يمكن استخدام النيماتودا Caenorhabditis elegans القابلة للسحب وراثيا كنموذج بسيط وغير مكلف لاكتشاف الأدوية. وصف هنا هو بروتوكول لتحديد العلاجات المضادة للانسان التي تمنع الإشارات المصب من RAS وEGFR البروتينات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد مثبطات EGFR و RAS باستخدام إليجانات Caenorhabditis
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تورطت التغيرات في توطين غشاء البلازما لمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) وتأثيرها المصب RAS في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان. النيماتودا C. elegans العيش الحر تمتلك التطورية والمحافظ عليها وظيفيا EGFR-RAS-ERK MAP سلسلة إشارة التي هي مركزية لتطوير الفرج. كسب الطفرات وظيفة في RAS homolog LET-60 وEGFR homolog LET-23 حث توليد pseudovulva خارج الرحم مرئية على طول جدار الجسم البطني من هذه الديدان. في السابق ، كان النمط الظاهري متعدد الصمامات (Muv) في هذه الديدان مثبطا بجزيئات كيميائية صغيرة. هنا نصف بروتوكول لاستخدام الدودة في المقايسة القائمة على السائل لتحديد مثبطات إلغاء أنشطة EGFR و RAS البروتينات. باستخدام هذا المقايسة، نعرض R-fendiline، مثبط غير مباشر من K-RAS، يقمع النمط الظاهري Muv المعبر عنه في let-60 (n1046) والسماح-23(sa62) الديدان المتحولة. المقايسة بسيطة وغير مكلفة ، ليست مضيعة للوقت لإعداد ، ويمكن استخدامها كمنصة أولية لاكتشاف العلاجات المضادة للانسان.
المقدمة
يتم الحفاظ على المسارات الخلوية التي تنظم الأحداث التنموية داخل الكائنات الحية بشكل كبير بين جميع الميتازوان. أحد هذه المسارات هو EGFR-RAS-ERK mitogen تنشيط البروتين كيناز (MAPK) سلسلة الإشارات التي هي مسار حاسم الذي يحكم انتشار الخلايا, التمايز, الهجرة والبقاء على قيد الحياة1,2. يمكن أن تؤدي العيوب في مسار الإشارات هذا إلى حالات مرضية أو مرضية مثل السرطان. وقد أظهرت مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) أن أعرب عنها بشكل كبير في الأورام البشرية، بما في ذلك 50٪ من سرطان الخلايا الحرشفية عن طريق الفم، ويساهم في تطوير الأورام الخبيثة3،4،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. نيماتود متوسط النمو (NGM) إعداد لوحة
- إضافة 2.5 غرام من بيبتون و 3 غرام من NaCl إلى 970 مل من المياه deionized الواردة في قارورة 2 L Erlenmeyer. تحريك المحتويات باستخدام شريط تحريك مغناطيسي. بعد ذلك، إضافة 20 غرام من أجار إلى القارورة. أوتوكلاف محتويات القارورة في 121 درجة مئوية وضغط 15 رطل / في2 لمدة 30 دقيقة. بعد التعقيم، ضع القارورة على لوحة تحريك واترك الوسط يبرد حتى تصل درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية.
- لإعداد لوحات NGM إضافة الكواشف التالية إلى المتوسط المبرد: 25 مل من 1 M البوتاسيوم الفوسفات العازلة (درجة الحموضة = 6.0)، 1 مل من 1 M MgSO4،1 مل من 1 M CaCl2،1 مل من (5 ملغم / مل في الإيثانول 95٪) الكوليسترول، 1....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نحن أول من يثبت أن R-fendiline قادرة على قمع النمط الظاهري Muv في سلالة متحولة السماح-60 (n1046) مقارنة مع الديدان المعالجة DMSO. تظهر بياناتنا أن R-fendiline قادر على منع النمط الظاهري Muv في let-60 (n1046) بطريقة تعتمد على الجرعة(الشكل 2A, B). ومع ذلك، لوحظ عدم عكس النمط الظاهري Muv في سلالة متحولة فارغة لين-1 ردا على تركيزات متزايدة من R-fendiline(الشكل 2B). وتشير البيانات إلى أن كتل R-fendiline تنشيط السماح-60<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إن المقايسات التي نصفها باستخدام الدودة بسيطة وغير مكلفة لتحديد مثبطات وظيفة EGFR و RAS. C. elegans هو نموذج جذاب لاكتشاف المخدرات لأنه من السهل أن تنمو في المختبر بسبب دورة الحياة القصيرة (3 أيام عند 20 درجة مئوية) والقدرة على توليد أعداد كبيرة من اليرقات. والأهم من ذلك، يتم الحفاظ على مسار EGFR-RAS-ERK MAPK تطوريا ووظيفيا مع الثدييات التي توفر نظاما قابلا للسحب وراثيا لتحليل آثار مثبطات EGFR وRAS. علاوة على ذلك ، فإن الطبيعة الشفافة للديدان تمكن المحقق من تصور الهياكل المتميزة وتوطين البروتين الفلوري الأخضر (G.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور Swathi أرور (MD أندرسون مركز السرطان) لتوفير السماح-60 (n1046). كما نشكر الدكتور ديفيد راينر (معهد مركز تكساس للعلوم الصحية للعلوم الحيوية والتكنولوجيا في هيوستن) على سلالة لين-1. وأخيرا، نشكر الدكتورة دانييل غارسين ومختبرها (جامعة تكساس، كلية ماكغفرن الطبية) على توفير بعض الكواشف. تم توفير بعض سلالات الديدان من قبل CGC ، التي يمولها مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). تم دعم هذا البحث من قبل معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (CPRIT) منحة RP200047 إلى JF هانكوك.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>الوسائط والمواد الكيميائية | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| باكتو بيبتون | فيشر العلمي | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | فيشر العلمي | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB مرق | فيشر العلمي | DF0446-17-3 | |
| كلوريد الكالسيوم | فيشر Scientific | BP510-500 | |
| الكوليسترول | فيشر العلمي | ICN10138201 | |
| كبريتات المغنيسيوم | فيشر Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros Organics | AC455500050 | |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة | فيشر Scientific | BP363-500 | |
| البوتاسيوم pفوسفات أحادي القاعدة | فيشر Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | مركب تجاريا (من الدرجة الصيدلانية) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma & nbsp ؛ | S2002-25G | |
| كلوريد الصوديوم | فيشر Scientific | BP358-1 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | فيشر Scientific | SS266-1 | |
| 8.25٪ هيبوكلوريت الصوديوم | التبييض | ||
| فوسفات الصوديوم Dibasic | فيشر Scientific | BP332-500 | |
| كبريتات الستربتومايسين | فيشر العلمي | BP910-50 | |
| (ناقص ؛)-تتراميسول هيدروكلوريد | ميليبور سيجما ؛ | L9756 | |
| UO126 (مثبط مجاهدي خلق) | Millipore Sigma | 19-147< | |
| strong>Consumables < / قوي> | |||
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقمة البولي بروبيلين ؛ | فيشر ساينتفيك | 12-565-269 | |
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقم من مادة البولي بروبيلين | فيشر Scientific | 12-565-271 | |
| ماصات البوليسترين المصلية التي يمكن التخلص منها 10 مل | فيشر ساينتفيك | 07-200-574 | |
| ماصات مصلية من البوليسترين يمكن التخلص منها 25 مل | فيشر ساينتفيك | 07-200-575 | |
| رقم 1.5 ؛ 18 مم × 18 مم زلات غطاء | بتري فيشر ساينتفيك | 12-541A | |
| بغطاء شفاف (60 × 15 مم) | فيشر ساينتفيك | FB0875713A | |
| بتري بغطاء شفاف (100 × 15 مم) | من | فيشر ساينتفيك | |
| (75 × 25 مم) | فيشر ساينتفيك | 12-544-4 | |
| 12- ألواح زراعة أنسجة الآبار | فيشر ساينتفيك | 50-197-4804 | |
| Software < / قوي > | |||
| Prism Graphpad | |||
| <قوي > سلالات بكتيرية < / قوي > | |||
| < م > الإشريكية القولونية < م > OP50 | |||
| < قوي > سلالات دودة < قوي > | |||
| < قوي >سلالة < قوي > | <قوي >النمط الجيني < قوي> | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60 (n1046) IV.< / em> | CGC | |
| MT7567 | lin-1 (sy254) IV.< / em> | CGC | |
| PS1839< | em>let-23 (sa62) II.< / em> | CGC |
المراجع
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
