مقالة منهجية

شاشة القامع لتوصيف الروابط الوراثية التي تنظم العمر الزمني في Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/61506

⸱

سبتمبر 17, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, William Paterson University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا هو بروتوكول لتحديد التفاعلات الجينية من خلال زيادة عدد الشاشة عدد في Saccharomyces cerevisiae. هذه الطريقة تسمح للباحثين لتحديد واستنساخ واختبار القامع في المسوخ الخميرة قصيرة الأجل. نحن اختبار تأثير زيادة عدد نسخة من SIR2 على عمر في متحولة فارغة autophagy.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشيخوخة هي التدهور الزمني الذي يعتمد على العمليات البيولوجية الطبيعية للكائن الحي الذي يزيد من احتمال الوفاة. العديد من العوامل الوراثية تساهم في التعديلات في عملية الشيخوخة الطبيعية. وتتقاطع هذه العوامل بطرق معقدة، كما يتضح من ثروة الروابط الموثقة التي تم تحديدها وحفظها في العديد من الكائنات الحية. تركز معظم هذه الدراسات على فقدان الوظيفة، والمسوخ الفارغة التي تسمح بالفحص السريع للعديد من الجينات في وقت واحد. هناك عمل أقل بكثير يركز على وصف الدور الذي فرط التعبير عن جين في هذه العملية. في العمل الحالي، ونحن نقدم منهجية واضحة لتحديد واستنساخ الجينات في الخميرة في مهدها، Saccharomyces cerevisiae، للدراسة في قمع نمط نمط العمر الزمني قصير الأجل ينظر في العديد من الخلفيات الوراثية. وقد صُمم هذا البروتوكول ليكون في متناول الباحثين من طائفة واسعة من الخلفيات وفي مختلف المراحل الأكاديمية. تم اختيار الجين SIR2 ، الذي رموز لديسيتيلاز هيستون ، للاستنساخ في ناقلات pRS315 ، كما كانت هناك تقارير متضاربة حول تأثيره على العمر الزمني. SIR2 أيضا يلعب دورا في autophagy، والتي تنتج عندما تعطل عن طريق حذف العديد من الجينات، بما في ذلك عامل النسخ ATG1. كدليل على المبدأ، ونحن استنساخ الجين SIR2 لأداء شاشة القامع على عمر تقصير النمط الظاهري سمة من autophagy ناقص atg1Δ mutant ومقارنتها بخلاف ذلك isogenic، نوع البرية نوع الخلفية الوراثية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشيخوخة هي فقدان السلامة التي تعتمد على الوقت في عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية التي تزيد في نهاية المطاف من احتمال موت الكائنات الحية. الشيخوخة أمر لا مفر منه تقريبا لجميع الأنواع. على المستوى الخلوي هناك العديد من السمات المميزة التي تتميز جيدا التي ترتبط بالشيخوخة، بما في ذلك: عدم الاستقرار الجينومي، والتعديلات اللاجينية، وفقدان بروتيوستاسيس، الخلل الميتوكوندريا، واستشعار المغذيات غير منظم، والشيخوخة الخلوية، والاستنزاف التيلومير1،2. في الكائنات وحيدة الخلية، مثل الخمائر، وهذا يؤدي إلى الحد من إمكانية التكرار والعمر الزمني3،4. تظهر هذه التغيرات الخلوية في الكائنات الحية الأكثر تعقيدًا ، مثل البشر ، كالأمراض التي تشمل السرطانات ، وفشل القلب ، والتنكس العصبي ، والسكري ، وهشاشة العظام5،6،7. على الرغم من التعقيدات العديدة التي تميز عملية الشيخوخة ، هناك الحفاظ على هذه السمات الجزيئية الكامنة في هذه العملية عبر الكائنات الحية المتباينة على نطاق واسع8،9،10. أدى تحديد التعديلات على هذه المسارات أثناء الشيخوخة إلى إدراك أنه يمكن التلاعب بها عن طريق تغيير نمط الحياة – يظهر التقييد الغذائي لإطالة عمر الحياة بشكل كبير في العديد من الكائنات الحية11. هذه المسارات تتلاقى وتتقاطع مع بعضها البعض ومع العديد من المسارات الأخرى، بطرق معقدة. إن توضيح وتوصيف هذه التفاعلات يوفر إمكانية التدخلات العلاجية لإطالة العمر والصحة12،13،14.

حفظ الأسس الجزيئية للشيخوخة يسمح للتشريح الوظيفي للتفاعلات الوراثية الكامنة وراء العملية من خلال استخدام أبسط الكائنات الحية نموذج – بما في ذلك في الخميرة في مهدها, Saccharomyces cerevisiae15,16. هناك نوعان من الشيخوخة الراسخة على غرار الخميرة في مهدها: الشيخوخة الزمنية (العمر الزمني، CLS) والشيخوخة المتماثلة (عمر النسخ المتماثل، RLS)17. يقيس التقادم الزمني مقدار الوقت الذي يمكن أن تبقى الخلية في حالة غير منقسمة. وهذا مشابه للشيخوخة التي ينظر إليها في الخلايا التي تنفق غالبية حياتهم في G0, مثل الخلايا العصبية4. بدلاً من ذلك، عمر تكراري هو عدد المرات التي يمكن أن تقسم خلية قبل الإرهاق وهو نموذج لأنواع الخلايا النشطة mitoticly (على سبيل المثال، عدد الخلايا البناتية التي يمكن أن يكون خلية)18.

الهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم بروتوكول يسمح بالتشريح الوظيفي لعلم الوراثة من الشيخوخة باستخدام S. cerevisiae. في حين كانت هناك العديد من الدراسات الممتازة التي قام بها العديد من الباحثين والتي أدت إلى فهمنا الحالي ، لا تزال هناك العديد من الفرص المتاحة للباحثين الناشئين للمساهمة في مجال الشيخوخة من وقت مبكر في حياتهم الأكاديمية. نقدم منهجية واضحة من شأنها أن تسمح للباحثين للمضي قدما في مجال الشيخوخة. تم تصميم هذا البروتوكول ليكون في متناول جميع الباحثين بغض النظر عن المرحلة في حياتهم الأكاديمية من خلال توفير الأدوات اللازمة لصياغة واختبار فرضياتهم الجديدة. وميزة نهجنا هو أن هذه طريقة فعالة من حيث التكلفة يمكن الوصول إليها بسهولة لجميع الباحثين بغض النظر عن المؤسسة – ولا تتطلب معدات مكلفة ومتخصصة ضرورية لبعض البروتوكولات19. هناك عدة طرق مختلفة لتصميم هذا النوع من الشاشة ، والنهج المبين في هذا العمل هو قابل بشكل خاص لفحص المسوخ فارغة من الجينات غير الأساسية التي تظهر انخفاضا حادا في العمر الزمني مقارنة سلالة ايزوجيني البرية من الخميرة.

كدليل لدينا من حيث المبدأ، ونحن استنساخ SIR2، وهو deacetylase lysine ذكرت كما عرض كل من امتداد وCLS تقصير عندما overexeded. تم العثور مؤخرا على OVEREXPRESSION SIR2 لزيادة CLS في الخمائر صناعة النبيذ; ومع ذلك، فقد أبلغت عدة مجموعات لا توجد صلة بين SIR2 وCLS التمديد، وترك دورها تحت20،21،22. بسبب هذه التقارير المتضاربة في الأدبيات، اخترنا هذا الجين لإضافة بحث مستقل للمساعدة في توضيح دور SIR2 في الشيخوخة الزمنية، إن وجدت. بالإضافة إلى ذلك، زيادة عدد نسخة من homologue SIR2 يمتد عمر في نظام دودة nematode نموذج23.

Autophagy هو نظام تدهور داخل الخلايا لتقديم منتجات cytosolic ، مثل البروتينات والعضيات ، إلى lysosome24. يرتبط Autophagy ارتباطا وثيقا بطول العمر من خلال دوره في البروتينات التالفة المتدهورة والعضيات للحفاظ على التوازن الخلوي25. يعتمد تحريض autophagy على تنسيق التعبير عن العديد من الجينات ، وحذف جين ATG1 النتائج في CLS قصيرة بشكل غير طبيعي في خميرة26في مهدها. رموز ATG1 للبروتين سيرين / ثريونين كيناز المطلوب لتكوين الحوية في autophagy وسيتوبلازم إلى vacuole (ما يعادل lyosomal الفطرية) المسار27,28. هنا، نقدم طريقتنا لزيادة عدد الشاشة نسخة، واختبار تأثير زيادة نسخة SIR2 على CLS في نوع البرية وsهوة - خلفية فارغة atg1. وهذه الطريقة قابلة بصفة خاصة للباحثين المبتدئين ومجموعات البحث في المؤسسات الجامعية في المقام الأول، التي يخدم الكثير منها المجتمعات المحلية الممثلة تمثيلا ناقصا في العلوم وتكون مواردها محدودة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1- تحديد التفاعلات الجينية المحتملة للفحص

  1. تحديد الخلفية الوراثية (الخلفيات) للتوصيف، التي تؤدي إلى فترة حياة زمنية قصيرة بشكل غير طبيعي (CLS) في Saccharomyces cerevisiae باستخدام قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces (SGD، https://www.yeastgenome.org29،30)،الذي يجمع المعلومات الظاهرية المعروفة لهذا الكائن الحي.
    1. حدد علامة التبويب "دالة" من الخيارات في أعلى صفحة الويب.
    2. حدد النمط الظاهري متبوعاً بتحديد استعراض كافة الأنماط الظاهرية.
    3. من Yeast الظاهرية خيارات Ontology انتقل إلى عنوان فرعي تطوير وحدد العمر الزمني، وجدت تحت عنوان العمر الفرعي.
    4. حدد المؤهل لتناقص، والذي يسمح لتحديد الجينات التي تظهر النمط الظاهري الذي ينتج في نمط ظاهري عمر زمني أقل عند حذفها. لهذا دليل من الأسلوب تم اختيار atg1Δ، والتي تؤدي إلى نمط ظاهري CLS قصير الأجل وتعطل ل autophagy26.
  2. تحديد الجينات المستهدفة (الجينات) التي يمكن فحصها للكشف عن التفاعلات الجينية التي قد تقمع النمط الظاهري، استناداً إلى سمات علم الأنطولوجيا المبلغ عنها أو المتنبأ بها، للمتحول الذي تم تحديده في الجزء 1-2. كرر البحث عن النمط الظاهري كما هو موجود في الخطوات 1.1.1-1.1.4 أعلاه، الاستعلام عن الجينات التي ينتج عنها CLS أطول عند التعبير الزائد في خلفية من نوع البرية. تم اختيار SIR2 استنادا إلى النمط الظاهري CLS ذكرت والتفاعلات مع autophagy31،32.

2. إعداد الكواشف

ملاحظة: ما لم يحدد خلاف ذلك أوتوكلاف كل حل في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتعقيم قبل الاستخدام.

  1. YPAD وسائل الإعلام السائلة: إضافة 1٪ استخراج الخميرة، 2٪ بيبتون، 2٪ Dextrose (الجلوكوز)، و 40 ملغ أدينين (كما كبريتات أدينين التجفيف) لكل لتر من الماء المقطر مزدوجة. تخلط جيدا مع مُحرك مغناطيسي.
  2. LB سائل وسائل الإعلام: إضافة Tryptone (10 غرام), استخراج الخميرة (5 ز), وكلوريد الصوديوم (10 غرام) لكل لتر من الماء المقطر مزدوجة. تخلط جيدا مع مُحرك مغناطيسي.
  3. إعداد 1000x (100 ملغ / مل) أمبيسيلين الأوراق المالية، في الماء المقطر مزدوجة. تخلط جيدا وتصفية تعقيم.
  4. الاصطناعية كاملة – Leucine (SC-LEU) وسائط سائلة: إضافة 1.7 غرام من قاعدة نيتروجين الخميرة ث / س الأحماض الأمينية, 2% الجلوكوز, 1.92 غرام من SC-LEU التسرب مزيج, 5 غرام من كبريتات الأمونيوم لكل لتر من الماء المقطر مزدوجة. تخلط جيدا مع مُحرك مغناطيسي.
  5. TE العازلة: خلط تريس (10 mM التركيز النهائي)، EDTA (1 mM التركيز النهائي) في الحل مع الماء المقطر مزدوجة. تخلط جيدا مع مُحرك مغناطيسي.
  6. إعداد 50٪ PEG 3350 في حل مع الماء المقطر مزدوجة. تخلط جيدا مع مُحرك مغناطيسي.
  7. إعداد 1 M و 100 mM محلول خلات الليثيوم مع الماء المقطر مزدوجة. تخلط جيدا مع مُحرك مغناطيسي.
    ملاحظة: لجعل لوحات agar الصلبة إضافة 20 غرام من أجار (لكل لتر مع الماء المقطر مزدوجة) إلى وسائل الإعلام التي أعدت في 2.1 و 2.2 أعلاه قبل autoclaving. إذا كان إعداد ألواح الأمبيسيلين إضافة 1mL من الأمبيسلين إلى وسائل الإعلام في 2.2 أعلاه بعد أن تبريدها إلى ما يقرب من 60 درجة مئوية. صب في لوحات معقمة والسماح لتعيين ل48-72 ح قبل استخدامها. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية للتخزين لفترة أطول.

3. تصميم استراتيجية الاستنساخ لاستنساخ SIR2 في ناقلات pRS315

  1. تصميم ال التمهيدي PCR لتضخيم الجين SIR2 للاستنساخ في ناقلات pRS315.
    1. تصميم التمهيدي يدويا أن يكون التكامل 21-22 النيوكليوتيدات إلى المناطق intergenic المنبع والمصب من SIR2. تأكد من أن الجين بأكمله، جنبا إلى جنب مع المناطق غير المترجمة من مرنا يتم استنساخها عن طريق رسم خرائط تلك الميزات من مجموعات البيانات المتاحة33،34.
    2. تأكد من أن التصميم التمهيدي لـ PCR ينتج عنه التمهيديات الأمامية والناقلة التي تحتوي على درجة حرارة ذوبان أعلى من 53 درجة مئوية وأقل من 60 درجة مئوية.
      ملاحظة: من الناحية المثالية، يجب أن يكون لكل التمهيدي Tm أقرب إلى بعضها البعض كما سيسمح التسلسل، مع محتوى GC تقريبي من 40-50٪، مع التأكد من تجنب تكرار دينوكليوتيد وتحقيق التوازن بين GC وتوزيع AT في جميع مراحل التسلسل.
    3. بعد تصميم التمهيديات PCR التي من شأنها أن تسمح لتوليد أمبيركون للاستنساخ، إضافة تقييد هضم الإنزيم (R.E.D.) المواقع المستهدفة إلى نهاية 5 ' من كل التمهيدي التي تتوافق مع ناقلات البلازميد الاستنساخ. في هذه الطريقة، يتم إضافة موقع الهضم الإنزيم تقييد HindIII (5'-AAGCTT-3') إلى المنبع، التمهيدي إلى الأمام وموقع الهضم إنزيم SacII تقييد (5'-CCGCGG-3') إلى المصب، التمهيدي العكسي.
      ملاحظة: يتطلب استخدام مواقع SacII و HindIII أن موقع القطع التوافقي لكل من endonuclease غير موجود في الجين المستهدف. إذا كان أي من أهداف الإنزيم داخل الجين المستهدف، ينبغي اختيار إنزيمات تقييد بديلة. هناك العديد من التي تتوافق مع منطقة polylinker على متجه pRS315.
    4. وأخيرا، إضافة أربعة نوكليوتيد (5'-NNNN-3') تسلسل تتراكم إلى نهاية 5 ' من كل التمهيدي للسماح إنزيم تقييد لربط وهضم أمبليكون. مرة واحدة وقد تم تصميم التمهيديات، وقد oligonucleotides توليفها تجاريا لاستخدام استنساخ الجين SIR2.
    5. Resuspension من التمهيديات PCR: الطرد المركزي التمهيدي PCR باستخدام microfuge الطاولة في أقصى سرعة لمدة 4 دقائق. إضافة TE الحل لجعل تركيز المخزون من 100 μM. تخزين تركيز المخزون في -20 درجة مئوية وتمييع 1/10 للاستخدام في تطبيقات PCR.
      ملاحظة: لجعل 100 μM الأسهم، حل التمهيدي في حجم عازلة TE العقيمة التي هي 10x كمية nmoles في أنبوب التمهيدي، وذلك باستخدام microliters من TE. على سبيل المثال، إذا كان الأنبوب يحتوي على 15.6 نانوكولات من التمهيدي، أضف 156 ميكرولتر من مخزن TE المؤقت.
  2. عزل البرية من نوع الخميرة gDNA لتضخيم PCR من بناء الاستنساخ SIR2.
    ملاحظة: العديد من الخيارات عالية الجودة متاحة تجاريا لعزل gDNA الخميرة. الاستفادة من مجموعة التي تشمل هضم جدار الخلية الفطرية مع نتائج zymolyase في gDNA أفضل جودة (أعلى عائد، وأقل الشوائب). البروتوكول أدناه يعود باستمرار تركيز عالية والنقاء. يمكن العثور على تفاصيل مجموعة من اللوازم التي نوصي بها في جدول المواد.
    1. تنمو 5 مل ثقافة من الخميرة من نوع البرية ل48-72 ح لمرحلة ما بعد السجل في وسائل الاعلام المخصب، مثل YPAD. بيليه خلايا الخميرة في > 800 س ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة وسائل الإعلام النمو، و resuspend في 120 ميكرولتر من zymolyase الهضم العازلة تكملها 5 ميكرولتر من zymolyase (2 وحدات انزيم / μL). اخلط العينة عن طريق الدوامة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    2. إضافة 120 ميكرولتر من العازلة التحلل chaotropic (على سبيل المثال، كلوريد guanidinium)، 250 ميكرولتر من الكلوروفورم، ودوامة العينة لمدة 60 s.
    3. أجهزة الطرد المركزي في >8000 x ز لمدة 2 دقيقة ونقل فائقة إلى عمود تنقية في أنبوب جمع معقمة.
    4. أجهزة الطرد المركزي في > 8000 x ز لمدة 60 S والتخلص من تدفق من خلال. gDNA سوف تكون مرتبطة بمصفوفة العمود.
    5. اغسل العمود مرتين بـ 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل القائم على الإيثانول، مع تكرار خطوة الطرد المركزي من الأعلى (3.2.4). تجاهل تدفق من خلال بعد كل تدور. قم بنقل العمود إلى أنبوب ميكروفروج 1.5 مل، وإضافة 60 ميكرولتر من عازلة TE، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 s. فلاش تدور عينة لمدة 30 s ل elute الحمض النووي.
      ملاحظة: تحديد تركيز الحمض النووي في العينة (الامتصاص في 260nm) والجودة (Absorbance 260nm/280nm). وسوف يكون العائد النموذجي 100-200 نانوغرام / ميكرولتر من gDNA مع نسبة الامتصاص في 260nm/280nm أقرب إلى 1.8 ممكن.
  3. تضخيم وعزل ناقلات pRS315 plasmid للاستنساخ.
    ملاحظة: تتوفر عدة خيارات عالية الجودة تجارياً لتنقية ناقلات البلازميد. ويوصى الكيمياء العمود القائم على السيليكا لهذه الخطوة. وقد أدت التغييرات المذكورة أدناه إلى أعلى تركيز ونقاء. التفاصيل موجودة في جدول المواد.
    1. تنمو 5 مل من ثقافة الإشريكية القولونية التي تحتوي على ناقلات pRS315 بين عشية وضحاها في LB + أمبيسيلين (80 ميكروغرام / مل) وسائل الإعلام. بيليه الثقافة عن طريق الطرد المركزي في > 8000 س ز لمدة 2 دقيقة في RT (15-25 درجة مئوية).
    2. إعادة تعليق الخلايا البكتيرية بيليه في 250 ميكرولتر من عازلة TE مع RNase A (100 ميكروغرام / مل) ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge. تأكد من عدم وجود كتل من الخلايا.
    3. إضافة 250 μL من العازلة تحلل ومزيج عن طريق عكس الأنبوب 6-8 مرات. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لا تسمح للتحلل أن تستمر لأكثر من 5 دقائق – أقل قليلا هو الأفضل.
    4. إضافة 350 μL من تحييد العازلة ومزيج على الفور وبشكل دقيق عن طريق عكس أنبوب 10 مرات. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقيقة في > 8000 x ز.
    5. نقل بعناية فائقة من فوق إلى عمود تدور السيليكا عن طريق الأنابيب. جهاز طرد مركزي لمدة 30 s والتخلص من تدفق من خلال.
    6. إضافة 500 ميكرولتر من مخزن غسيل الملح العالي والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3.3.5. تجاهل التدفق من خلال. اغسل عمود الدوران الملزم للحمض النووي بإضافة 750 ميكرولتر من مخزن الغسيل القائم على الإيثانول، لإزالة الأملاح المتبقية، والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3.3.5.
    7. تخلص من التدفق من خلال والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة إضافية في > 8000 x ز لإزالة المخزن المؤقت للغسيل المتبقي. ضع عمود الدوران في أنبوب ريفروجج 1.5 مل. إلى الحمض النووي elute، إضافة 20 ميكرولتر من العازلة TE إلى مركز العمود تدور، احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في > 8،000 س ز.
    8. استخدام مقياس الطيف لتحديد كمية (امتصاص في 260nm) ونوعية (امتصاص 260 نانومتر / 280 نانومتر) من الحمض النووي. وسوف يكون العائد النموذجي 1-2 ميكروغرام/ميكرولتر.
  4. تضخيم PCR من الجين المرشح، SIR2، من الحمض النووي الجينومي من نوع البرية
    1. لإنتاج أمبيركون مناسبة للاستنساخ، استخدم بوليميراز PCR عالي الدقة (HF) لتجنب التوليد غير المقصود للطفرات في التسلسل الذي يجري تضخيمه.
      ملاحظة: تتوفر العديد من خيارات PCR ذات الدقة العالية المختلفة تجارياً. ولتيسير تحسين ظروف تفاعل PCR، استخدم مزيجًا من العازلة: واحد هو عازل HF قياسي وواحد محسن لـ GC عالية و amplicons معقدة. يمكن الاطلاع على التفاصيل في جدول المواد.
    2. 10- إن PCR تزيد من بناء SIR2 للاستنساخ على النحو المبين في الجدول 1.
      ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من النجاح في خطوات الاستنساخ، يمكن إعداد 50 ميكرولتر متطابقة متعددة ومركّزة بواسطة خطوة تنظيف عمود PCR. تأكد من إعداد واحد لا gDNA قالب عنصر تحكم رد فعل (التحكم السلبي).
    3. إعداد شروط ركوب الدراجات PCR كما هو موضح في الجدول 2.
      ملاحظة: تختلف أزواج التمهيدي مختلفة على درجة حرارة الصلب الخاصة بهم و البوليميراز مختلفة وظيفة بسرعات مختلفة. تأكد من تحسين ظروف التضخيم بناءً على الإنزيم المحدد ومواصفات تركيبة التمهيدي كما تم تصميمها.
    4. تحقق من نجاح تفاعل PCR عن طريق تصور تفاعل PCR، الذي سينتج حوالي 2.5 كيلوبايت من أجزاء الحمض النووي، على هلام TAE-agarose بنسبة 1.0٪ (مع 0.5 ميكروغرام/مل بروميد إيثيديوم للتصور).
  5. الهضم وربط الجينات المرشحة، SIR2، في ناقلات بلازميد pRS315.
    1. تنفيذ هضم تقييد من الناقل وإدراج: 625 نانوغرام الحمض النووي (إما المتجه أو إدراج)، q.s. المياه لتحقيق حجم التفاعل النهائي إلى 50 ميكرولتر، 5 ميكرولتر من العازلة، 1 ميكرولتر SacII، و 1 ميكرولتر هند الثالث. احتضان الهضم تقييد في 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، تليها 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتدفئة تنشيط الانزيمات. يمكن تخزين الهضمات في 4 درجة مئوية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    2. إعداد 15 ميكرولتر تفاعل الربط لإنشاء plasmid المطلوب: 6 ميكرولتر من الماء المعقم، 2 μL هضم ناقلات (50 نانوغرام DNA)، 4 μL هضم إدراج (100 نانوغرام DNA)، 2 ميكرولتر T4 العازلة التفاعل، و 1 ميكرولتر من T4 الحمض النووي Ligase. احتضان التفاعلات الربط بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية، تليها 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتدفئة تعطيل الإنزيم.
      ملاحظة: قم بإعداد عنصر تحكم بدون إدراج، والاستعاضة عن 4 ميكرولتر إضافية من الماء المعقم (10 ميكرولتر مجموع) بدلا من إدراج.
    3. تحويل ردود الفعل الربط إلى الإشريكية القولونية.
      ملاحظة: هناك العديد من الخيارات المتوفرة للخلايا المختصة المتوفرة. يستخدم هذا البروتوكول الخلايا المختصة كيميائيا التي يتم تخزينها في -80 درجة مئوية قبل استخدامها.
      1. ذوبان أنبوب 50 ميكرولتر من المجمدة، والخلايا القولونية المختصة على الجليد حتى ذاب فقط وإضافة على الفور 15 ميكرولتر من تفاعل الربط. قم بالتمرير على الأنبوب عدة مرات. على الفور العودة الأنابيب إلى الجليد واحتضان لمدة 30 دقيقة.
      2. الحرارة صدمة الخلايا لمدة 20 s في حمام مائي في بالضبط 42 درجة مئوية، وعلى الفور العودة الأنابيب إلى الجليد لحضانة 2 دقيقة. أضف 450 ميكرولتر من وسائط استرداد درجة حرارة الغرفة (مثل SOC أو LB) لكل تفاعل تحويلي وحضن لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز.
      3. لكل تفاعل تحويل، وجعل تخفيف 1:10 من الخلايا. باستخدام تقنية معقمة، لوحة 150 ميكرولتر من الخلايا غير المخففة و 1:10 التخفيف على LB + (80 ميكروغرام / مل)35لوحات أمبيسيلين. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  6. شاشات التحويلات المحتملة لمتجه فرط التعبير.
    1. باستخدام تقنية معقمة، تلقيح التحويلات المحتملة التي نمت إلى 5 مل LB + (80 ميكروغرام / مل) أمبيسيلين وتنمو بين عشية وضحاها. بعد الإجراء المبين في القسم 3.3.1-3.3.7 أعلاه، قم بعزل البلازميدات عن كل تحويل محتمل وشاشة للاندماج الناجح للإدخال بواسطة هضم القيد متبوعاً بـ جل الكهرباء على هلام TAE-agarose بنسبة 1.0% (مع 0.5 ميكروغرام/مل بروميد الإتيهيدوم للتصور).

4. تحويل ناقلات إلى atg1Δ وسلالات الخميرة نوع البرية

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا باستخدام بروتوكول تحويل خلات الليثيومالمعدلة 36.

  1. بيليه 15 مل من نوع البرية و atg1- خلايا الخميرة فارغة نمت بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام YPAD إلى مرحلة مبكرة إلى منتصف السجل (O.D. 600nm = 0.4-0.9) من النمو لمدة 3 دقائق في > 800 س ز في درجة حرارة الغرفة.
  2. Decnatant الفائقة، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من ddHالعقيمة 2س ونقل محتويات أنبوب 1.7 مل microfuge. بيليه الخلايا لمدة 3 دقائق في > 800 × ز في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة فائقة وإعادة تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من خلات الليثيوم 100 mM مع الأنابيب لطيف. تقسيم الخلايا إلى أنابيب صغيرة منفصلة لكل من التحولات التي سوف تقوم بها. استخدام 50 ميكرولتر من الخلية ليثيوم خلات مزيج كل التحول.
  4. إعداد مزيج التحويل. إلى كل من التحولات إضافة: 240 μL من 50٪ PEG3350، 36 μL من 1.0 M خلات الليثيوم، و 5 ميكرولتر من الحيوانات المنوية السلمون (أو الناقل الآخر) الحمض النووي، مسلوق لمدة 5 دقائق وعلى الجليد.
    ملاحظة: الربط هو لزج جدا. الماصات وقياس بعناية. مزيج عن طريق الأنابيب بعد إضافة كل مكون قبل الانتقال.
  5. إضافة 5 μL من البلازميد المناسبة لكل تحويل تنفيذها. دوامة كل أنبوب لخلط دقيق. احتضان العينات في 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. عينات صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. خلايا بيليه لمدة 3 دقائق في > 800 × ز في درجة حرارة الغرفة، وإزالة بعناية مزيج التحول، وإعادة تعليق العينات في 300 ميكرولتر من ddHالعقيمة 2O. بيليه الخلايا عن طريق تكرار تدور أعلاه، وإزالة المياه بعناية، وإعادة تعليق العينات الخاصة بك في 200 ميكرولتر من ddHالعقيمة 2O.
  7. اقامة 1/10 و 1/100 التخفيف لكل سلالة تحول من الخميرة.
  8. باستخدام لوحة تقنية معقمة 150 μL من كل عينة على لوحات SC-leucine لتحديد لبلازميدات. نشر الخلايا بشكل موحد ومتعادل والسماح لصفيح لتجف قبل عكس واحتضان في 30 درجة مئوية لتنمو لمدة 48-72 ساعة.
    ملاحظة: بمجرد أن يتم إنشاء سلالة المناسبة، فإنه قد يتم تخزينها على المدى الطويل في 25٪ الجلسرين في -80 درجة مئوية. يمكن تحديد كمية عدد نسخة الحاضر من خلال العديد من المنهجيات ، بما في ذلك qPCR ، RNA - FISH ، أو تدبير آخر مناسب37،38.

5. تحديد فترة الحياة الزمني لاختبار لقمع CLS المختصرة

  1. اختبار تأثير overexpression من القامع المفترض على CLS في الخميرة قصيرة الأجل، atg1Δ mutant، عن طريق تحديد عدد وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) التي تبقى وظيفة من الوقت39.
    ملاحظة: من الضروري إعداد هذا الجزء من التجربة باستخدام عناصر التحكم المناسبة. وسوف تجربة نموذجية مقارنة سلالة من نوع البرية (WT) من الخميرة مع ناقل فارغ، WT مع ناقلات القامع، ومحو الحذف مع ناقل فارغة، ومحو الحذف مع ناقلات القامع.
    1. اتخاذ مستعمرة واحدة من سلالة لدراسة وتطعيمه في وسائل الإعلام نيهرو SC. تنمو الثقافة في 30 درجة مئوية لمدة 72 ساعة، مع اهتزاز.
    2. باستخدام مقياس الهيموسيت، تحديد تركيز الخلايا الموجودة في الثقافة40.
    3. تمييع aliquot من الثقافة، بحيث تكون النتيجة عدد موحد من الخلايا في حجم 150 ميكرولتر من الماء المعقم. لوحة الثقافة باستخدام تقنية عقيمة على لوحات SC-LEU وتنمو في 30 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. هذه اللوحات هي اليوم ثلاثة نقطة الوقت والتجربة سوف تطبيع إلى هذه النقطة الزمنية كما 100٪ قابلية البقاء39.
      ملاحظة: يجب أن يكون عدد الخلايا 200-500، كبير بما فيه الكفاية للتحليل وعدد يمكن التحكم فيه للعد. في هذه الدراسة، استخدمنا 200 خلية لكمية الطلاء لدينا.
    4. مواصلة احتضان الثقافات الخميرة في 30 درجة مئوية، مع aliquots العادية والطلاء كما هو مبين في 5.1.3. مواصلة هذه العملية حتى سلالات لم تعد قابلة للحياة، ثم تجميع وتحليل النتائج.
      ملاحظة: تم العثور على قائمة كاملة من السلالات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما أن هناك تقارير متضاربة حول دور SIR2 أثناء الشيخوخة، اخترنا هذا الجين للدراسة باعتبارها القامع المحتملة لـ atg1Δ mutant's shorten CLS النمط الظاهري26. دور SIR2 هو مثير للجدل إلى حد ما, مع تقارير متضاربة حول دورها في تمديد CLS, ومع ذلك فقد تم ربطها بوضوح إلى زيادة CLS في خلفية الخميرة واحد على الأقل, مع دور في كل من autophagy وitophagy22,31,32,41

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن كشف علم الوراثة عن الشيخوخة يشكل تحدياً صعباً، مع العديد من الفرص لمزيد من الدراسة التي يمكن أن تسفر عن رؤى كبيرة في التفاعلات المعقدة الموجودة. هناك العديد من الطرق التي تسمح للجيل السريع من المسوخ فقدان وظيفة لدراسة سلالات فارغة من الخميرة45،46. هذه الطريقة تقدم نهجا مباشرا لتحديد واستنساخ الجينات على ناقلات pRS315 للدراسات الكبح overexpression. إحدى مزايا هذا النهج هي أن هذا يسمح لفرط معتدل من ناقل مستقر ، والذي يمكن أن يتجنب أي تحديات غير متوقعة يمكن أن تن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه لا يوجد أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود جيمس ت. أرنوني أن ينوه بدعم الطلاب في دورة تقنيات الحمض النووي المؤتلف في 2017 و2018 في جامعة ويليام باترسون الذين شاركوا في هذا المشروع منذ بدايته، ولكن لم تتجاوز جهودهم عتبة التأليف: كريستوفر أندينو، خوان بوتيرو، جوزفين بوزان، بريندا كالابا، بريندا كوباس، هيدلوف إسل دادزي، إرفين غامارا، ، وين كو، نيلسون ميخيا، هيكتور موتولا، ربيعا ناز، عبد الله عودة، بيرل باغوتان، دانيال رازائي، غابرييلا رئيس الجامعة، عايدة شونو، وماثيو سو. أنتم علماء عظماء وأنا أفتقدكم جميعاً!

الكتاب يود أن نعترف بالدعم الذي لا يقدر بثمن من التعليم وتكنولوجيا البحوث في جامعة وليام باترسون لمساعدتهم : جريج ماتيسون ، بيتر Cannarozzi ، روب ماير ، دانتي بورتيلا ، وهنري هاينيتش. كما يود المؤلفون أن ينوهوا بمكتب النيابة لدعم العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية، ومكتب العميد ومركز البحوث في كلية العلوم والصحة، ودعمهم لهذا العمل، وقسم علم الأحياء لدعم هذا المشروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم الحمض النووي الفطري / البكتيريZymo ResearchD6005
إنزيم HindIIIHFنيو إنجلاند بيولوجيزR3104S
Phusion عالي الدقة DNA Polymeraseنيو إنجلاند BiolabsM0530S
طقم البلازميد المصغرQiagen12123
إنزيم SacIIنيو إنجلاند BiolabsR0157S
سمك السلمون المنويةالحمض النووي ثيرموفيشرAM9680
T4 DNA ligaseنيو إنجلاند BiolabsM0202S

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351(2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1(2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790(2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502(2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382(2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156(2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209(2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ATG1 SIR2

مقالات ذات صلة