مقالة منهجية

T و B الخلية مستقبلات المناعة مرجع التحليل باستخدام الجيل القادم التسلسل

7.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61792

⸱

يناير 12, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Pediatric Gastroenterology Unit, Edmond and Lily Safra Children's Hospital, Sheba Medical Center, 2Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 4Molecular Hematology Laboratory, Sheba Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول الحالي طريقة لعزل الحمض النووي من عينات الدم والخزعات المعوية ، وتوليد مكتبات TCRβ و IGH PCR لتسلسل الجيل التالي ، وأداء تشغيل NGS وتحليل البيانات الأساسية.

الملخص

الذاكرة المناعية، السمة المميزة للمناعة التكيفية، يتم تنظيمها من قبل الخلايا الليمفاوية T و B. في الدورة الدموية والأعضاء المختلفة ، وهناك مليارات من استنساخ الخلايا الفريدة تي وباء ، ويمكن لكل واحد ربط مستضد معين ، مما يؤدي إلى الانتشار والتمايز و / أو إفراز السيتوكين. يتم إنشاء التغايرية واسعة في الخلايا T و B عن طريق إعادة دمج عشوائي من شرائح وراثية مختلفة. تمكن تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) ، التي تم تطويرها في العقد الماضي ، من رؤية متعمقة غير مسبوقة للذخيرة المناعية لمستقبلات الخلايا T و B. أظهرت الدراسات في مختلف الحالات الالتهابية والفيزيولوجيا المناعية والعدوى والخبيثة تغيرات ملحوظة في اللاستنساخ واستخدام الجينات والخصائص الفيزيائية الحيوية للذخيرة المناعية ، مما يوفر رؤى مهمة حول دور الاستجابات المناعية التكيفية في الاضطرابات المختلفة.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لNGS من ذخيرة المناعة من الخلايا T و B من الدم والأنسجة. نحن نقدم خط أنابيب بدءا من عزل الحمض النووي من خلال إعداد المكتبة ، والتسلسل على المنظم NGS وتنتهي مع التحليلات الأساسية. تمكن هذه الطريقة من استكشاف خلايا T و B محددة على مستوى النيوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية ، وبالتالي يمكن تحديد التغيرات الديناميكية في مجموعات الخلايا الليمفاوية ومعلمات التنوع في الأمراض المختلفة. هذه التقنية تدخل ببطء الممارسة السريرية ولديها القدرة على تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة ، وتقسيم المخاطر والطب الدقيق.

المقدمة

يستخدم الجهاز المناعي التكيفي، المكون من الخلايا اللمفاوية T و B، الذاكرة المناعية للتعرف على مستضد سبق مواجهته وبدء استجابة سريعة. يتم إنشاء الخلايا الليمفاوية في نخاع العظام وتنضج في الغدة الصعترية (الخلايا التائية) أو نخاع العظم (خلايا B). تعرض كل من مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ومستقبلات الخلايا B (BCR) تكوينات فريدة تسمح بالاعتراف بالمضادات المحددة. في التوازن، T و B الخلايا تعميم ومسح باستمرار تريليونات الببتيدات المختلفة المقدمة على الخلايا تقديم مستضد. ربط TCR أو BCR مستضد معين مع تقارب عالية، جنبا إلى جنب مع التحفيز المشترك المناسب، يؤدي إلى تنشيط الخلية، مما أدى إلى إفراز السيتوكين، والتوسع اللاستنساخي وتوليد الأجسام المضادة، في حالة الخلايا B.

تسمى المجموعة الهائلة من الخلايا T أو B المختلفة ذخيرة المناعة بشكل جماعي ، مما يتيح التعرف على عدد لا يحصى من الأسطح المختلفة. من أجل توليد مثل هذه ذخيرة واسعة، عملية معقدة من التجمع العشوائي من شرائح الجينات المختلفة يحدث، وخلق مجموعات لا نهاية لها تقريبا من المستقبلات التي يمكن أن تربط مستضدات فريدة من نوعها1. هذه العملية، ودعا V (D)J إعادة التركيب، ويشمل إعادة ترتيب متغير مختلف (V)، والتنوع (D) والانضمام (J) الجينات، يرافقه حذف عشوائي وإدراج النيوكليوتيدات فيتقاطعات 2.

وقد أثارت بنية الجهاز المناعي التكيفي اهتمام العلماء في مجالات مختلفة لعقود عديدة. في الماضي، كان تسلسل سانجر، والتحديد التكميلي للمنطقة 3 (CDR3) الأطياف، وقياس التدفق الخلوي تستخدم لتوصيف ذخيرة المناعة، ولكن قدمت دقة منخفضة. في العقد الماضي، مكن التقدم في الجيل القادم من أساليب التسلسل (NGS) من رؤية متعمقة لخصائص وتكوين ذخيرتي TCR و BCRللفرد 3و4. هذه النظم عالية الإنتاجية (HTS) تسلسل ومعالجة الملايين من المنتجات TCR أو BCR إعادة ترتيبها في وقت واحد، وتسمح بتحليل عالية الدقة من خلايا T و B محددة على مستوى النيوكليوتيد أو الأحماض الأمينية. NGS يوفر استراتيجية جديدة لدراسة ذخيرة المناعة في كل من الصحة والمرض. أظهرت الدراسات التي تستخدم HTS تغيير TCR وBCR repertoires في أمراض المناعة الذاتية5، وdeficiencies المناعية الأولية6،7، والأورام الخبيثة ، كما هو الحال في سرطان الدم النخاعي الحاد8. باستخدام NGS ، أظهرنا نحن وآخرون توسعا في قلة القلة لاستنساخ خلايا T و B محددة ، في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء (IBD) ، بما في ذلك التهاب القولون التقرحيومرض كرون9و10و11و12و13و14. بشكل عام، تشير الدراسات من مختلف المجالات إلى أن التغيرات في الذخيرة لها دور حاسم في مسببات الأمراض في الاضطرابات بوساطة المناعة.

يصف البروتوكول الحالي طريقة لعزل الحمض النووي عن الخزعات المعوية والدم ، وتوليد مكتبات TCRβ و IGH PCR ل NGS ، وأداء تشغيل التسلسل. كما نقدم الخطوات الأساسية في تحليل بيانات الذخيرة المناعية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على إنشاء مكتبات TCRα و TCRа و IGL أيضا. كما تتوافق هذه الطريقة مع الأعضاء الأخرى (مثل الغدد الليمفاوية والأورام والسائل الزليلي والأنسجة الدهنية وما إلى ذلك) طالما يتم استخدام بروتوكولات الهضم الخاصة بالأنسجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في مركز شيبا الطبي، وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع الأشخاص المشاركين.

1. عزل الحمض النووي والتحديد الكمي

  1. الهضم وتحلل الخلايا من خزعات الأمعاء
    1. استرجاع خزعات الأمعاء، إما التي تم جمعها حديثا أو تلك المخزنة في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. إذا كنت تستخدم الخزعات المجمدة، إذابة على الجليد.
    2. أضف 600 ميكرولتر من محلول تحلل النوى إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 1.7 مل، مبرد على الثلج.
    3. ضع الخزعة في أنبوب طرد دقيق مع محلول التحلل واحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة.
    4. إضافة 17.5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتيناز K واحتضان بين عشية وضحاها في 55 درجة مئوية، مع اهتزاز لطيف.
    5. السماح للعينة لتبرد لدرجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل الشروع في الخطوة 1.3.
  2. تحلل الخلايا من الدم كله
    1. الحصول على 3 مل من الدم الكامل في EDTA-, الهيبارين-, أو أنبوب يحتوي على سيترات.
    2. أنبوب الصخور بلطف حتى مختلطة تماما، ونقل الدم إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل معقمة تحتوي على 9 مل من محلول تحلل الخلية. عكس عدة مرات خلال فترة حضانة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. الطرد المركزي في 2000 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم تجاهل أكبر قدر ممكن من الناسخ دون إزعاج بيليه الأبيض مرئية. سيبقى ما يقرب من 50-100 ميكرولتر من السائل المتبقي.
    4. دوامة أنبوب بقوة لمدة 15 ق حتى resuspended تماما. إضافة 3 مل من محلول تحلل النوى وماصة عدة مرات. يجب أن يصبح الحل لزجا.
  3. هطول الأمطار البروتين
    1. إضافة 200 ميكرولتر من البروتين هطول الأمطار العازلة إلى الأنسجة، أو 1 مل إلى الدم. دوامة بقوة لمدة 20 ق واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. قد تكون كتل البروتين الصغيرة مرئية بعد الدوامة.
    2. جهاز طرد مركزي عند 16,000 x g لمدة 4 دقائق. يجب أن تتشكل بيليه ضيق يحتوي على بروتينات معجلة.
    3. نقل supernatant بعناية، دون إزعاج بيليه، إلى أنبوب جديد 1.7 مل.
      ملاحظة: إذا لم يكن بيليه ضيقا، ففكر في جهاز طرد مركزي آخر عند 16,000 × ز لمدة 4 دقائق.
  4. هطول الأمطار والحمض النووي والإماهة
    1. إضافة 1 مل من 2-propanol إلى أنبوب يحتوي على supernatant، وتخلط بلطف عن طريق عكس. يجب أن يصبح الحمض النووي مرئيا كمادة عائمة بيضاء.
    2. جهاز طرد مركزي عند 16,000 x g لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant تماما باستخدام ماصة.
    3. إضافة 1 مل من الإيثانول الطازج 70٪، وانبوب عكس عدة مرات. جهاز طرد مركزي عند 16,000 x g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل supernatant بعناية.
    4. كرر الخطوة 1.4.3.
    5. ضع أنبوب مفتوح مقلوب على ورق ماصة نظيف لمدة 10-15 دقيقة. إعادة عكس أنبوب وتأكيد الترطيب الكامل. إذا لزم الأمر، اتركيه ليجفف الهواء لمدة 10-15 دقيقة إضافية.
      ملاحظة: من المهم أن تجف بيليه تماما.
    6. أضف 50 ميكرولتر من المياه فائقة النقاء (UPW). إذا لزم الأمر، يمكن تخفيف الحمض النووي أكثر بعد القياس الكمي.
    7. حضانة لمدة 1 ساعة على كتلة الحرارة في 65 درجة مئوية، لإماهة الحمض النووي.
  5. تحديد كمي للحمض النووي
    ملاحظة: تم قياس الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور والكواشف المعينة، على النحو المحدد في جدول المواد.
    1. جلب المعايير لدرجة حرارة الغرفة وإعداد عدة، بما في ذلك أنابيب 0.5 مل المعينة.
    2. إعداد العازلة ومزيج صبغ في أنبوب 15 مل، وفقا لعدد من العينات. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة و 1 ميكرولتر من الصبغة لكل عينة. تضمين عينتين للمعايير. من المستحسن حساب عينة إضافية لتجنب أن المخزن المؤقت لن يكون كافيا.
      1. بالنسبة للمعايير 2، ضع 190 ميكرولتر من المزيج المعد أعلاه في أنبوب 0.5 مل. أضف 10 ميكرولتر من المعيار.
      2. لكل عينة، ضع 199 ميكرولتر من المزيج المعد أعلاه في أنبوب 0.5 مل. أضف 1 ميكرولتر من الحمض النووي.
    3. اقرأ العينات. وتشير النتيجة إلى تركيز الحمض النووي للعينة.
    4. إذا كانت العينات فوق الحد، تمييع الحمض النووي 1:10 مع UPW، وكرر قراءة.

2. إعداد المكتبة

ملاحظة: يستخدم البروتوكول الحالي عدة المقايسة متعددة الأجهزة المستندة إلى PCR متوافقة مع التسلسلات NGS. تحتوي المجموعة على 24 مؤشر مختلف يستهدف كل منها المناطق المحفوظة داخلβ V ومناطقβ J. وهذا يمكن تفاعل PCR خطوة واحدة وتجميع عينات مختلفة. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.

  1. إعداد عينات الحمض النووي. الحصول على 150 نانوغرام من الحمض النووي وإضافة UPW لما مجموعه 5 ميكرولتر.
    ملاحظة: من الممكن استخدام أقل من 150 نانوغرام من الحمض النووي لإعداد المكتبة، مع تركيز الحد الأدنى من 10 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. ضع ماصة ونصائح في غطاء محرك السيارة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة لكسر الحمض النووي المتبقي. وفي الوقت نفسه، اسمح لأنابيب الفهرس المختلفة (لإعداد المكتبة) وبلمرة الحمض النووي بالذوبان على الجليد.
  3. في غطاء محرك السيارة البيولوجي، أضف 45 ميكرولتر من أنابيب الفهرس المختلفة إلى أنابيب PCR. لمتابعة, إضافة 0.2 ميكرولتر من بوليمرات الحمض النووي و 5 ميكرولتر من الحمض النووي أعدت في الخطوة 2.1 في أنابيب PCR.
  4. تشغيل تفاعل PCR باستخدام برنامج محدد مسبقا ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

3. تنقية التضخيم والتحديد الكمي

  1. استخدام الخرز المغناطيسي لإزالة التمهيديات الزائدة، النيوكليوتيدات، والإنزيمات.
    1. قم بتدفئة الخرز على الأقل 30 دقيقة إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد ما يكفي من الإيثانول الطازج 80٪ ل400 ميكرولتر لكل عينة.
    2. إضافة 50 ميكرولتر (IGH) أو 35 ميكرولتر (TCRа) من الخرز إلى كل أنبوب PCR وخلط عن طريق الأنابيب 10 مرات. احتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. ضع العينة المختلطة على الحامل المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
    4. أسبيرات 95 ميكرولتر (IGH) أو 80 ميكرولتر (TCRа) من السائل واضحة وتجاهل. أسبيرات السائل المتبقي باستخدام طرف 10 ميكرولتر.
    5. إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول 80٪ إلى كل عينة. احتضان 30 s. أسبيرات 195 ميكرولتر من الإيثانول والتخلص منها. يستنشق السائل المتبقي باستخدام طرف 10 ميكرولتر.
    6. كرر الخطوة 3.1.5. افتح أغطية الأنابيب ودع الهواء يجف لمدة 5 دقائق.
    7. مباشرة بعد 5 دقائق، وإزالة من موقف المغناطيسي وإضافة 25 ميكرولتر من العازلة elution (10 م تريس-HCl، درجة الحموضة 8.0). تخلط عن طريق الأنابيب حتى متجانسة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    8. ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي لمدة 5 دقائق. نقل 22 ميكرولتر إلى أنبوب PCR جديد. قياس تركيز الحمض النووي (الخطوة 1.5).
  2. القياس الكمي للتضخيم
    ملاحظة: يستخدم البروتوكول الحالي آلة كهربائية آلية لمراقبة جودة تركيز الحمض النووي وحجمه وسلامته. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.
    1. ضع الكواشف وشريط الشاشة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    2. في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.7 مل، قم بتمييع عينات الحمض النووي 1 نانوغرام/ميكرولتر في الخطوة 3.1.8 مع UPW بحجم إجمالي لا يقل عن 3 ميكرولتر.
    3. دوامة الحمض النووي المخفف قبل الاستخدام. ضع 2 ميكرولتر من العازلة، جنبا إلى جنب مع 2 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف في شرائط PCR المتخصصة المسماة مسبقا (المنصوص عليها في المجموعة) ووضع القبعات. مكان على شاكر لمدة 1 دقيقة، تليها تدور أسفل من شرائط PCR.
      ملاحظة: نظرا ل لزوجة المخزن المؤقت، تأكد من إزالة المخزن المؤقت الزائد من الطرف قبل نقله إلى أنابيب العينة.
    4. ضعه في الجهاز وشريط الشاشة وشرائط PCR بدون القبعات. افتح غطاء صندوق الأطراف داخل الجهاز. تعيين الموضع مع تسميات مناسبة. بدء تشغيل الجهاز.
      ملاحظة: يجب أن يكون الرسم البياني الإخراج ذروة واحدة في الحجم المطلوب من amplicons(الشكل 1A). في عينات من نوعية رديئة، وسوف يلاحظ قمم إضافية(الشكل 1B)،مما يدل على سوء تنظيف حبة أو تشكيل dimers التمهيدي.

4. تسلسل الجيل التالي

  1. تحديد حجم المكتبة وتجميعها
    1. احسب تركيز الحمض النووي النهائي في nM، باستخدام قيمة الحمض النووي من الخطوة 3.1.8، والحجم في أزواج الأساس (bp) من ذروة المنتج، التي تم الحصول عليها من نتائج الجهاز الكهربائي (انظر الشكل 1).
    2. لكل عينة، حساب حجم الحمض النووي لاتخاذ لتركيز النهائي من 4 مليون متر، في حجم النهائي من 10-20 ميكرولتر elution العازلة.
    3. إعداد مزيج تخفيف جديد لكل عينة وتأخذ 2 ميكرولتر منه إلى مزيج تجمع جديد.
      ملاحظة: بالنسبة للنماذج التي تحتوي على أقل من 4 nM، أضف أقصى قدر ممكن من العينة.
  2. NGS تشغيل المكتبة
    ملاحظة: يستخدم البروتوكول الحالي منصة التسلسل الأعلى مقاعد البدلاء. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.
    1. إعداد حل جديد من 0.2 N NaOH. إضافة 10 ميكرولتر من 0.2 N NaOH إلى المكتبة المخففة المعدة في الخطوة 4.1.3. إضافة 5٪ فيإكس إلى أنبوب ودوامة لفترة وجيزة. تدور أسفل الأنبوب لضمان كل حل قد استقر إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
    2. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل. أضف 980 ميكرولتر من العازلة المبردة مسبقا من المجموعة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي ودوامة لفترة وجيزة.
    3. ضع المكتبة المخففة على الجليد، واستعد المكتبة على النحو التالي. للحصول على مزيج من 17 pM، أضف 425 ميكرولتر من الحمض النووي من الخطوة 4.2.2 و 575 ميكرولتر من المخزن المؤقت. عكس المكتبة عدة مرات وتدور إلى أسفل. تحميل 600 ميكرولتر من المكتبة النهائية على خرطوشة المعينة، ووضع عينات في الجهاز.
    4. بدء التشغيل باتباع إرشادات البرنامج.

5. تحليل التسلسل

  1. تحميل مقاييس التسلسل من المنظم، والتحقق من أن تسلسل البيانات ضمن النطاقات التالية (محددة للمجموعة المستخدمة في البروتوكول الحالي). نماذج لا تفي بهذه المعايير عرضة لتكرار تشغيل:
    كثافة الكتلة (الكثافة (K/mm2)): 945K - 1800K
    النسبة المئوية لعوامل التصفية التي تمرر القراءات (كتل PF (٪):>90٪
    درجات الجودة (٪>=Q30): >85٪
    محاذاة PhiX (محاذاة ٪): 1.5٪ - 10٪
    معدل خطأ PhiX (٪): <1.0٪

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا، ونحن نصف طريقة لعزل الحمض النووي من الأنسجة المعوية والدم، وإعداد المكتبات لNGS، والخطوات الأساسية لتشغيل تسلسل لتسلسل ذخيرة المناعة. سيقوم التشغيل بإنشاء ملفات fastq ، والتي يمكن تحويلها إلى ملفات fasta لاستخدامها في ImMunoGeneTics الدولية (IMGT) / منصة HighV-QUEST. هذا HTS ينفذ ويدير العديد من التحليلات لعشرات الآلاف من تسلسل TCRβ وIGH أعيد ترتيبها، في مستوى النيوكليوتيد15. IMGT / HighV - QUEST تمكن من تحليل مختلف TCRs وIGH repertoires في كل من الصحة والمرض. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تحديد المس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وغالبا ما تواجه التغيرات في وفرة ووظيفة الخلايا الليمفاوية B و T في الأورام الخبيثة المختلفة18, اضطرابات التهابية مزمنة (على سبيل المثال, التهاب القولون التقرحي والتهاب المفاصل الروماتويدي)10,19, وفي مختلف المناعي17,20. وتستخدم الطريقة الحالية نظام NGS لتسهيل رؤية متعمقة لذخيرة TCR وBCR ، مما يتيح الكشف عن التغيرات الطفيفة في كلونية الخلايا T و B ، ومشاركة المستنسخين ، واستخدام جين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

جميع المؤلفين ليس لديهم ما يكشفون عنه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-بروبانولسيجماI9516-500ML
1.7 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة Axygen8187631104051
15 مل أنابيب الطرد المركزيGreiner188261
الإيثانول المطلقMerck1.08543.0250
Amplitaq GoldThermo FisherN8080241
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881
كتلة الحرارةBioerغير قابلة للتطبيق
عالية الحساسية D1000 عينة عازلةAgilent5067-5603ل Tapestation
عالية الحساسية D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584ل Tapestation. تباع الأنابيب بشكل منفصل
مجموعة فحص المسار الليمفاويInvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019يتضمن كل منها 24 فهرسا
MiSeq Reagent Kit v2 (500 دورة)IlluminaMS-102-2003يتضمن نوع خلية التدفق القياسي وجميع الكواشف المطلوبة
MiSeq SequencerIlluminaSY-410-1003
شرائط PCR4titude4ti-0792
Proteinase KInvitrogenEO0491
Qubit 4 مقياس الفلورThermo FisherQ33226
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32854يتضمن العازلة والصبغة والمعايير والأنابيب المتخصصة
شاكربيوسانغير قابل للتطبيق
Tapestation 2100 BioanalyzerAgilentG2940CA
ultra Bio-lab7501
WizardPromegaA1120يتضمن محلول تحلل الخلايا ومحلول تحلل النوى والمخزن المؤقت لترسيب البروتين
طقم عزل الحمض النووي للمياه النقية

المراجع

  1. Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
  2. Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
  3. Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
  4. Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
  5. Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
  6. Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
  7. Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109(2020).
  8. Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73(2019).
  9. Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn's Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
  10. Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
  11. Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
  12. Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn's disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
  13. Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn's and Colitis. , (2019).
  14. Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn's disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
  15. Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333(2013).
  16. H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157(2015).
  17. Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
  18. Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688(2019).
  19. Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
  20. Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
  21. Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9(2018).
  22. Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962(2018).
  23. Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
  24. Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
  25. Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
  26. De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638(2018).
  27. Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
  28. Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA NGS VDJ

مقالات ذات صلة