دائرة قطرها 150 ميكرومتر للسماح بتنشيط طبقة محددة من محطات المحور العصبي.
    2. لإنشاء تسلسل ملف تعريف، انسخ ملف التعريف هذا والصقه لكل من أي عدد من التجارب.
    3. قم بإنشاء قائمة أشكال موجية تحتوي على أشكال موجية لأي شدة ضوء أو مدة نبض أو رقم نبض.
    4. تعيين أشكال موجية عشوائيا لكل ملف تعريف. يتوافق كل ملف تعريف بشكله الموجي المعين مع نبضة مشغل واحدة من إدخال TTL رقمي ، أو تجربة واحدة.
    5. احفظ تسلسل ملف التعريف.
  5. في برنامج الحصول على البيانات، قم بإنشاء بروتوكول جديد.
    1. قم بتعيين عدد التجارب ليساوي عدد ملفات التعريف في تسلسل ملف التعريف الذي تم إنشاؤه للتو.
    2. اختر مدخلات الإشارة لمطابقة تلك التي تم تكوينها في الخطوة 5.6. قم بتكوين بروتوكول يوفر مخرج TTL رقمي واحد ، يتم تسجيله من قنوات الإدخال ال 16 هذه لفترة زمنية مناسبة قبل وبعد المشغل الرقمي.

7. وضع مسبار متعدد القنوات في شريحة أنسجة المخ خارج الجسم الحي

  1. eACSF الفقاعي Perfuse (ليس في أكياس مغلقة) عند 3-6 مل / دقيقة.
  2. انقل شريحة الدماغ التي تحتوي على منطقة ذات أهمية إلى شبكة شبكية في غرفة تروية المجهر. مرساة مع قيثارة بلاتينية (انظر الشكل التكميلي 3).
  3. قم بتدوير الشبكة الشبكية بحيث يكون خط تلامس القطب الكهربائي على الطرف البعيد من المسبار متعدد القنوات عموديا تقريبا على سطح القضيب.
  4. تحت إضاءة المجال العريض وتحت التحكم الدقيق في المتلاعب الدقيق ، اخفض المسبار متعدد القنوات نحو سطح الشريحة.
  5. قم بتدوير برج مكعب المرشح لإشراك مكعب المرشح المناسب لتصور بروتين مراسل الفلورسنت المعبر عنه في أطراف محورية من الأفيرينات القشرية . إذا لزم الأمر ، قم بتدوير الشريحة لمحاذاة المسبار بدقة أكبر مع سطح الحفرة.
  6. ضع المسبار فوق مستوى الشريحة مباشرة، أي أقل ب 200 ميكرومتر تقريبا من الموضع النهائي المستهدف على طول المحور x، تاركا قناة واحدة على الأقل خارج حدود منطقة الأنسجة التي يتم تسجيلها.
  7. أدخل المسبار ببطء في الشريحة عن طريق تحريك المتلاعب على طول محوره الطولي. لتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة ، قم فقط بتطوير المسبار إلى الحد الذي تكون فيه الأطراف الحادة مرئية فقط تحت سطح الأنسجة. سيؤدي ذلك إلى تقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة مع ضمان اتصال القطب الكهربائي بالأنسجة.

8. تصحيح تثبيت الخلايا العصبية المستهدفة والحصول على تكوين الخلية بأكملها

  1. قم بتبديل مصدر eACSF إلى حل التحكم المعبأ في أكياس.
  2. حدد الخلايا المصنفة بالفلورسنت لتسجيل مشبك التصحيح المستهدف.
    1. تقييد الحجاب الحاجز القزحية فتحة العدسة إلى أصغر قطر. قم بإشراك عدسة موضوعية منخفضة الطاقة وجلب الأنسجة إلى التركيز البؤري.
    2. قم بتوسيط الضوء فوق منطقة من الأنسجة المجاورة (ولكن ليس المتداخلة) مع المسبار متعدد القنوات.
    3. قم بإشراك هدف الغمر المائي عالي الطاقة (40x أو 60x) ، مع توخي الحذر لتجنب التلامس بين المسبار متعدد القنوات والعدسة الموضوعية.
    4. قم بتدوير برج مكعب المرشح لإشراك مجموعة المرشح المناسبة للسماح بتصوير الخلايا التي تعبر عن علامة الفلورسنت المعتمدة على Cre.
    5. حدد خلية مصنفة بالفلورسنت كهدف لتسجيل مشبك التصحيح. ارفع العدسة الموضوعية لتوفير مساحة واسعة لخفض ماصة التصحيح.
  3. قم بتحميل ماصة تصحيح (انظر الجدول 1) بمحلول داخلي (الجدول 2) وقم بتركيب ماصة في حامل القطب الكهربائي. باستخدام حقنة 1 مل ، ضع ضغطا إيجابيا مطابقا ل ~ 0.1 مل من الهواء.
  4. خفض ماصة التصحيح في المحلول. ضع طرف الماصة في بؤرة التركيز تحت التوجيه البصري.
  5. احصل على تسجيل خلية كاملة من الخلية المستهدفة باستخدام الخطوات الموضحة سابقا33.
  6. إذا كنت تخطط لتقييم التغييرات في الخصائص الجوهرية للخلية (على سبيل المثال ، مقاومة المدخلات ، ومعدل إطلاق النار المحتمل استجابة للخطوات الحالية) ، فقم بإجراء هذه التسجيلات. خلاف ذلك ، انتقل إلى بروتوكول تحفيز المحور العصبي أدناه.

9. التنشيط البصري الوراثي الخاص بالطبقة للمحطات الطرفية للمحور العصبي

  1. تعامل مع مجال الرؤية في المستوى x-y لمحاذاة ملف تعريف تحفيز الضوء مع الموقع المطلوب على الشريحة.
  2. قم بتحميل بروتوكول تحفيز الضوء وإعداد نظام توصيل الضوء لتلقي نبضة TTL رقمية.
  3. تنشيط أطراف المحور العصبي بصريا مع تسجيل إمكانات المجال خارج الخلية وتقلبات الغشاء داخل الخلايا في نفس الوقت.
  4. قم بتبديل مصدر eACSF إلى محلول Isoflurane واغسل الدواء لمدة 15 دقيقة. إذا لزم الأمر ، اجمع التسجيلات التلقائية أثناء الغسيل.
  5. كرر الخطوة 9.2-9.3.
  6. قم بتبديل مصدر eACSF إلى محلول التحكم واغسل الدواء لمدة 20 دقيقة. إذا لزم الأمر ، اجمع التسجيلات التلقائية أثناء الغسيل.
  7. كرر الخطوة 9.2-9.3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في الشكل 1 جدول زمني للخطوات الموصوفة في البروتوكول. تحتوي المدخلات القشرية القادمة من المناطق القشرية ذات الترتيب الأعلى أو من نوى المهاد غير الأولية على حقول طرفية متداخلة جزئيا في الطبقة 1 من القشرة البصرية غير الأولية24. ولعزل المسارات المستقلة القشرية القشرية أو القشرية التابعة، تم حقن ناقل فيروسي يحتوي على ChR2 ومراسل فلورسنت eYFP إما في Po أو Cg. وتشغل الخلايا داخل دائرة نصف قطرها الحقن الناقل الفيروسي، وبعد 2-4 أسابيع، تعبر عن قناة الكاتيون غير المحددة Ch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المخطوطة، يتم وصف بروتوكول لتقييم الاستجابات داخل وخارج الخلية للمسارات القريبة المنشطة بشكل انتقائي في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي.

يسمح استخدام الأدوات البصرية الجينية ومخططات التسجيل المتوازية للمحققين بالتحقيق في استجابات السكان المحليين للمدخلات القريبة من مناطق الدماغ البعيدة ، مع التسجيل في وقت واحد من المجموعات المستهدفة من الخلايا العصبية الداخلية. يسمح استخدام التكنولوجيا البصرية الجينية بالحفاظ على أطراف المحور العصبي للإسقاطات القريبة وتنشيطها على الرغم من أن أجسامها الخلوي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون برايان كراوس على الدعم الفني والتوجيه بشأن هذا المشروع.

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الدولية لأبحاث التخدير (IMRA to AR) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 GM109086 إلى MIB) ، وقسم التخدير ، كلية الطب والصحة العامة ، جامعة ويسكونسن ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
عدسة موضوعية عريضة المجال 2.5xأوليمبوسMPLFLN2.5X
40x عدسة موضوعية للغمر في الماءأوليمبوسLUMPLFLN40XW
95٪ O2 / 5٪ CO2 خليطAirgasZ02OX95R2003045
A16 مسبارNeuroNexusA16x1-2mm-100-177-A16مسبار 16
قناة AAV2-hSyn-hChR2 (H134R) -EYFPKarl Deisseroth Lab ، UNC
الأساسي (POET II)Criticare602-3A
ATP ، ملح المغنيسيومSigma AldrichA9187محلول داخل الخلايا
B6. Cg-GT (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / Jمختبر جاكسون007914tdTomato الماوس B6
المعتمد على Cre ؛ 129P2-Pvalbtm1 (cre) Arbr / Jمختبر جاكسون008069PV-Cre ماوس
الراقصة الشرقية شاكرتوماس Scientific1210H86-TSلتوازن أكياس الغاز المختومة
محلول البيتادينالعلامة التجارية
Bleachالعلامة التجاريةالعامة للفضة الكلورة رقعة المشبك المشبك
الكهربائي Bupivicaine
كلوريد الكالسيوم (CaCl2) DSC20010Dot Scientific
الزجاج الشعري ACSF (تسجيلات مشبك التصحيح) KingPrecision Glass، Inc.KG-33البورسليكات ، ID: 1.1 مم ، OD: 1.7 مم ، الطول: 90.0 مم
زجاج شعري (حقن فيروسي) شركةدروموند العلمية3-000-203-G / X3.5 "
التحكم في المعالج الدقيقالصغير Luigs و NeumannSM8للتحكم في المعالج الدقيق الصغير
التحكم في المتلاعبين وطاولة التحولLuigs و NeumannSM7للتحكم في القطب متعدد القنوات و طاولة التحول
Digidata 1440A + Clampex 10الأجهزة الجزيئية1440Aمحول الأرقام والبرامج
أنابيب E-3603فيشرScientific 14171208لتوصيل خليط غاز CO2 بنسبة 95٪ O2 / 5٪ إلى غرفة الحضانة + تطبيق الضغط أثناء لقط التصحيح
EGTADot ScientificDSE57060الحل داخل الخلايا
ERP-27 EEG المرجع / لوحةالتصحيحNeuralynxRetired
FillingNeedle World Precision Instruments50821912لملء ماصات مشبك التصحيح
مكعب مرشح للتصوير EYFPOlympusU-MRFPHQ
ورق ترشيحفيشر Scientific09801Eوضع فوق قالب الشريحة أثناء تحضير كتلة الأنسجة
المشتعلة / مجتذب الماصات الدقيقة البنيأداة SutterP-10002.5x2.5 أنبوب
تشتت الغاز أنبوب تشتت الغازSigma AldrichCLS3953312C
حقنة زجاجية (100 مل)Z314390 Sigma Aldrichلملء الأكياس المختومة
بالغاز حمض الجلوكونيك ، ملح البوتاسيوم (K-gluconate)Dot ScientificDSG37020محلول داخل الخلايا
GlucoseDot ScientificDSG32040ACSF
GTP ، ملح الصوديومSigma AldrichG8877محلول داخل الخلايا
محول مسبار الرأسمحول NeuroNexusA16-OM16لتوصيل مسبار 16 قناة بمدخلات المسرح
المرقئ ملقطVWR International76192-096
HEPESDot ScientificDSH75030ACSF ، محلول داخل الخلايا
HS-16 HeadstageNeuralynxمتقاعد
من IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
كحول الأيزوبروبيل (70٪) VWRInternational101223-746
Junior MicromanipulatorLuigs and Neumann210-100 000 0090-Rللتلاعب بقطب مشبك التصحيح
التحكم في مصدر الضوء LED MightexBLS-PL02_USالتحكم في مصدر الضوء البصري الوراثي
ليدوكائين
Lynx-8 مكبر للصوتNeuralynxمتقاعد
Lynx-8 مزود الطاقةNeuralynxمتقاعد
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4)Dot ScientificDSM24300ACSF
mCherry ، تكساس مكعب مرشح أحمرChroma49008للتصوير tdTomato fluorescent reporter
Meloxicam
حامل الماصةالدقيقة فيشر ScientificNC9044962
مضخة الحقنالدقيقة العالمية أدوات الدقةUMP3-4
الزيوت المعدنيةالعلامة التجارية
MultiClamp 700Aالأجهزة الجزيئية / أدوات AxonInstruments 700Aمكبر للصوت
النيتروجين (لطاولة الهواء)AirgasNI200
شبكة النايلونفيشر العلمي501460083تمتد فوق حدوة حصان من الأسلاك البلاتينية المسطحة ، شريحة الراحة فوق هذا أثناء التسجيلات
النايلون ، مقطعة من جواربقطعة صغيرة من العلامة التجاريةلإنشاء منصة شريحة في غرفة الحضانة ، ألياف مفردة لإنشاء مرهم عيون القيثارة البلاتينية
فيشر NC1697520
ماصةDot Scientific307لنقل الأنسجة إلى
سلك البلاتينVWRInternational BT1240002 سم ، مسطح ، لصنع القيثارة البلاتينية
Polygon400MightexDSI-E-0470-0617-000نظام توصيل الضوء البصري الوراثي ، يأتي مع برنامج PolyScan2
كلوريد البوتاسيوم (KCl)Dot ScientificDSP41000ACSF
فوسفات البوتاسيوم (KH2PO4)الحلاقة Dot ScientificDSP41200ACSF
Fisher Scientific12-640
(للاهتزاز)VWR International100492-502
شفرة مشرطسانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، Inc.sc-361445
كيس غاز مختومفيشر Scientific109236
طاولة التحول للمجهرLuigs and Neumann380FMU
بيكربونات الصوديوم (HCO3-)Dot ScientificDSS22060ACSF
كلوريد الصوديوم (NaCl)Dot ScientificDSS23020ACSF ، محلول داخل الخلايا
Ssttm2.1 (CRE) Zjh / J (SOM-IRES-Cre)مختبر جاكسون013044SOM-Cre فأر
أداة تجسيميةKopfModel 902Dual Small
Animal Super glueStaples886833لإصلاح كتلة الأنسجة في مرحلة العينة أثناء إعداد الشريحة
الحفر الجراحيRAM Products Inc.DIGITALMICROTORQUEMicrotorque II
(1 مل) مع طرف LuerLock309628 فيشر Scientificلتطبيق الضغط أثناء لقط الرقعة
حقنة (1 مل) مع طرف انزلاقWW Grainger، Inc.19G384لملء ماصات التصحيح المشبك مرشحات
الحقنةVWR International66064-414
المجهر المستقيمأوليمبوسBX51
الاهتزاز ميكروتومLeica BiosystemsVT1000S
مناشف Wypallفيشر Scientific19-042-427
جهاز مراقبة غاز التخدير الناقل العامة وحدة العامة طويلة العامة العلمي شفرة شفرة الياقوت حقنة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
  2. Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
  3. Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
  4. Crick, F., Koch, C. A framework for consciousness. Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).
  5. Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
  6. Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
  7. Friston, K. A theory of cortical responses. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).
  8. Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44(2017).
  9. Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
  10. Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896(2020).
  11. Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
  12. Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499(2017).
  13. Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
  14. Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
  15. Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
  16. Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
  17. Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
  18. Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
  19. Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
  20. Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
  21. Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155(2011).
  22. Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791(2017).
  23. Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
  24. Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
  25. Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191(2014).
  26. Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
  27. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  28. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
  29. Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
  30. Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
  31. Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
  32. Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
  33. Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  34. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  35. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
  36. Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
  37. Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic ActivationBrain SlicesVolatile AnestheticsExtracellular RecordingsWhole Cell Patch ClampIsoflurane DeliverySomatostatin InterneuronsParvalbumin InterneuronsCurrent Source DensityMulti Unit Activity

Related Articles