يظهر هنا بروتوكول لنهج التصوير الفلوري ، multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA ، RNA ، و protein (MICDDRP) ، وهي طريقة قادرة على التصور المتزامن لخلية واحدة من البروتين الفيروسي والأحماض النووية من أنواع مختلفة وتقطعت بهم السبل. يمكن تطبيق هذا النهج على مجموعة متنوعة من الأنظمة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير الفلوري متعدد الخلية أحادي الخلية لتصور الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات ومراقبة فيروس نقص المناعة البشرية و HTLV و HBV و HCV وفيروس زيكا وعدوى الأنفلونزا
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد أعيق التقاط عمليات النسخ المتماثل والتجميع الديناميكيين للفيروسات بسبب الافتقار إلى تقنيات التهجين في الموقع (ISH) القوية التي تمكن من وضع العلامات الحساسة والمتزامنة للحمض النووي الفيروسي والبروتين. غالبا ما تكون طرق التهجين الموضعي التقليدية للحمض النووي (FISH) غير متوافقة مع التلوين المناعي. لذلك قمنا بتطوير نهج التصوير ، MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA ، RNA و protein) ، والذي يتيح التصور المتزامن لخلية واحدة للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين. بالمقارنة مع أسماك الحمض النووي التقليدية ، يستخدم MICDDRP تقنية الحمض النووي المتفرع (bDNA) ISH ، والتي تعمل على تحسين حساسية مسبار قليل النوكليوتيد واكتشافه بشكل كبير. تتيح التعديلات الصغيرة ل MICDDRP تصوير البروتينات الفيروسية بالتزامن مع الأحماض النووية (RNA أو DNA) ذات الخيوط المختلفة. لقد طبقنا هذه البروتوكولات لدراسة دورات حياة مسببات الأمراض الفيروسية المتعددة ، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1 ، وفيروس T-lymphotropic البشري (HTLV) -1 ، وفيروس التهاب الكبد B (HBV) ، وفيروس التهاب الكبد C (HCV) ، وفيروس زيكا (ZKV) ، وفيروس الأنفلونزا A (IAV). لقد أثبتنا أنه يمكننا تسمية الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات بكفاءة عبر مجموعة متنوعة من الفيروسات. يمكن أن تزودنا هذه الدراسات بفهم ميكانيكي محسن للأنظمة الفيروسية المتعددة ، بالإضافة إلى ذلك ، تعمل كقالب لتطبيق التصوير الفلوري المتعدد للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين عبر مجموعة واسعة من الأنظمة الخلوية.
المقدمة
في حين أن الآلاف من الأجسام المضادة التجارية متاحة لتسمية البروتينات على وجه التحديد من خلال مناهج التلوين المناعي التقليدية ، وبينما يمكن هندسة بروتينات الاندماج باستخدام علامات الفلورسنت المحسنة للصور لتتبع بروتينات متعددة في العينة1 ، فإن التصور المجهري للبروتين غالبا ما يكون غير متوافق مع التهجين التقليدي للحمض النووي في الموقع (FISH)2 . أعاقت القيود التقنية في التصور المتزامن للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الأساليب القائمة على التألق الفهم المتعمق لتكاثر الفيروس. يسمح تتبع كل من الحمض النووي الفيروسي والبروتين أثناء العدوى لعلماء الفيروسات بتصور العمليات الأساسية التي تكمن وراء تكاثر الفيروس وت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خلايا البذور (الخلايا المعلقة مقابل الخلايا الملتصقة) على أغطية أو شرائح الغرفة (البروتوكول المقدم يستخدم coverslips).
- بذر الخلايا المعلقة
- تحضير أغطية مطلية ب poly-D-lysine (PDL) (تسهل التصاق خلايا التعليق بغطاء الغطاء) عن طريق احتضان أغطية الغطاء أولا في الإيثانول (EtOH) لمدة 5 دقائق (تعقيم أغطية الغطاء وإزالة أي بقايا). ثم اغسل 2x في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) قبل احتضان أغطية في PDL (20 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة (دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إزالة PDL وغسل 2x في برنامج تلفزيوني. خلايا بيليه (مصابة / عالجت سابقا بناء على ظروف التصوير المطلوبة) وإعادة تعليق 106خلايا في 50 ميكرولتر من PBS. ضع 50 ميكرولتر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصور الشكل 1 مخططا ل MICDDRP. يتبع وضع العلامات على الحمض النووي والحمض النووي الريبي تلطيخ المناعة. يزيد استخدام مكبرات الصوت المتفرعة من الإشارة ، مما يسمح باكتشاف جزيئات الحمض النووي المفردة.
الشكل 1: رسم تخطيطي ل MICDDRP وسير العمل خطوة بخطوة. (أ) يتم تضخيم إشارة bDNA عبر الحمض النووي المتفرع للمكبر الأولي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
غالبا ما يتطلب التصور المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين تحسينا واسع النطاق. طريقتان شائعتان هما وضع العلامات 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) و DNA FISH. تم تطبيق وسم EdU لتصور الحمض النووي الفيروسي والبروتين في وقت واحد ، حيث تم دمج EdU في الحمض النووي الناشئ وتم تصنيفه لاحقا بأصباغ فلورية تحتوي على أزيد عبر كيمياء النقر. وبالتالي يمكن استخدام وسم EdU لمراقبة حركية تكاثر الفيروسات الأصلية لفيروسات الحمض النووي أو الفيروسات باستخدام قوالب الحمض النووي للتكرار12. ومع ذلك ،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل كليا أو جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI121315 و R01 AI146017 و R01 AI148382 و R01 AI120860 و R37 AI076119 و U54 AI150472). نشكر الدكتور ريموند ف. شينازي وسادي أميشاي على توفير الخلايا المصابة بفيروس الأنفلونزا أ.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4٪ PFA | |||
| 50٪ كبريتات ديكستران | أمريسو | 198 | للمخزن المؤقت لتهجين الحمض النووي |
| 50X مخزن مؤقت الغسيل | ACD Bio | 320058 | |
| 6 آبار مكبر | |||
| للصوت 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD مكبر للصوت الحيوي | ||
| 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 الجدول في البروتوكول | |
| المضاد لفيروس التهاب الكبد C NS5a الجسم المضاد | Abcam | ab13833 | Mouse أحادي النسيلة ؛ يعمل مع الأنماط الجينية لفيروس التهاب الكبد C 1a و 1b و 3 و 4 |
| Anti-HIV-1 p24 الأجسام المضادة أحادية النسيلة | برنامج كاشف المعاهد الوطنية للصحة | الإيدز 3537 | |
| الأجسام المضادة المضادة ل Mov10 | Abcam | ab80613 | الأرنب متعدد النسيلة |
| الجسم المضاد ل PB1 | GeneTex | GTX125923 | الجسم المضاد ضد بروتين الأنفلونزا |
| ألبومين | كاشف حجب للتلطيخ | ||
| المناعي وسائط الخلية مع المكملات | الغذائية وسائل الإعلام المناسبة لنموذج الخلية | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear Stain (مجموعة RNAscope من ACD Bio) | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (1X PBS) | Gibco | 14190250 | خال من الكالسيوم والمغنيسيوم |
| كربونات الإيثيلين | Sigma | E26258 | |
| مصل بقري الجنين (FBS) | استخدم FBS محددا بناء على الجسم المضاد الثانوي في المصل الذي تم تربيته فيه (مثل الماعز FBS) | ||
| شرائح المجهر الملونة فيشربراند | فيشر ساينتفيك | 12-550-17 / 18/19 | قبل التنظيف |
| مسبار HCV-GT2a-sense-C2 | ACD Bio | 441371 | HCV (+) إحساس مسبار الحمض النووي |
| الريبي HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 مسبار (كدنا |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 مسبار الحمض النووي الريبي |
| HybEZ فرن التهجين | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge حاجز مسعور قلم | ناقلات مختبرات | H-4000 | |
| الأظافر | لغطاء الانزلاق قبل معالجة البروتياز | ||
| ماء خال من النوكليز | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | معطف في 20 & micro ؛ جم / مل من PDL لمدة 30 دقيقة | ||
| مسبار مخفف | ACD Bio | 300041 | لتخفيف مجسات الحمض النووي الريبي C2 أو C3 |
| إطالة الذهب المضاد للبهتان | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope & reg ؛ مسبار- V-الأنفلونزا-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| الأجسام | |||
| تنزلق | |||
| كلوريد | الصوديوم لمخزن تهجين الحمض النووي | ||
| سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 6.2 | للمخزن المؤقت لتهجين الحمض النووي | ||
| Tween-20 | للمخزن المؤقت لتهجين الحمض النووي و PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | مسبار HBV pgRNA |
| مسبار V-HCV-GT2a مسبار | ACD Bio | 441361 | HCV (-) مسبار الحمض النووي الريبي الإحساس |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) مسبار الحمض النووي الريبي الاستحساس يستهدف HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 مسبار الحمض النووي |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) مسبار الحمض النووي الريبي الإحساس |
| V-الأنفلونزا-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV مسبار الحمض النووي الريبي |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | مسبار الحمض النووي الريبي Zika(+) استشعار |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika (-) sense RNA مجس |
المراجع
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
