يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التنشيط القسري للحمض النووي الريبي المحسن في الموقع من خلال نظام وسيط التنشيط التآزري dCas9

2.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61460

⸱

يونيو 5, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center, 2Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas MD Anderson Cancer Center and UTHealth

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الحمض النووي الريبي المحسن (eRNAs) عبارة عن RNAs غير مشفرة يتم إنتاجها من معززات نشطة. يتمثل النهج الأمثل لدراسة وظائف الحمض النووي الريبي في معالجة مستوياتها في مناطق الكروماتين الأصلية. نقدم هنا نظاما قويا لدراسات eRNA باستخدام منشطات النسخ المدمجة CRISPR-dCas9 للحث على التعبير عن eRNAs ذات الأهمية.

الملخص

المعززات هي عناصر جينومية محورية منتشرة عبر جينوم الثدييات وتملي برامج التعبير الجيني الخاصة بالأنسجة. أظهرت الأدلة المتزايدة أن المعززات لا توفر فقط أشكال ربط الحمض النووي لعوامل النسخ (TFs) ولكنها تولد أيضا RNAs غير مشفرة يشار إليها باسم eRNAs. أظهرت الدراسات أن نصوص الحمض النووي الريبي يمكن أن تلعب أدوارا مهمة في تنظيم الجينات في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض. تقتصر الطرق الشائعة الاستخدام للتحقيق في وظيفة eRNAs على مناهج "فقدان الوظيفة" عن طريق ضربة قاضية من eRNAs ، أو عن طريق التثبيط الكيميائي لنسخ المحسن. لم تكن هناك طريقة قوية لإجراء دراسات "اكتساب الوظيفة" لل eRNAs لتقليد حالات مرضية معينة مثل السرطان البشري ، حيث غالبا ما يتم التعبير عن eRNAs بشكل مفرط. هنا ، نقدم طريقة لتنشيط eRNAs بدقة وقوة للاستجواب الوظيفي لأدوارها من خلال تطبيق نظام وسطاء التنشيط التآزري (SAM) بوساطة dCas9. نقدم سير العمل الكامل لتنشيط eRNA ، بدءا من اختيار eRNAs ، وتصميم gRNAs إلى التحقق من صحة تنشيط eRNA بواسطة RT-qPCR. تمثل هذه الطريقة نهجا فريدا لدراسة أدوار eRNA معين في تنظيم الجينات وتطور المرض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النظام لفحص كريسبر غير المتحيز لتحديد أهداف الحمض النووي الريبي المرسال التي تقود النمط الظاهري في سياق مرض معين.

المقدمة

يحتوي الجينوم البشري على كوكبة من العناصر التنظيمية1،2،3. من بين هذه ، تظهر المعززات لتكون واحدة من أكثر الفئات أهمية4،5،6. تلعب المعززات أدوارا أساسية في تنظيم التطور ، وهي مسؤولة عن إنشاء برامج التعبير الجيني المكاني والزماني لتحديد هوية الخلية5،6،7. تقليديا ، تعتبر المعززات فقط عناصر الحمض النووي التي توفر زخارف ملزمة لعوامل النسخ (TFs) ، والتي تتحكم بعد ذلك في التعبير الجيني المستهدف6،8. ومع ذلك ، وجدت سلسلة من الدراسات أن العديد من المعززات النشطة تقوم أيضا بنسخ الحمض النووي الريبي غير المشفر (أي eRNAs)4،9،10.

تم العثور على مستوى نسخ eRNA للارتباط بنشاط محسن4،10. تنتج المعززات النشطة المزيد من نصوص eRNA وتظهر مستويات أعلى من علامات epigenome المرتبطة بالنسخ النشط ، مثل H3K27ac و H3K4me19،11،12. أظهرت بعض الدراسات أن نسخ الحمض النووي الريبي يمكن أن تلعب أدوارا مهمة في التنشيط النسخي للجينات المستهدفة10،12. تم تحديد عدد كبير من eRNAs ليتم تحريرها في السرطانات البشرية13،14،15،16 ، والتي أظهر العديد منها خصوصية عالية من نوع السرطان وأهمية سريرية. توفر هذه النتائج فرصا بأن توضيح eRNAs التي يمكن أن تقود / تعزز تكوين الأورام قد يوفر أهدافا جديدة للتدخل العلاجي13،15.

تعتمد الطرق الحالية لدراسة وظائف eRNA بشكل حصري تقريبا على استراتيجيات الضربة القاضية التي استخدمت الحمض النووي الريبي التداخل الصغير (siRNA) ، أو الحمض النووي الريبي القصير (shRNAs) ، أو قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى (ASOs ، والتي تعتبر الأحماض النووية المقفلة (LNAs) هي النوع الشائع الاستخدام في البحث) 10،12،17. ومع ذلك ، فإن الأمراض البشرية مثل السرطان تظهر في الغالب الإفراط في التعبير عن eRNAs مقارنة بالأنسجة الطبيعية المجاورةلها 15 ، مما يتطلب أدوات "للإفراط في التعبير" عن eRNAs لتقليد أنماط التعبير الخاصة بها ذات الصلة بالمرض للدراسات الوظيفية. لتحقيق ذلك ، فإن نظام الإفراط في التعبير خارج الرحم القائم على البلازميد ليس مثاليا لأن مواقع بدء النسخ الدقيقة وإنهائه ل eRNAs لا تزال غير واضحة إلى حد كبير. بالإضافة إلى ذلك ، قد يغير نظام التعبير عن البلازميد موقع eRNAs ، مما يتسبب في القطع الأثرية المحتملة لوظائفها18. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لتسهيل التوصيف الوظيفي ل eRNAs من خلال فرض "الإفراط في التعبير" في الموضع الجينومي الأصلي لإنتاجها (أي في الموقع) ، والذي يعتمد على نظام وسطاء التنشيط التآزري CRISPR / dCas9 (SAM).

تم تطوير نظام SAM في البداية لتنشيط جينات الترميز والحمض النووي الريبي غير المشفرة الطويلة بين الجينات (lincRNAs) المرتبطة بمقاومة مثبطات BRAF في خلايا الورم الميلانيني19. على عكس تقنيات تنشيط كريسبر الأخرى (CRISPRa) ، يتكون نظام SAM من مجموعة من منشطات النسخ لمنح تنشيط نسخ قوي للمناطق المستهدفة. وتشمل هذه المنشطات: Cas9 ميت إنزيميا (dCas9) مدمج مع VP64 (أي dCas9-VP64); دليل الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على اثنين من أبتامرات الحمض النووي الريبي MS2 ، وبروتين منشط الانصهار MS2-p65-HSF1. يمكن أن يؤدي وجود أبتامير MS2 في gRNA إلى تجنيد بروتين اندماج MS2-p65-HSF1 بالقرب من مواقع ربط dCas9 / gRNA. من بين هؤلاء ، VP64 هو رباعي مصمم هندسيا لمجال منشط النسخ VP16 الهربس البسيط ، والذي ثبت أنه ينشط بقوة النسخ الجيني عن طريق تجنيد عوامل النسخ العامة20،21،22. يتكون بروتين الاندماج MS2-p65-HSF1 من ثلاثة أجزاء. الجزء الأول ، MS2-N55K ، هو شكل متحور من بروتين ربط MS2 الذي له تقارب أقوى23. الجزءان الآخران من بروتين الاندماج هذا هما مجال التنشيط ل p65 وعامل الصدمة الحرارية 1 (HSF1) ، وكلاهما من عوامل النسخ التي تمتلك مجالات نقل قوية ويمكن أن تحفز برامج نسخ قوية24،25. لذلك ، أنشأ نظام SAM بشكل أساسي مركبا منشطا قويا للغاية لتنشيط نسخ جينات الترميز المعينة و lincRNAs19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يظهر سير العمل الكامل لهذا البروتوكول في الشكل 1.

1. اختيار الحمض النووي الريبي المحسن (eRNA)

  1. حدد منطقة محسن مفترضة للاهتمامات باستخدام قمم الربط لبيانات تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP-Seq) ، أي تعديلات الهيستون (على سبيل المثال ، H3K4me1 و H3K27ac) ، أو منشطات النسخ (على سبيل المثال ، p300).
  2. حدد الحمض النووي الريبي المرسال محل الاهتمام من خلال تقاطع ذروة ChIP-Seq مع إشارات تسلسل الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال ، من إجمالي تسلسل الحمض النووي الريبي أو من تسلسل الحمض النووي الريبي الناشئ مثل تسلسل التشغيل العالمي (GRO-Seq).
    ملاحظة: يجب أن تقتصر المنطقة المختارة لتصميم gRNAs عادة على منطقة "قلب المحسن" ، حيث أظهرت TFs أو المنشطات المشتركة (على سبيل المثال ، p300) قمم ChIP-seq واضحة (الشكل 2 أ). سيتم تجنيد dCas9 ومنشطات الاندماج الخاصة به بواسطة gRNA في هذه المنطقة لتقليد الارتباط الأصلي للمنشطات المشتركة (الشكل 2 أ). إذا كانت مجموعات البيانات المحددة مثل تحليل غطاء التعبير الجيني (CAGE) 4 أو GRO-cap26 متوفرة ، فيمكن استخدامها لتحديد "قلب المحسن" بدقة ، وهي المنطقة الواقعة بين موقعي بدء النسخ ل eRNAs التي تم نسخها إلى اتجاهين متعاكسين4،10،26.

2. تصميم الحمض النووي الريبي

  1. استخدم أدوات تصميم CRISPR gRNA الشائعة مثل CRISPOR27 لتحديد gRNAs ذات إمكانات منخفضة (http://crispor.tefor.net/).
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أدوات أخرى مثل Benchling28 أو CHOPCHOP29 كخيارات إضافية لتصميم gRNA.
  2. الصق تسلسل الحمض النووي الأساسي للمحسن في عمود الخطوة 1 في موقع CRISPOR على الويب ، ثم انقر فوق زر القائمة المنسدلة لاختيار الجينوم المقابل (على سبيل المثال ، الإنسان) في عمود الخطوة 2 . انقر فوق زر القائمة المنسدلة لتعيين تسلسل Protospacer Adjacent Motif (PAM) ك "NGG" في عمود الخطوة 3 ثم انقر فوق الزر "إرسال" لإنشاء تسلسلات إرشادية بطول 20 نقطة أساس.
  3. اختر أدلة ذات أعلى درجات الخصوصية في أداة CRISPOR ، أي إمكانات منخفضة خارج الهدف ، ثم أضف "CACCG" إلى النهاية 5 ، و "C" إلى النهاية 3 ، على التوالي.
    ملاحظة: حدد الأدلة ذات أعلى درجات الخصوصية (يفضل >85 في CRISPOR).
  4. اطلب قليل النوكليوتيدات لكل تسلسل حاسة ومضاد للمعنى من مصادر تجارية.
    ملاحظة: يمكن العثور على تعليمات إضافية حول تصميم CRISPR / Cas9 gRNA في دراسات أخرى30،31. ستجعل الأجزاء المتدلية في الخطوة 2.2 الحمض النووي الريبي المرسال متوافقا مع العمود الفقري ل SAM gRNA (Addgene # 61427) ، والذي يستخدم إنزيم تقييد BsmBI.

3. استنساخ gRNAs في بنية عدسية

  1. لإزالة oligos الصلب ، امزج 1 ميكرولتر من كل أوليغو مقترن عند 100 ميكرومتر ، 1 ميكرولتر من 10x T4 المخزن المؤقت للربط ، 0.5 ميكرولتر من T4 DNA Ligase (400،000 وحدة / مل) و 6.5 ميكرولتر من H2O للوصول إلى الحجم الإجمالي 10 ميكرولتر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والمنحدر إلى 25 درجة مئوية عند 5 درجات مئوية / دقيقة. خفف إلى 100 ميكرولتر باستخدام H2O.
  2. هضم العمود الفقري ل gRNA عن طريق خلط 2 ميكرولتر من 10x إنزيم التقييد (RE) Buffer ، و 300 نانوغرام من lenti_gRNA(MS2)_zeo بلازميد العمود الفقري (Addgene # 61427) في 1 ميكرولتر ، و 1 ميكرولتر من إنزيم BsmBI ، و 16 ميكرولتر من H2O للوصول إلى الحجم الإجمالي 20 ميكرولتر. احتضن عند 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. امزج مكونات الربط مع 20 ميكرولتر من منتج الهضم عن طريق إضافة 2.5 ميكرولتر من 10x T4 المخزن المؤقت ، و 1 ميكرولتر من منتج التلدين المخفف و 1.5 ميكرولتر من T4 DNA ligase (400،000 وحدة / مل) في نظام 25 ميكرولتر. احتضن في درجات حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بتحويل 2 ميكرولتر من مزيج الربط من الخطوة 3.3 إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة Stbl3. ضعيها على طبق أمبيسلين LB-agar واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  5. انتقاء وتلقيح مستعمرة بكتيريا واحدة واستخرج البلازميد. أرسله لتسلسل Sanger للتأكد من إدراج تسلسل gRNA بشكل صحيح.
    ملاحظة: تتوفر تسلسلات البادئات و gRNAs في الجدول التكميلي 1. يوصى باستخدام خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا Stbl3 هنا لأنها تتمتع بإنتاجية أعلى من الحمض النووي البلازميد واستقرار بلازميد أعلى عند توليد بلازميدات فيروس العدسات المعرضةلعدم الاستقرار 32.

4. اختبار كفاءة الحمض النووي الريبي

ملاحظة: على الرغم من أنه قد لا يكون ضروريا لكل gRNA ، فمن المستحسن أن يقوم الباحثون بفحص جودة gRNA عن طريق إجراء مقايسة Surveyor (أي مقايسة انقسام عدم التطابق) للكشف عن indels أو الطفرات التي لا يمكن إنشاؤها بكفاءة إلا بواسطة gRNAs عالية الجودة33،34. يمكن أيضا استخدام طرق أخرى مثل تتبع Indels عن طريق التحلل (TIDE) لتحديد كفاءة الحمض النووي الريبي30،35. نوكلياز المساح هو عضو في عائلة من نوكليازات داخلية خاصة بعدم التطابق يمكنها قطع الحمض النووي مزدوج الخيط مع عدم التطابق (الشكل 3 أ). يمكن الكشف عن جودة الحمض النووي الريبي من خلال فعالية إنتاج أنواع أصغر من الحمض النووي. عمليا ، يمكن أن تتأثر فعالية قطع المساح أيضا بكفاءة تعداء gRNAs و Cas9.

  1. transfect gRNA مع pSpCas9 (BB) -2A-Puro (Addgene # 62988) البلازميد الذي يعبر عن بروتين Cas9 في خلايا 293T باستخدام كاشف تعداء قائم على الدهون. استخدم 1.2 ميكروغرام / مل لكل بلازميد لكل بئر في صفيحة 6 آبار. استمر في زراعة الخلايا لمدة 3 أيام بعد التعداد. حصاد واستخراج الحمض النووي الجيني وفقا لبروتوكول الشركةالمصنعة 36.
  2. استخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم منطقة المحسن المستهدفة من الحمض النووي الجيني. استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضحة في الجدول التكميلي 2. استخدم الاشعال في الجدول التكميلي 1 للحصول على مثال محسن ، NET1e. قم بتغيير طبيعة منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق احتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وإعادة تهجينها عن طريق التكثيف من 95 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية بسرعة -0.3 درجة مئوية / ثانية للسماح للحمض النووي أحادي الخيط (ssDNA) مع وبدون indels أو الطفرات التي يسببها gRNA بالتلدين مع بعضها البعض.
  3. استيعاب الحمض النووي المهجن بواسطة نوكلياز المساح (الشكل 3 أ) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة37. امزج 400 نانوغرام من الحمض النووي المهجن من الخطوة 4.2 ، و 1 ميكرولتر من نوكلياز Surveyor ، و 1 ميكرولتر من محسن Surveyor و 5 ميكرولتر من 0.15 MMgClCl 2 في نظام 50 ميكرولتر. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. تحليل الحمض النووي على هلام الاغاروز. استخدم التحكم السلبي ، مثل الخلايا التي تحتوي على Cas9 فقط ولكن دون استهداف gRNAs ، في الفحص والرحلان الكهربائي للهلام (الشكل 3 ب).

5. توليد فيروس العدسي

  1. أضف psPAX2 و pMD2.G وبلازميد مستهدف (على سبيل المثال ، lenti_dCas9-VP64_Blast ، Addgene # 61425 ؛ أو lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro ، Addgene # 61426) بنسبة 3 ميكروغرام: 1 ميكروغرام: 4 ميكروغرام في أنبوب بولي بروبيلين سعة 1.5 مل. امزجها مع 500 ميكرولتر من Opti-MEM واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. في أنبوب منفصل ، ضع 10 ميكرولتر من كاشف التعدي القائم على الدهون في 500 ميكرولتر من Opti-MEM ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. اجمع المنتجات من الخطوتين 5.1 و 5.2 واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. لوحة 293T الخلايا قبل يوم واحد من التعدي واتركها تصل إلى التقاء ~ 30٪ في طبق 10 سم في وقت التعدين. أضف 4 مل من الوسط العادي (DMEM مع 10٪ FBS) ، ثم أضف المركب من الخطوة 5.3 بالتنقيط إلى الخلايا. أضف DMEM مع 10٪ FBS لجعل الحجم النهائي يصل إلى 6 مل. احتضان طوال الليل في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  5. في اليوم التالي، قم بتغيير الوسيط إلى 10 مل من DMEM الجديد مع 10٪ FBS. احصد الوسط بعد 24 ساعة من التغيير المتوسط. استخدم مرشح حقنة (على سبيل المثال ، 0.45 ميكرومتر) لتصفية الوسط المحتوي على الفيروس ثم انتقل إلى الخطوة 6 أو قم بتخزين الفيروس في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تتطلب عمليات الفيروسات الخالية من الحشرات خزانة السلامة البيولوجية من المستوى الثاني. يجب توخي الحذر للتعامل مع التجارب المرتبطة بالفيروسات بأمان. وإذا كانت أي حاوية على اتصال مباشر بالوسط الفيروسي ، فيجب تبييضها لأكثر من 20 دقيقة قبل التخلص منها كخطر بيولوجي.

6. زراعة الخلايا

  1. الحفاظ على الخلايا في حاضنة زراعة خلايا ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. زراعة الخلايا MCF7 و 293T في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع FBS بنسبة 10٪.
  3. تنمو الخلايا في أطباق مقاس 10 سم وتنقسم بنسبة 1: 3 إلى 1: 5 عند التقاء.

7. عدوى الخلايا والاختيار

  1. زرع الخلايا المستهدفة (على سبيل المثال ، MCF7) مباشرة في خليط متوسط فيروسي يحتوي على 0.5 مل من lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene # 61425) و 0.5 مل lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene # 61426). أضف 8 ميكروغرام / مل سداسي ديميثرين بروميد لزيادة كفاءة العدوى. استخدم بئر من الخلايا غير المصابة كعنصر تحكم سلبي لفحص فعالية اختيار المضادات الحيوية.
    ملاحظة: يوصى بكمية الوسط الفيروسي على النحو التالي: 6 مل وسط فيروسي لطبق 10 سم ، و 1 مل لبئر من صفيحة 6 آبار ، و 0.5 مل لبئر من 12 بئر.
  2. بعد 24 ساعة من الإصابة ، أضف إلى الخلايا وسط طازج يحتوي على Blasticidin (5 ميكروغرام / مل لخلايا MCF7) و Hygromycin (200 ميكروغرام / مل لخلايا MCF7).
  3. احتفظ بالخلايا في وسط اختيار المضادات الحيوية حتى تموت خلايا التحكم السلبية.
    ملاحظة: قد يختلف الوقت لتصبح خطوط الخلايا المختلفة مستقرة. بالنسبة ل MCF7 ، عادة ما يستغرق الأمر من 5 إلى 7 أيام حتى تموت الخلايا غير المصابة تماما. يجب اختبار منحنى القتل باستخدام مجموعة من تركيزات المضادات الحيوية بحثا عن خط خلوي جديد قبل التجارب. من المقبول استخدام خليط خلوي للخطوات التالية ، ولكن البديل هو اختيار مستعمرات أحادية الخلية متجانسة من حيث التعبير عن البروتينين المستجيبين. يشار إلى الخط المستقر الذي تم الحصول عليه باسم الخط الأبوي المستجيب SAM (على سبيل المثال ، خط مستجيب MCF7 SAM) في هذه الورقة. يوصى باستخدام خط خلوي أبوي مشترك من SAM المستجيب للإصابة بمختلف الاستهداف أو غير الاستهداف gRNAs ، خاصة إذا تمت مقارنة آثارها.
  4. استخدم النشاف الغربي لتحديد ما إذا كانت الخلايا تعبر بثبات عن البروتينين المستجيبين (يظهر مثال في الشكل 4 أ). استخدم النسخ العكسي لإجمالي الحمض النووي الريبي متبوعا ب PCR الكمي (RT-qPCR) كطريقة بديلة لفحص مستويات التعبير عن اثنين من mRNAs (dCas9-VP64 و MS2-p65-HSF1 ، الشكل 4 ب).
    ملاحظة: تتوفر البادئات لفحص مستويات mRNA لمؤثري dCas9 في الجدول التكميلي 1.
  5. قم بتوليد فيروس عدسي من gRNAs التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.5 وإصابة خط خلايا SAM المستقر الذي يعبر بشكل مزدوج عن dCas9-VP64 و MS2-p65-HSF1 مع فيروس lentivirus gRNA الفردي. أضف زيوسين (100 ميكروغرام / مل لخلايا MCF7) إلى متوسط 24 ساعة بعد نقل الفيروس gRNA. إنشاء عنصر تحكم سلبي يعبر عن gRNA غير المستهدف (NT-gRNA) في خط خلايا SAM الأبوي.
    ملاحظة: تأكد من أن دواء الاختيار محدد لبناء الاهتمام.

8. استخراج الحمض النووي الريبي والكمي RT-PCR لفحص مستويات eRNA

  1. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من خطوط خلايا SAM التي تعبر عن NT-gRNA أو استهداف gRNAs باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي38 ، أو طريقة أخرى قائمة على كلوروفورم الفينول. استخدم خلايا التقاء ~ 80٪ في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار لاستخراج الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: لم يلاحظ أي فرق كبير في ممارستنا للكشف عن الحمض النووي الريبي عند استخراج الحمض النووي الريبي إما عن طريق أعمدة الربط التجاري أو بواسطة كواشف كلوروفورم الفينول.
  2. اصنع الحمض النووي التكميلي (cDNA) من الحمض النووي الريبي المنقى عن طريق تفاعل النسخ العكسي باستخدام سداسي عشوائي ، باتباع بروتوكول الشركةالمصنعة 39. شروط الاستخدام في الجدول التكميلي 2.
    ملاحظة: نظرا لأن غالبية eRNAs غير متعددة الأدينيل1،2،4،9،10 ، يتم استخدام السداسي العشوائي بشكل روتيني لتوليد (كدنا).
  3. صمم بادئات ل RT-qPCR لقياس eRNAs المستهدفة باستخدام أداة تصميم برايمر ذات سمعة طيبة (على سبيل المثال ، التمهيدي 3). اختبر خطية التضخيم لأزواج التمهيدي من خلال فحص ما إذا كانت البادئات ستضخم خطيا cDNAs المخففة التسلسلية وتظهر الاختلافات المتوقعة في دورة qPCR. شروط الاستخدام في الجدول التكميلي 2.
    ملاحظة: يجب أن تستهدف بادئات RT-qPCR المنطقة المنسوخة للغاية في تسلسل الحمض النووي الريبي الناشئ ، ويجب أن يتضمن اختبار الخطية للبادئات مجموعة واسعة من تخفيفات الحمض النووي (كدنا) لضمان اختبار جميع مستويات الحمض النووي الريبي المرسال التي يمكن مواجهتها. يظهر مثال على اختبار الخطية في الشكل 5 أ.
  4. قم بإجراء RT-qPCR وتحليل مستويات تعبير eRNA في خلايا التحكم (خط خلية SAM مع NT-gRNA) وفي خط خلية SAM باستخدام gRNAs التي تستهدف eRNA (على سبيل المثال ، NET1e gRNA # 1) (على سبيل المثال ، الشكل 6 أ). يتم عرض بادئات NET1e RNA في الجدول التكميلي 1. شروط الاستخدام في الجدول التكميلي 2.  

9. dCas9 ChIP و qPCR

ملاحظة: هذه الخطوة هي تجربة اختيارية للتحقق من صحة ارتباط مركب dCas9 / SAM-gRNA بمحسن الهدف بواسطة gRNAs المحددة. بينما يتم تشجيع المستخدمين على تنفيذ هذه الخطوة ، فليس من الضروري اختبار كل gRNA على حدة. راجع المثال الموضح في الشكل 5 ب. راجع البادئات المدرجة في الجدول التكميلي 1.

  1. خلايا الارتباط المتقاطع
    1. قم بإزالة الوسط من الخلايا وأضف 1٪ فورمالديهايد المذاب في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). اتركيه لمدة 10 دقائق.
    2. أضف 2.5 M glycine بحجم 1:20 لإخماد الربط المتقاطع وغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المثلج. أضف 700 ميكرولتر من PBS المثلج وكشط الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. انتقل إلى الخطوة 9.2 ، أو قم بالتجميد وتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  2. سونيكات
    1. اصنع مخازن LB1 و LB2 و LB3 جديدة. LB1: 50 ملي مولار Hepes-KOH (درجة الحموضة 7.5) ، 140 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي EDTA ، 10٪ جلسرين ، 0.5٪ NP-40 ، 0.25٪ تريتون-X 100 و 1x مثبط البروتينات. LB2: 10 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي EDTA ، 0.5 ملي EGTA و 1x مثبط للبروتين. LB3: 10 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي EDTA ، 0.5 ملي EGTA ، 0.1٪ Na-Deoxycholate ، 0.5٪ N-lauroylsarcosine و 1x مثبط البروتين. مكمل 1x مثبط البروتياز طازجا إلى المخزن المؤقت قبل التجربة.
    2. أضف 1 مل من المخزن المؤقت LB1 إلى كريات الخلية، وقم ببئر الماصة، وقم بالتدوير عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق، ثم قم بالدوران عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية ، وأضف 1 مل من المخزن المؤقت LB2 ، وقم بالتدوير عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم قم بالدوران عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية وقم بإزالة فائض المخزن المؤقت LB2. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت LB3.
    3. صوتنة وتقطيع الحمض النووي للكروماتين إلى متوسط حجم ~ 200-400 نقطة أساس باستخدام نظام صوتي مناسب. بعد الصوتنة ، أضف 30 ميكرولتر من 10٪ Triton-X 100 واخلطها جيدا. اختبر وقت الصوتنة المناسب إذا تم استخدام خط خلية جديد.
    4. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لإزالة الحبيبات. انقل المادة الطافية إلى الأنبوب الجديد وأضف 630 ميكرولتر من LB3 و 70 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 إلى حجم إجمالي قدره 1 مل. أضف 2 ميكروغرام من الجسم المضاد Cas9 إلى المادة الطافية وقم بتدويرها عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  3. التقاط المركب المناعي والربط المتقاطع العكسي
    1. تحضير المخزن المؤقت RIPA (50 ملي مولار هيبس الرقم الهيدروجيني 7.6 ، 1 ملي EDTA ، 0.7٪ Na-deoxycholate ، 1٪ NP-40 ، 0.5 M LiCl) ومخزن الشطف (1٪ SDS و 0.1 M NaHCO3).
    2. اغسل Protein G dynabeads مع 1٪ BSA في PBS 3 مرات و LB3 buffer مرة واحدة.
    3. أضف 30 ميكرولتر من دينابيدات البروتين G إلى العينة واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات.
    4. اغسل مركب الخرز المناعي في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA 6x. لا تدع الخرز يجف.
    5. اغسل مركب الخرز المناعي مرة واحدة باستخدام عازلة TE ؛ قم بإزالة المخزن المؤقت.
    6. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى مركب الخرز المناعي والدوامة. ثم ضعه في شاكر ساخن قابل لضبط درجة الحرارة على 65 درجة مئوية مع اهتزاز 600 دورة في الدقيقة لمدة 6-16 ساعة لعكس التشابك.
  4. استخراج الحمض النووي
    1. قم بإزالة الأنابيب من شاكر ، وقم بتدوير الخرزات لفترة وجيزة وضعها على حامل مغناطيسي. انقل 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.
    2. أضف 1 ميكرولتر من RNase A (1 مجم / مل) إلى الأنبوب واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    3. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، أضف 2 ميكرولتر من البروتيناز K (20 مجم / مل) إلى العينة واحتضانها عند 65 درجة مئوية لمدة ساعتين.
    4. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة وأضف 400 ميكرولتر من خليط الكحول الفينول - الكلوروفورم - الأيزواميل. تخلط جيدا ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 10,000 × جم.
    5. انقل 400 ميكرولتر من الطبقة العليا إلى أنبوب سعة 1.7 مل يحتوي على 16 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم و 1 ميكرولتر من الجليكوجين (20 ميكروغرام / ميكرولتر) واخلطه جيدا.
    6. أضف 800 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ واتركه طوال الليل عند -20 درجة مئوية.
    7. في صباح اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 4 درجات مئوية عند 14,000 × جم لمدة 15 دقيقة.
    8. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الحبيبات ب 1 مل من 70٪ إيثانول. قم بالدوران عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق.
    9. قم بإزالة الإيثانول ، والحبيبات الجافة في الهواء ، وأعد تعليقها في 50 ميكرولتر من TE (10 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 1 ملي مولار EDTA).
  5. قم بإجراء ChIP-qPCR لفحص تجنيد مجمع SAM في موقع الاستهداف بواسطة زوج من التمهيدي المحسن لاستهداف النواة. استخدم زوجا تمهيديا يستهدف منطقة غير ذات صلة كعنصر تحكم سلبي.

10. مقايسة نمو الخلية والاختبارات الوظيفية الأخرى للتنشيط المفرط للحمض النووي الريبي المرسال

  1. قم بترشيح خطوط خلايا SAM التي تعبر عن gRNA غير المستهدفة أو gRNAs التي تستهدف eRNA ولوحة ~ 3,000 خلية لكل بئر في لوحة 96 بئر.
  2. قم بقياس نمو الخلايا باستخدام جهاز تصوير الخلايا الحية أو طرق أخرى (على سبيل المثال ، عد الخلايا ، أو فحص ملح التيترازوليوم القابل للذوبان في الماء -1).
  3. استخدم التركيز المثبط نصف الحد الأقصى (IC50) لاختبار الاستجابات الخلوية لأدوية سرطانية معينة في الخلايا التي تحتوي على أو بدون تعبير NET1e عن طريق SAM15.
    ملاحظة: يتم تقديم نتائج فحوصات نمو الخلايا واختبارات حساسية الدواء لخلايا سرطان الثدي بعد الإفراط في التعبير عن eRNA المنسوخ بجوار جين NET1 ، والذي تمت الإشارة إليه باسم NET1e15. يمكن إجراء فحوصات أخرى على المستوى الخلوي أو الكائنات الحية بناء على حاجة كل مشروع محدد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 1 سير العمل العام لهذا البروتوكول. كان تركيزنا على الحمض النووي الريبي التمثيلي ، NET1e15 ، والذي يتم التعبير عنه بشكل مفرط في سرطان الثدي ، والذي تم استخدام نظام SAM لتنشيط ودراسة دوره البيولوجي في تنظيم التعبير الجيني وتكاثر الخلايا والاستجابة للأدوية السرطانية. بالنسبة لمحسن NET1 هذا ، تم وضع علامة على العديد من قمم p300 ChIP-Seq ، محاطة بنصوص eRNA المكتوبة (الشكل 2أ ، ب). استنادا إلى إشارا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بناء على بياناتنا ، نستنتج أن نظام SAM مناسب لدراسة دور eRNAs في تنظيم الأنماط الظاهرية الخلوية ، على سبيل المثال ، نمو الخلايا أو مقاومة الأدوية. ومع ذلك ، فإن تصميم الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي الدقيق مطلوب لتنشيط الحمض النووي الريبي المرسال القوي ، للأسباب التالية. بادئ ذي بدء ، يظل موقع بدء النسخ (TSS) لل eRNA في كل خط / أنواع خلايا محددة أقل وضوحا. نتيجة لذلك ، يجب استخدام المعلومات اللاجينية (على سبيل المثال ، ChIP-Seq من H3K27ac ، لعوامل النسخ ، أو p300) ، ونشاط النسخ ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية لمعهد الوقاية من السرطان وأبحاثه في تكساس.

شكر وتقدير

يتم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة إلى WL (معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس ، CPRIT RR160083 و RP180734. المعهد الوطني للتحقيق K22CA204468; NIGMS R21GM132778; جائزة جامعة تكساس UT Stars ؛ ومؤسسة ويلش AU-2000-20190330) وزمالة ما بعد الدكتوراه إلى JL (برنامج UTHealth للابتكار لأبحاث الوقاية من السرطان ، زمالة ما بعد الدكتوراه ، CPRIT RP160015). نحن نقر بالدعايةالأصلية 15 حيث تم اعتماد بعض أرقامنا الحالية (مع التعديلات) ، والتي تتبع ترخيص المشاع الإبداعي (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBIEngland BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
محلول Deoxynucleotide (dNTP)New England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco' s النسر المعدل متوسطكورنينج10-013 سم
Dynabeads البروتين Gثيرمو فيشر العلمي65002
EDTAثيرمو فيشر العلميBP118-500
EGTASigmaE3889
مصل الأبقار الجنينيGenDEPOTF0900-050
الجليكوجينالحرارية فيشر 10814010 العلمي
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte جهاز تحليل الخلاياEssen BioScienceIncuCyte S3 نظام تحليل
lenti_ dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2) _zeo العمود الفقريAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3< / sub>Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM مصل منخفض متوسطحراري فيشر العلمي31985070
PES مرشح حقنةBASIX13-1001-07
مثبط البروتياز كوكتيل لوحيروش التشخيصي11836145001
pSpCas9 (BB) -2A-PuroAddgene62988
Q5 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةنيو إنجلاند BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction EnzymeNew England BioLabs Inc.نظام الكشف B7203S
RT-qPCRThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-RadLaboratories 1725274
Stbl3 خلية مختصةThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV نسخة عكسيةThermo Fisher Scientific719000
مجموعات الكشف عن طفرات المساحتقنيات الحمض النووي المتكاملة706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase تفاعل عازلةنيو إنجلاند BioLabs Inc.B0202S
TE عازلةThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal CyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p
إنزيم تقييد New مزيج الحية الخلايا الحية Buffer

المراجع

  1. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  3. Kundaje, A., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  5. Heinz, S., Romanoski, C. E., Benner, C., Glass, C. K. The selection and function of cell type-specific enhancers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 144-154 (2015).
  6. Ong, C. T., Corces, V. G. Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression. Nature Reviews Genetics. 12 (4), 283-293 (2011).
  7. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  8. Grossman, S. R., et al. Systematic dissection of genomic features determining transcription factor binding and enhancer function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1291-1300 (2017).
  9. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  10. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics. 17 (4), 207-223 (2016).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  13. Lee, J. H., Xiong, F., Li, W. Enhancer RNAs in cancer: regulation, mechanisms and therapeutic potential. RNA Biology. , 1-10 (2020).
  14. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  15. Zhang, Z., et al. Transcriptional landscape and clinical utility of enhancer RNAs for eRNA-targeted therapy in cancer. Nature Communications. 10 (1), 4562(2019).
  16. Chen, H., et al. A Pan-Cancer Analysis of Enhancer Expression in Nearly 9000 Patient Samples. Cell. 173 (2), 386-399 (2018).
  17. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  18. Lubelsky, Y., Ulitsky, I. Sequences enriched in Alu repeats drive nuclear localization of long RNAs in human cells. Nature. 555 (7694), 107-111 (2018).
  19. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  20. Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., Barbas, C. R. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14628-14633 (1995).
  21. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  22. Hirai, H., Tani, T., Kikyo, N. Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA. International Journal of Developmental Biology. 54 (11-12), 1589-1596 (2010).
  23. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. Altering the RNA binding specificity of a translational repressor. Journal of Biological Chemistry. 269 (12), 9006-9010 (1994).
  24. Schmitz, M. L., Baeuerle, P. A. The p65 subunit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-kappa B. EMBO Journal. 10 (12), 3805-3817 (1991).
  25. Vihervaara, A., Sistonen, L. HSF1 at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 2 261-266 (2014).
  26. Core, L. J., et al. Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nature Genetics. 46 (12), 1311-1320 (2014).
  27. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  28. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2020).
  29. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  30. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. , (2020).
  31. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), e57998(2018).
  32. Al-Allaf, F. A., Tolmachov, O. E., Zambetti, L. P., Tchetchelnitski, V., Mehmet, H. Remarkable stability of an instability-prone lentiviral vector plasmid in Escherichia coli Stbl3. 3 Biotech. 3 (1), 61-70 (2013).
  33. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  34. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  35. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  36. Quick-DNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_d3024_d3025_quick-dna_miniprep_kit.pdf (2020).
  37. SURVEYOR Mutation Detection Kit. IDT. , Available from: https://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/user-guide-manual/surveyor-kit-for-gel-electrophoresis-user-guide.pdf?sfvrsn=a9123407_6 (2020).
  38. Quick-RNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1054_r1055_quick_rna_miniprep_kit.pdf (2020).
  39. SuperScript IV Reverse Transcriptase Product Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/SSIV_Reverse_Transcriptase_UG.pdf (2020).
  40. Ounzain, S., et al. Functional importance of cardiac enhancer associated noncoding RNAs in heart development and disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 76, 55-70 (2014).
  41. McCleland, M. L., et al. CCAT1 is an enhancer-templated RNA that predicts BET sensitivity in colorectal cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 639-652 (2016).
  42. Miao, Y., et al. Enhancer-associated long non-coding RNA LEENE regulates endothelial nitric oxide synthase and endothelial function. Nature Communications. 9 (1), 292(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نظام dCas9 SAMتنشيط eRNAالمسح باستخدام CRISPRالتحقق بواسطة RT-qPCRتصميم gRNAارتباط عامل النسختنظيم الجيناتنمذجة الأمراضدراسات اكتساب الوظيفة

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.