يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم الخصائص الوعائية الوراثية للخلايا الشبيهة بسرطان المبيض باستخدام نظام الثقافة المشتركة ثلاثي الأبعاد ، NICO-1

2.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61751

⸱

ديسمبر 5, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Teikyo University School of Medicine, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, 3Devision of Cancer Differentiation, National Cancer Center Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSC) هي المسؤولة عن بدء السرطان ، والتكرار ، والمقاومة العلاجية ، وورم خبيث. يعتبر مكانة الأوعية الدموية OCSC لتعزيز التجديد الذاتي ل OCSCs ، مما يؤدي إلى المقاومة الكيميائية. يوفر هذا البروتوكول الأساس لإنشاء نموذج متخصص للأوعية الدموية OCSC قابل للتكرار في المختبر.

الملخص

تتواجد الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في مكان داعم ، وتشكل بيئة دقيقة تتكون من خلايا انسجة مجاورة وأوعية ومصفوفة خارج الخلية. تشكل قدرة CSCs على المشاركة في تطوير البطانة خاصية مهمة تساهم بشكل مباشر في الفهم العام لآليات تكوين الورم وورم خبيث للورم. الغرض من هذا العمل هو إنشاء منهجية قابلة للتكرار للتحقيق في قدرة الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSCs) على بدء الورم. هنا ، قمنا بفحص آلية الأوعية الدموية الجديدة بين الخلايا البطانية و OCSCs جنبا إلى جنب مع التغيرات المورفولوجية للخلايا البطانية باستخدام نموذج الثقافة المشتركة في المختبر NICO-1. يسمح هذا البروتوكول بتصور خطوة الأوعية الدموية الجديدة المحيطة ب OCSCs بطريقة الدورة الزمنية. يمكن أن توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة فيما يتعلق بالخصائص الوعائية ل OCSCs في ورم خبيث للورم.

المقدمة

سرطان المبيض هو ثامن أكثر الأورام الخبيثة شيوعا بين النساء في جميع أنحاء العالم ، مع ما يقرب من 300,000 تشخيص جديد وما يقدر بنحو 180,000 حالة وفاة سنويا1. عند التشخيص الأولي ، غالبا ما يظهر سرطان المبيض بأعراض حادة ، حيث يكون حوالي 75٪ من المرضى بالفعل في المرحلة الثالثة والرابعة. وفقا لذلك ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات هو <30٪ ومعدل الوفيات هو الأعلى بين سرطانات أمراض النساء2 ، مع كفاءة علاج سرطان المبيض تعتمد بشكل كبير على العوامل السريرية مثل الإنجاز الناجح لجراحة debulking ، ومقاومة العلاج الكيميائي ، والتكرار بعد العلاج الأولي.

يتم تنظيم أنسجة سرطان المبيض بشكل هرمي ، حيث لا تكون جميع مكونات الورم قادرة على توليد أحفاد متساوية. تعتبر الخلايا الوحيدة القادرة على التجديد الذاتي وإنتاج مجموعة من الخلايا السرطانية غير المتجانسة تمثل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs)3. يرافق التجديد الذاتي ل CSC وبدء الورم تعزيز تكوين الأوعية لإعادة تشكيل البيئة المكروية للورم لغرض الحفاظ على مكانة داعمة. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام النماذج السابقة للتحليلات المختبرية بسبب التكاثر المحدود لزراعة الخلايا الجذعية السرطانية المشتقة من العينات السريرية بسبب تعطيل الأجسام الكروية بعد المرور المتعدد. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق تجريبية لزراعة الخلايا الجذعية السرطانية من المرضى لعدة تطبيقات4،5،6،7. على وجه الخصوص ، من خلال استغلال خاصية CSCs للنمو عن طريق تكوين كرويات في ألواح ربط منخفضة للغاية مع وسط خال من المصل ، يتم حث الخلايا الجذعية السرطانية المزروعة على التعبير عن علامة سطح الخلية الجذعية التي لا يتم التعبير عنها في الخلايا السرطانية الطبيعية مع إمكانية التمايز متعدد السلالات 8,9.

أظهرت البيانات الحديثة أن استمرار المبيض الخامل (O) CSCs الذي يتم تصوره على أنه انتشار في الصفاق يرتبط بتجديدها كأورام متكررة10. وبالتالي فإن فهم السمات الجزيئية والبيولوجية ل OCSCs قد يسمح بالاستهداف الفعال لهذه الخلايا واستئصالها ، مما يؤدي إلى مغفرة الورم المحتملة. على وجه الخصوص ، لا يعرف سوى القليل فيما يتعلق بالسمات الميكانيكية الخلوية والجزيئية لأدوار CSCs في تكوين الأوعيةالدموية 11. لذلك ، في البروتوكول الحالي ، استخدمنا OCSCs المشتقة من المريض في بيئة مخبرية للتحقيق في خاصية تولد الأوعية الدموية للخلايا البطانية باستخدام نموذج الثقافة المشتركة ، والذي قد يحاكي البيئة المكروية للورم في الخلايا الجذعية السرطانية والخلايا البطانية في الموقع النقيلي في الإعداد السريري. في نهاية المطاف ، نظرا لأن الأوعية الدموية الجديدة تشكل عملية حاسمة ضرورية لدعم نمو الورم وورم خبيث ، فإن الفهم الأفضل لآليته سيسمح بتطوير علاج استهداف جديد ل OCSCs في الموقع النقيلي.

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصور خطوة الأوعية الدموية الجديدة المحيطة ب CSCs بطريقة الدورة الزمنية. تتضمن ميزة البروتوكول السماح بإجراء تحقيقات قابلة للتكرار بالكامل باستخدام نظام الاستزراع المشترك ثلاثي الأبعاد ، NICO-1 ، مما يسمح بمراقبة التأثيرات على المرضى من قدرة بدء الورم المشتقة من OCSC أثناء تكوين الأوعية الدموية للخلايا البطانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب البروتوكول الذي وافقت عليه لجنة الأخلاقيات لرفاهية الإنسان. قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة على الاستخدام البحثي لعيناتهم ، وتمت الموافقة على جمع واستخدام الأنسجة لهذه الدراسة من قبل الجينوم البشري ، لجنة أخلاقيات أبحاث تحليل الجينات في جامعة تيكيو.

1. عزل وزراعة الخلايا الجذعية لسرطان المبيض (OCSCs) من المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض والاستسقاء في خزانة السلامة البيولوجية من المستوى 2

  1. عزل الخلايا الجذعية السرطانية من استسقاء سرطان المبيض البشري الذي يتم الحصول عليه عن طريق البزل. جمع ما لا يقل عن 100-250 مل من الاستسقاء من المرضى لاتخاذ عدد كاف من الخلايا الجذعية السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتقييم ملامح التعبير لعلامات الخلايا الجذعية السرطانية (على سبيل المثال ، EpCAM و Calretinin و CD133 و CD44 و CD45 و ALDH1 و Oct4) وعلامات سرطان المبيض (pAX-8 و WT-1) عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    1. جهاز الطرد المركزي استسقاء سرطان المبيض البشري عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة خلال 24 ساعة بعد شفط الاستسقاء.
    2. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 2 مل من وسط OCSC و 8 مل من محلول ملحي مخزن بنسبة 30٪ Histodenz / phosphate (PBS ، درجة الحموضة 7.4).
    3. تحضير وسيط OCSC: مكمل StemPro hESC ، DMEM ⁄F-12 مع L-glutamine (وسط GlutaMAX) ، 25٪ BSA ، 100 ميكرومتر 2-mercaptoethanol ، 8 ng / mL FGF الأساسي ، 10 ميكرومتر الأنسولين ، و 20 ميكرومتر Y-27632.
    4. قم بتراكب 2 مل من وسط OCSC بعناية على محلول الخلية في الخطوة 1.1.2 في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في دوار دلو متأرجح بدون كبح.
    5. انقل بعناية طبقة OCSC (دون إزعاج في الطور البيني) إلى أنبوب جديد سعة 15 مل بواسطة ماصة النقل.
    6. املأ مع PBS حتى 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية.
    7. إعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط OCSC والبذور على طبق ثقافة منخفض للغاية ؛ يجب الحفاظ على الثقافات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
    8. تغيير الوسيط كل ثلاثة أيام. قف بعناية طبق الثقافة لمدة 1 دقيقة ، وتخلص من جزء من المادة الطافية وأضف الوسيلة الجديدة.
  2. مرور CSCs
    1. اجمع OCSCs في أنبوب سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإزالة المادة الطافية ، واملأها ب PBS ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 1 مل من محلول انفصال الخلية المكون من إنزيمات المحللة للبروتين والكولاجين (على سبيل المثال ، AccuMax) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. تخلط جيدا عن طريق السحب واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تأكد من وجود الخلايا في تعليق واحد.
    5. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات ، وملء مع PBS ، وأجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط OCSC للبذر اللاحق على أطباق الاستزراع ذات التعلق المنخفض للغاية وصيانتها عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.

2. زراعة الخلايا البطانية HUEhT-1

  1. مرور خلايا HUEhT-1
    1. قم بإزالة الوسط من طبق الثقافة HUEhT-1 واغسل الخلايا باستخدام PBS.
    2. أضف 1 مل من 0.025٪ تربسين واحتضانه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. أضف 5 مل من وسط نمو الخلايا البطانية 2 ، واجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي بمعدل 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسط HUEhT-1 ، وزرع الخلايا على أطباق الاستزراع المغلفة بالكولاجين متبوعة بالصيانة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
    5. تغيير الوسيط كل ثلاثة أيام.

3. تحضير صفيحة الاستزراع المشترك NICO-1 لفحص تكوين الأنبوب باستخدام خلايا HUEhT-1

  1. قم بتجميع NICO-1 والطلاء باستخدام هيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية (Matrigel Matrix).
    1. قم بتجميع جانب واحد من NICO-1 باتباع تعليمات الشركة المصنعة واحتفظ به على الثلج.
    2. قم بتغطية سطح NICO-1 ب 300 ميكرولتر من PBS البارد ثم قم بإزالة المخزن المؤقت.
    3. أضف 300 ميكرولتر من هيدروجيل مبرد قائم على المصفوفة خارج الخلية واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    4. لتحقيق التوازن ، اغمر المرشح بالإيثانول بنسبة 100٪ ، ثم اغسل مرشح ICCP مقاس 13 مم (0.6 ميكرومتر) باستخدام PBS لمدة دقيقة واحدة.
    5. قم بتجميع NICO-1 بما في ذلك أجزاء الجسم الرئيسية A (الغرفة اليمنى) و B (الغرفة اليسرى) جنبا إلى جنب مع الحلقة O والفلتر المتوازن.

4. زرع خلايا HUEhT-1 و CSCs على نظام NICO-1

  1. تحضير معلقات الخلايا HUEhT-1 عن طريق trypsinizing أحادي الخلية وإعادة تعليق الخلايا في وسط نمو الخلايا البطانية مع مصل عجل الجنين 2٪.
  2. أضف 1.2 مل من معلق الخلية (1.5 × 105 خلايا) إلى كل بئر مطلي بالهيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية.
  3. أضف 1.5 مل من OCSCs المستزرعة لمدة خمسة أيام إلى البئر الآخر.
  4. احتضان NICO-1 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ؛ يمكن ملاحظة تكوين الأنبوب تحت المجهر وتشكيل الشبكة على هيدروجيل قائم على المصفوفة خارج الخلية يتم قياسه عن طريق عدد الفروع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قمنا بجمع سوائل الاستسقاء التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض المتقدم أثناء الجراحة أو البزل لغرض إجراء ثقافة مستقرة طويلة الأجل للكرويات. هنا ، نقدم حالات لثقافة كروية طويلة الأجل من CSCs المبيض تسمى CSC1 و CSC2. يحمل كلا خطي الخلية نفس التشخيص والملامح النسيجية. لا تزال الأدوار الميكانيكية ل OCSCs الكامنة وراء التفاعل مع الخلايا البطانية اللازمة للحث على الأوعية الدموية الجديدة للخلايا البطانية المحيطة ب OCSCs غير معروفة. لذلك ، كنا نهدف إلى توضيح عمليات تطوير مك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف البروتوكول المقدم كيفية محاكاة البيئة المكروية للورم في OCSCs في بيئة معملية. يشكل المكون الأساسي للطريقة نموذج الاستزراع المشترك القابل للتكرار بدرجة كبيرة والذي تم الحصول عليه باستخدام نظام NICO-1 ، وهو نظام استزراع مشترك غير مباشر في Transwell. تدرس العديد من نماذج الاستزراع المشترك المتاحة حاليا آثار الاتصال المباشر بين الخلية والخلية على مجموعات الخلايا المستزرعة12،13،14،15،16،17<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة معونة للبحث العلمي C (منحة رقم 19K09834 إلى K.N.) من وزارة التعليم والعلوم والثقافة ، اليابان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.025٪ تريبسين R001100الحرارية
10 مل PipetThermo170356N
1250 & micro; L Pipet طرفQSPT112XLRS-Q
15 مل أنبوبNunc339650
200 & micro ؛ L Pipet TipQSPT110RS-NEW
2-MercaptoethanolThermo (Gibco)21985023
5 مل PipetThermo170366N
50 مل أنبوبCorning430290
AccuMAXالخلايا المبتكرةAM105
BioCoatTM Collagen I 60 ممكورنينج356401
جهاز طرد مركزيKUBOTA2800
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment MultiplePlates Corning3471
Endothelial Cell Growth Medium 2 & nbsp ؛PromoCellC-22011 
الإيثانولWAKO057-00456
FGF-BasicThermo (Gibco)PHG0021
HistodenzSIGMAD2158
HUEhT-1 خليةJCRB بنكالخلية JCRB1458
مرشح ICCP 0.6 & micro ؛ ممختبر جينري.2525-06
الأنسولين ،SIGMA البشري (Roche)11376497001
مقياس الإضاءةPerkinElmerARVO MX-flad
Matrigel MatrixCorning356234
المجهريوكوجاواCQ-1
NICO-1Ginrei Lab.2501-02
OptiPlate-96PerkinElmer6005290
P1000 PipetGilsonF123602
P200 PipetGilsonF123601
PBSThermo (Gibco)14190-144
StemPro hESC SFMThermo (Gibco)A1000701
نقل PipetFALCON357575
Y-27632واكو253-00513
تقنيات طبق Well

المراجع

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  3. Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
  4. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  5. Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
  6. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  7. Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
  8. Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
  9. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  10. Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).
  11. Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413(2020).
  12. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).
  13. Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
  14. Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
  15. Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
  16. Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
  17. Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
  18. Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
  19. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  20. De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
  21. Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
  22. Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
  23. Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية لسرطان المبيضالخلايا الجذعية السرطانيةنظام الزراعة المشتركة ثلاثي الأبعادنظام NICO-1مقايسة تكوين الأنابيبالزراعة المشتركة للخلايا البطانيةالطرد المركزي بالتدرج الكثافيالالتصاق المنخفض للغايةهيدروجيل المصفوفة خارج الخلويةتكوين الأنابيب الوعائية
تقييم الخصائص الوعائية الوراثية للخلايا الشبيهة بسرطان المبيض باستخدام نظام الثقافة المشتركة ثلاثي الأبعاد ، NICO-1
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.