يستخدم CRISPR/Cas9 بشكل متزايد لتوصيف وظيفة الجينات في الكائنات غير النموذجية. يصف هذا البروتوكول كيفية توليد خطوط خروج المغلوب من Culex pipiens، من إعداد خلطات الحقن ، إلى الحصول على أجنة البعوض وحقنها ، وكذلك كيفية تربية البعوض المحقون وعبوره وفحصه وذريه للطفرات المطلوبة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البعوض Culex هي النواقل الرئيسية للعديد من الأمراض التي تؤثر سلبا على صحة الإنسان والحيوان بما في ذلك فيروس غرب النيل والأمراض الناجمة عن الديدان الخيطية مثل دودة القلب الناب وداء الفيلة. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام تحرير الجينوم CRISPR /Cas9 للحث على الطفرات الموجهة إلى الموقع عن طريق حقن بروتين Cas9 الذي تم تعقيده مع الحمض النووي الريبي (gRNA) في الأجنة الطازجة من عدة أنواع من الحشرات ، بما في ذلك البعوض الذي ينتمي إلى جنس Anopheles و Aedes. إن التلاعب بعوض Culex وحقنه أكثر صعوبة قليلا لأن هذه البعوض تضع بيضها منتصبا في الطوافات بدلا من وضعها بشكل فردي مثل الأنواع الأخرى من البعوض. هنا نصف كيفية تصميم الحمض النووي الريبي ، وتعقيدها مع بروتين Cas9 ، وحمل البعوض الأنثوي من Culex pipiens على وضع البيض ، وكيفية إعداد وحقن الأجنة الموضوعة حديثا للتشخيص الدقيق مع Cas9 / gRNA. كما نقوم بوصف كيفية إعادة فحص البعوض المحقون وفحصه للكشف عن الطفرة المرغوبة. وتبين النتائج التمثيلية أن هذه التقنية يمكن استخدامها للحث على حدوث طفرات موجهة نحو الموقع في جينوم بعوض كوليكس، ويمكن استخدامها، مع تعديلات طفيفة، لتوليد طفرات فارغة في أنواع البعوض الأخرى أيضا.
المقدمة
يتم توزيع البعوض Culex في جميع أنحاء المناطق المعتدلة والاستوائية في العالم وينقل العديد من الفيروسات القاتلة بما في ذلك فيروس غرب النيل1، التهاب الدماغ سانت لويس2 وكذلك الديدان الخيطية التي تسبب دودة القلب ال3 وداءالفيلة 4. أعضاء مجمع Culex pipiens ، الذي يتضمن Cx. quinquefasciatus، Cx. pipiens pipiens و Cx. pipiens molestus، يظهرون اختلافات مذهلة في العديد من جوانب بيولوجيتهم. على سبيل المثال، في حين Cx. quinquefasciatus وCx. pipiens molestus غير قادرين على دخول نائمة overwintering5....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وفي معظم مؤسسات البحوث، يجب وضع بروتوكول معتمد للسلامة الأحيائية قبل توليد الحشرات المعدلة وراثيا أو صيانتها لضمان عدم هروب الكائنات المحورة وراثيا أو إزالتها من مرفق المختبر. وقد تطبق أيضا لوائح حكومية إضافية. قبل البدء في مشروع من هذا النوع، تحقق من جميع السياسات والإجراءات المؤسسية لتحديد الوثائق والموافقات المطلوبة.
1. تصميم gRNAs وإعداد يمزج الحقن
- تصميم 2-5 gRNAs لكل جين مستهدف حيث تعمل بعض gRNAs بشكل أفضل من غيرها. يمكن استخدام gRNAs التي تستهدف جين الاهتمام إما يدويا أو برامج مجانية ، مثل Chop-Chop.
- تصميم وطلب التمهيديات التي من شأنها تضخيم شظايا 100-200 نقطة أساس حول كل gRNA. من الناحية المثالية ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام البروتوكول الموصوف ، تمكنا من حقن أجنة Cx. pipiensبنجاح ، ولاحظنا معدلا مرتفعا للبقاء على قيد الحياة بين الأجنة المحقونة (~ 55 ٪ ، الشكل 1). كانت نسبة البقاء على قيد الحياة في التجارب السابقة أقل، على الأرجح لأن الجزء الأمامي من بصيلات البيض كان متصلا بشريط التضميد الطبي، مما منع يرقات البعوض من الهروب من المشيمة والسباحة بنجاح في الماء. ضمان أن تمتد النهاية الأمامية إلى ما وراء قطاع الضمادات الطبية زاد بشكل كبير من بقاء اليرقات ، ويؤدي إلى ذرية عالية الجودة قادرة على التطو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يقدم هذا البروتوكول طرقا لإدخال طفرات محددة في جينوم بعوض Culex ويمكن استخدامه لتحرير جينوم البعوض الآخر أيضا. البروتوكول مهم من حيث أنه يوفر تفاصيل محددة ليس فقط عن كيفية إعداد مواد الحقن ، ولكن أيضا لمحة عامة مفصلة عن كيفية حث البعوض على وضع البيض ، وكذلك كيفية إعداد وحقن تلك البيضات. كما نلخص كيفية الاستفادة من بيولوجيا الإناث Cx. pipiens لوضع البيض في الطوافات الفردية وبالتالي فحص نسبة أصغر من النسل من كل أنثى للطفرات المطلوبة. تم تحسين الأساليب المعروضة هنا ل Cx. pipiens ولكن يمكن تكييفها .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعمل RH في مرفق تحويل الحشرات ، الذي يقدم خدمات في التعديل الوراثي للحشرات.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور ديفيد أوبروشتا وجميع أعضاء شبكة أبحاث تنسيق التقنيات الوراثية الحشرية على المساعدة والتدريب الذي يقدمونه لنا وللآخرين على تنفيذ التقنيات الوراثية. نشكر بشكل خاص تشانا الوفيهاري لتحسين بروتوكول الضخ الدقيق للسماح بحقن أجنة Culex وتفقيسها. كما نشكر ديفانتي سيمونز وجوزيف أورسو، الطلاب الجامعيين العاملين في مختبر ميوتي، على مساعدتهم في رعاية وفحص البعوض المعدل وراثيا، وزورا إلمكامي من ال ITF للمساعدة في تربية البعوض وإعداده للحقن. وقد دعم هذا العمل منحة متعددة التخصصات من معهد الأمراض المعدية في جامعة ولاية أوسو قدمت إلى وزارة الميكنة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مغذي الأغشية الاصطناعية | Hemotek | SP5W1-3 | موقع الشركة: بلاكبيرن ، المملكة المتحدة |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | موقع الشركة: كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| أنابيب البورسليكات الزجاجية الشعرية ، القطر الخارجي 1 مم | World Precision Instruments | 1B100-6 | موقع الشركة: ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| BV10 إبرة شطف | SUTTER | BV-10-B | موقع الشركة: نوباتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| ترشيح دائري Whatman (12.5 سم) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | موقع الشركة: سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| أنبوب مخروطي (50 مل) | Thermo Fisher | Scientific 339652 | موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| ورق ترشيح دورة Fisherbrand بمعدل تدفق سريع | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| غطاء زجاجي (24 × 40 مم) | ثيرمو فيشر ساینتفيك | 50-311-20 | موقع الشركة: والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| سد الأسنان | Henry Schein | Inc 1010171 | موقع الشركة: ميلفيل ، نيويورك الولايات المتحدة الأمريكية |
| سكوتش شريط على الوجهين | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | موقع الشركة: والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| FemtoJet 4i الحاقن الدقيق | Eppendorf | 5252000021 | موقع الشركةهامبورغ ، ألمانيا |
| قارورة زجاجية (2 درام) | ثيرمو فيشر ساينتفيك | 033401C | موقع الشركة: والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| زيت الهالوكربون | سيجما ألدريتش | H8898-50ML | موقع الشركة: سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| P-2000 ليزر إبرة مجتذب | أدوات Sutter | P-2000 / G | موقع الشركة: نوباتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| بارافيلم | ثيرمو فيشر العلمي | 50-998-944 | موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| PC-100 مجتذب إبرة مرجح | Narishige | PC-100 | هذا متوافق مع طراز PC-10 السابق ، والذي تم إيقافه. موقع الشركة: أميتيفيل ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| فير دايركت PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| Kodak Photo-Flo (1٪) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة |
| الأمريكية أنابيب الشعيرات الدموية الزجاجية الكوارتز ، 1 مم القطر الخارجي | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | موقع الشركة: كورنوال ، المملكة المتحدة |
| دليلها & تجارة; مجموعة فحص sgRNA | تاكارا ، بيو يو 632639 | تتيح لك هذه المجموعة تحديد ما إذا كانت الحمض النووي الريبي يقطع تسلسل الحمض النووي في المختبر. موقع الشركة: ماونتن فيو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | |
| سيجماكوت | سيجما ألدريتش | SL2-100ML | موقع الشركة: سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| أطباق بتري صغيرة (35 × 10 مم) | ثيرمو فيشر ساینتفيك | 50-190-0273 | موقع الشركة: والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| سترات الصوديوم دم الدجاج | لامبير البيولوجية | 7201406 | موقع الشركة: إيفريت ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| طبق بتري فيشربراند سكوير (10 سم × 10 سم) | شركة Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | : Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | موقع الشركة: ميلفيل ، نيويورك الولايات المتحدة الأمريكية |
| طعام الأسماك الاستوائية | Tetramin | N / A | |
| Whatman ورق ترشيح | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | موقع الشركة: Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية |
| ورق ترشيح Whatman ، 4.25 سم | Sigma Aldrich | 1001-042 | موقع الشركة: سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية |
المراجع
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephaliti....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
