مقالة منهجية

التصوير الفلوري متعدد الخلية أحادي الخلية لتصور الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات ومراقبة فيروس نقص المناعة البشرية و HTLV و HBV و HCV وفيروس زيكا وعدوى الأنفلونزا

DOI:

10.3791/61843

⸱

أكتوبر 29, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biochemical Pharmacology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر هنا بروتوكول لنهج التصوير الفلوري ، multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA ، RNA ، و protein (MICDDRP) ، وهي طريقة قادرة على التصور المتزامن لخلية واحدة من البروتين الفيروسي والأحماض النووية من أنواع مختلفة وتقطعت بهم السبل. يمكن تطبيق هذا النهج على مجموعة متنوعة من الأنظمة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أعيق التقاط عمليات النسخ المتماثل والتجميع الديناميكيين للفيروسات بسبب الافتقار إلى تقنيات التهجين في الموقع (ISH) القوية التي تمكن من وضع العلامات الحساسة والمتزامنة للحمض النووي الفيروسي والبروتين. غالبا ما تكون طرق التهجين الموضعي التقليدية للحمض النووي (FISH) غير متوافقة مع التلوين المناعي. لذلك قمنا بتطوير نهج التصوير ، MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA ، RNA و protein) ، والذي يتيح التصور المتزامن لخلية واحدة للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين. بالمقارنة مع أسماك الحمض النووي التقليدية ، يستخدم MICDDRP تقنية الحمض النووي المتفرع (bDNA) ISH ، والتي تعمل على تحسين حساسية مسبار قليل النوكليوتيد واكتشافه بشكل كبير. تتيح التعديلات الصغيرة ل MICDDRP تصوير البروتينات الفيروسية بالتزامن مع الأحماض النووية (RNA أو DNA) ذات الخيوط المختلفة. لقد طبقنا هذه البروتوكولات لدراسة دورات حياة مسببات الأمراض الفيروسية المتعددة ، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1 ، وفيروس T-lymphotropic البشري (HTLV) -1 ، وفيروس التهاب الكبد B (HBV) ، وفيروس التهاب الكبد C (HCV) ، وفيروس زيكا (ZKV) ، وفيروس الأنفلونزا A (IAV). لقد أثبتنا أنه يمكننا تسمية الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات بكفاءة عبر مجموعة متنوعة من الفيروسات. يمكن أن تزودنا هذه الدراسات بفهم ميكانيكي محسن للأنظمة الفيروسية المتعددة ، بالإضافة إلى ذلك ، تعمل كقالب لتطبيق التصوير الفلوري المتعدد للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين عبر مجموعة واسعة من الأنظمة الخلوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين أن الآلاف من الأجسام المضادة التجارية متاحة لتسمية البروتينات على وجه التحديد من خلال مناهج التلوين المناعي التقليدية ، وبينما يمكن هندسة بروتينات الاندماج باستخدام علامات الفلورسنت المحسنة للصور لتتبع بروتينات متعددة في العينة1 ، فإن التصور المجهري للبروتين غالبا ما يكون غير متوافق مع التهجين التقليدي للحمض النووي في الموقع (FISH)2 . أعاقت القيود التقنية في التصور المتزامن للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الأساليب القائمة على التألق الفهم المتعمق لتكاثر الفيروس. يسمح تتبع كل من الحمض النووي الفيروسي والبروتين أثناء العدوى لعلماء الفيروسات بتصور العمليات الأساسية التي تكمن وراء تكاثر الفيروس وتجميعه3،4،5،6.

لقد طورنا نهجا للتصوير ، multiplex immunofluorescent cell القائم على d etection ل DNA ، RNA ، و Protein (MICDDRP) 3 ، والذي يستخدم تقنية الحمض النووي المتفرع (bDNA) في الموقع لتحسين حساسية الكشف عن الحمض النووي7،8،9 . بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم هذه الطريقة مجسات مقترنة لتحسين الخصوصية. تستخدم المجسات الخاصة بتسلسل bDNA الحمض النووي المضخم المتفرع والحمض النووي المضخم لإنتاج إشارة مكثفة وموضعية ، مما يحسن طرق التهجين السابقة التي اعتمدت على استهداف المناطق المتكررة في الحمض النووي9. غالبا ما لا تحتوي الخلايا المصابة في سياق سريري على مواد وراثية فيروسية وفيرة ، مما يوفر سلعة لطريقة حساسة للكشف عن الحمض النووي الفلوري في إعدادات التشخيص. وقد ملأ تسويق تكنولوجيا bDNA من خلال نهج مثل RNAscope7 و ViewRNA10 هذا المكانة. كما أن حساسية التصوير الفلوري bDNA لها فائدة مهمة في بيولوجيا الخلية ، مما يسمح باكتشاف أنواع الحمض النووي النادرة في نماذج زراعة الخلايا. التحسن الكبير في الحساسية يجعل طرق التصوير القائمة على الحمض النووي البريطاني مناسبة لدراسة الفيروسات. ومع ذلك ، فإن العيب المحتمل هو أن هذه الطرق تركز على تصور الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي والبروتين. تحتوي جميع الخلايا المتكاثرة والعديد من الفيروسات على جينومات الحمض النووي أو تشكل الحمض النووي أثناء دورة النسخ المتماثل ، مما يجعل الطرق القادرة على تصوير كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، وكذلك البروتين ، مرغوبة للغاية.

في بروتوكول MICDDRP ، نقوم بإجراء bDNA FISH للكشف عن الحمض النووي الفيروسي باستخدام طريقة RNAscope ، مع التعديلات7. أحد التعديلات الرئيسية على هذا البروتوكول هو تحسين علاج الأنزيم البروتيني بعد التثبيت الكيميائي. يسهل العلاج بالبروتياز إزالة البروتينات المرتبطة بالحمض النووي لتحسين كفاءة تهجين المسبار. يتبع العلاج بالبروتياز حضانة بمسبار (مسبار) قليل النوكليوتيد المتفرع. بعد تطبيق مسبار (مسبار) bDNA ، يتم غسل العينات وتحضينها لاحقا باستخدام الحمض النووي للإشارة المسبقة ومكبر الصوت. يتطلب التهجين المتعدد في الموقع (ISH) ، ووضع العلامات على أهداف جينية متعددة ، مجسات مستهدفة بقنوات ألوان مختلفة للتمايز الطيفي7. يتبع الحضانة مع مكبرات الحمض النووي التألق المناعي (IF).

يضفي bDNA ISH تحسينات في الإشارة إلى الضوضاء عن طريق تضخيم الإشارات الخاصة بالهدف ، مع تقليل ضوضاء الخلفية من أحداث التهجين غير المحددة 7,11. تم تصميم المجسات المستهدفة باستخدام برامج متاحة للجمهور تتنبأ باحتمال أحداث التهجين غير المحددة ، بالإضافة إلى حساب درجة حرارة الانصهار (Tm) للهجين المستهدفللمسبار 7,11. تحتوي المجسات المستهدفة على منطقة من 18 إلى 25 قاعدة مكملة لتسلسل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المستهدف ، وتسلسل فاصل ، وتسلسل ذيل مكون من 14 قاعدة. زوج من المجسات المستهدفة ، لكل منها تسلسل ذيل مميز ، يهجن إلى منطقة مستهدفة (تمتد ~ 50 قاعدة). يشكل تسلسلا الذيل موقع تهجين لمجسات ما قبل مكبر الصوت ، والتي تحتوي على 20 موقعا ملزما لمجسات مكبر الصوت ، والتي تحتوي بالإضافة إلى ذلك على 20 موقعا ملزما لمسبار الملصق. على سبيل المثال ، يتم استهداف منطقة كيلو قاعدة واحدة (kb) على جزيء الحمض النووي بواسطة 20 زوجا من المسبار ، مما يؤدي إلى إنشاء سقالة جزيئية للتهجين المتسلسل باستخدام المضخم الأولي ومكبر الصوت ومسبار الملصق. وبالتالي يمكن أن يؤدي ذلك إلى عائد نظري يبلغ 8000 ملصق فلورسنت لكل جزيء حمض نووي ، مما يتيح الكشف عن الجزيئات المفردة والتحسينات الكبيرة على نهج FISH التقليدي7 (انظر الشكل 1A للحصول على مخطط لتضخيم إشارة bDNA). لإعداد مجسات ل ISH المتعدد ، يجب أن يكون كل مسبار مستهدف في قناة لونية مختلفة (C1 أو C2 أو C3). تمتلك هذه المجسات المستهدفة ذات القنوات الملونة المختلفة تسلسلات ذيل مميزة من 14 قاعدة. ستربط تسلسلات الذيل هذه مضخمات إشارة مميزة بمجسات فلورية مختلفة ، مما يتيح التمايز الطيفي السهل عبر أهداف متعددة. في البروتوكول المقدم ، يقدم الجدول 4 في الخطوة 9 مزيدا من المعلومات حول وضع العلامات الفلورية على المجسات المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك ، يقدم الشكل 2 والشكل 3 أمثلة على كيفية اختيارنا لمكبر الصوت المناسب 4-FL (A أو B أو C) (مسبار الفلورسنت وخطوة التهجين النهائية) لتحقيق وضع علامات فلورية محددة لأهداف الحمض النووي الفيروسي المتعددة بعد عدوى HIV-1 و HTLV-1.

لقد أظهرنا العديد من التطبيقات لتصور التألق المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات ، مع ملاحظة المراحل الحرجة من تكاثر الفيروس بدقة زمانية مكانية عالية3،4،5. على سبيل المثال ، سمح لنا التصور المتزامن لخلية واحدة للحمض النووي الريبي الفيروسي والحمض النووي السيتوبلازمي والنووي والبروتين بتصور الأحداث الرئيسية أثناء الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، بما في ذلك اتباع نوى تحتوي على الحمض النووي الريبي في السيتوبلازم قبل الدخول النووي وتكامل الحمض النوويالفيروسي 3. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطبيق MICDDRP لتوصيف آثار العوامل المضيفة والعلاج بالعقاقير على العدوى الفيروسية والتكرار 4,5. في Ukah et al. ، تتبعنا إعادة تنشيط نسخ HIV-1 في نماذج خلايا الكمون المعالجة بعوامل عكس زمن الوصول المختلفة لتصور نسخ فيروس نقص المناعة البشرية وعكس الكمون4. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسمح لنا MICDDRP بتصور التغيرات المظهرية المرتبطة بالتثبيط المضاد للفيروسات المنسوب إلى العلاج بالجزيئات الصغيرة أو تقييد عامل المضيف. كدليل على المفهوم على متانة نهجنا وقابليته للتطبيق على نطاق واسع ، أثبتنا أنه يمكننا استخدام تعديلات بروتوكولنا لتسمية الحمض النووي الفيروسي بكفاءة لمتابعة العدوى ليس فقط في فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1 ، ولكن أيضا فيروس T-lymphotropic البشري (HTLV) -1 ، فيروس التهاب الكبد B (HBV) ، فيروس التهاب الكبد C (HCV) ، فيروس زيكا (ZIKV) وفيروس الأنفلونزا A (IAV). نظرا لأن دورة حياة HIV-1 تتكون من كل من أنواع الحمض النووي الفيروسي والحمض النووي الريبي ، فقد أجرينا غالبية تحسيننا ل MICDDRP بعد حركية تكرار HIV-1. ومع ذلك ، بالإضافة إلى ذلك ، فقد أثبتنا أنه يمكننا تتبع تخليق نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسية المختلفة لأي من أو كليهما من الحس (+) و antisense (-) في الفيروسات مثل ZIKV و IAV و HBV و HCV لمراقبة النسخ الفيروسي والنسخ المتماثل3،4،5،6. تهدف الدراسات إلى تحسين الفهم الميكانيكي للعديد من العمليات الفيروسية وتكون بمثابة مبدأ توجيهي لتنفيذ تقنية التصوير الفلوري هذه لمجموعة واسعة من النماذج الخلوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلايا البذور (الخلايا المعلقة مقابل الخلايا الملتصقة) على أغطية أو شرائح الغرفة (البروتوكول المقدم يستخدم coverslips).

  1. بذر الخلايا المعلقة
    1. تحضير أغطية مطلية ب poly-D-lysine (PDL) (تسهل التصاق خلايا التعليق بغطاء الغطاء) عن طريق احتضان أغطية الغطاء أولا في الإيثانول (EtOH) لمدة 5 دقائق (تعقيم أغطية الغطاء وإزالة أي بقايا). ثم اغسل 2x في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) قبل احتضان أغطية في PDL (20 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة (دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. إزالة PDL وغسل 2x في برنامج تلفزيوني. خلايا بيليه (مصابة / عالجت سابقا بناء على ظروف التصوير المطلوبة) وإعادة تعليق 106خلايا في 50 ميكرولتر من PBS. ضع 50 ميكرولتر من الخلايا على الزجاج (مطلي ب PDL) واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
  2. بذر الخلايا الملتصقة
    1. توضع الخلايا المستزرعة على غطاء معقم في طبق من 6 آبار وتصيب الخلايا بجزيئات فيروسية أو تعالج بمركب ذي أهمية. السماح للخلايا بالوصول إلى التقاء 50-70٪ قبل تحضير العينة لتجارب التصوير.

2. التثبيت الخلوي: للحفاظ على التشكل الخلوي لدراسات التصوير الفلوري

ملاحظة: احتفظ بنسبة 4٪ PFA و PBS في RT لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التثبيت الخلوي.

  1. قم بشفط الوسائط الخلوية ، واغسل الخلايا على أغطية 3x في PBS ، وقم بإصلاح الخلايا في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 30 دقيقة. نضح PFA وغسل الخلايا في PBS 2x.
    ملاحظة: يمكن الآن تجفيف الخلايا وتخزينها ، إذا رغب المجرب في استئناف التجربة في تاريخ آخر. يمكن تجفيف الخلايا الثابتة في EtOH قبل التخزين.
    1. قم بإزالة PBS بعد الغسيل بعد التثبيت الخلوي واستبدله ب 500 ميكرولتر من 50٪ EtOH (v / v في الماء). احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    2. قم بإزالة 50٪ EtOH واستبدلها ب 500 ميكرولتر من 70٪ EtOH. احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإزالة 70٪ EtOH واستبدله ب 500 ميكرولتر من 100٪ EtOH. احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    4. قم بإزالة 100٪ EtOH واستبدله ب EtOH طازج 100٪.
      ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا المجففة في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. ختم الألواح بشريط أو بارافيلم قبل التخزين لمنع تبخر EtOH.
    5. إعادة ترطيب الخلايا للانتقال إلى وضع العلامات الفلورية المتعددة للخلايا / الفيروسات.
    6. قم بإزالة 100٪ EtOH واستبدله ب 500 ميكرولتر من 70٪ EtOH. احتضان في RT لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: لا تدع الخلايا تجف في أي وقت. استخدم دائما ما يكفي من الحل لغمر جميع الخلايا.
    7. قم بإزالة 70٪ EtOH واستبدله ب 500 ميكرولتر من 50٪ EtOH. احتضان في RT لمدة 2 دقيقة.
    8. قم بإزالة 50٪ EtOH واستبدله ب 1x PBS.
      ملاحظة: قم بإعداد تخفيف الأنزيم البروتيني ، ومجسات التهجين ، ومحلول الغسيل قبل علاج الأنزيم البروتيني (الخطوة 4) وتطبيق المسبار المستهدف (الخطوة 5). يتم تقديم تعليمات محددة حول إعداد الكاشف في بداية كل خطوة على حدة.
الكواشفملاحظات أخرى
محلول البروتيازالتحضير في 1X PBS
مسبار (مسبار) قليل النوكليتودي المستهدفتمييع في التهجين العازلة
غسل العازلةيغسل باتباع خطوات التهجين المستهدفة
المخزن المؤقت التهجينوصفة معروضة في الجدول 3

الجدول 1: الكواشف الرئيسية في بروتوكول MICDDRP.

3. نفاذية الخلية: يزيد من الوصول إلى الخلية والعضيات الخلوية لدخول الجزيئات الكبيرة (الأجسام المضادة ، مجسات تهجين الحمض النووي)

  1. قم بإزالة 1x PBS بعد التثبيت الخلوي أو الإماهة واستبدله ب 500 ميكرولتر من 0.1٪ (v / v) Tween-20 في 1x PBS. احتضان في RT لمدة 10 دقائق. استبدل واحدا تلو الآخر. اغسل مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من 1x PBS وأضف 1x PBS طازجا.

4. تثبيت Coverslip على الشريحة الزجاجية ومعالجة البروتياز لإزالة بروتينات ربط الحمض النووي من الحمض النووي الفيروسي / الخلوي الثابت لتحسين كفاءة التهجين

ملاحظة: تحضير محلول البروتياز الثالث المخفف (انظر تفاصيل الكاشف في جدول المواد) أثناء النفاذية الخلوية. دع البروتياز يصل إلى RT لمدة 10 دقائق قبل النفاذية.

  1. ضع قطرة صغيرة من طلاء الأظافر على شريحة زجاجية معقمة. جفف الظهر (الجانب بدون طبقة خلوية) وضع حافة الغطاء على قطرة طلاء الأظافر ، مع توجيه الجانب مع الخلايا الملتصقة لأعلى. أضف بضع قطرات من PBS على غطاء الغطاء المتجمد لمنع الجفاف.
    1. ارسم دائرة (على بعد حوالي 3 مم من غطاء الغطاء) حول محيط الغطاء الملتصق الآن بالشريحة باستخدام قلم حاجز كاره للماء (قلم طارد للماء يحافظ على الكواشف موضعية على الخلايا).
  2. تمييع البروتياز الثالث في 1x PBS (100 ميكرولتر / غطاء الغطاء).
    ملاحظة: قد يلزم تعديل تركيز الأنزيم البروتيني اعتمادا على الاختلافات في أنواع الخلايا أو المجسات أو الحمض (الأحماض) النووية المستهدفة من خلال التحسين التجريبي (انظر المناقشة). بالنسبة لوضع العلامات الأكثر كفاءة على الحمض النووي الريبي / الحمض النووي عبر الأنظمة الفيروسية المختلفة ، حققنا نجاحا مع التخفيفات التالية المعروضة في الجدول 2 أدناه مع التخفيفات التي تتراوح من (1 إلى 2 ) - (1 إلى 15) (البروتياز إلى 1x PBS).
التحقيق في الأهدافتخفيف البروتياز في 1X PBS (البروتياز الثالث إلى 1X PBS)
HIV-1 الحمض النووي / الحمض النووي الريبي1 إلى 5
HTLV-1 الحمض النووي / الحمض النووي الريبي1 إلى 5
HBV pgRNA وإجمالي الحمض النووي الريبي HBV1 إلى 15
IAV RNA1 إلى 15
ZIKV RNA1 إلى 2

الجدول 2: التخفيفات البروتينية III في PBS لتهجين الحمض النووي الفيروسي.

  1. صب 1x PBS على غطاء الغطاء بعد الشلل وتطبيق البروتياز المخفف الثالث.
  2. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. صب محلول الأنزيم البروتيني وغمر الشرائح في 1x PBS. حرك مع طبق هزاز لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل مع 1x PBS الجديد.
    1. للكشف عن الحمض النووي فقط ، اغسل العينات ثلاث مرات بالماء الخالي من النيوكلياز لمدة 2 دقيقة لكل منها ، تليها الحضانة مع 5 ملغ / مل RNase A المخفف في PBS لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. صب محلول RNase A ، واغسل 3x لمدة 2 دقيقة بماء عالي النقاء. استمر مع ISH للمسبار (التحقيقات) المستهدفة.
      ملاحظة: يعمل المخزن المؤقت للتهجين على تحسين اكتشاف vDNA دون التأثير على كفاءة تلطيخ vRNA للنتائج المقدمة (النتائج التمثيلية). تمييع مجسات قناة الحمض النووي 1 (C1) 1: 1 مع مسبار التهجين. تمييع مجسات RNA C2 و C3 في المخزن المؤقت للتهجين. مجسات C2 و C3 المستخدمة في دراسات التصوير لدينا موجودة في حلول 50X (1:50 ؛ المسبار المستهدف إلى المخزن المؤقت للتهجين).
  4. قم بإعداد مخزن التهجين المؤقت في الماء الخالي من النيوكلياز باتباع الإجراء خطوة بخطوة أدناه:
    1. في أنبوب سعة 15 مل ، أضف 700 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، و 300 ميكرولتر من 50٪ (الوزن / الحجم (وزن / حجم)) كبريتات ديكستران ، و 300 ميكرولتر من 5 م كلوريد الصوديوم ، و 125 ميكرولتر من 200 مللي مول من سترات الصوديوم (درجة الحموضة 6.2) ، و 375 ملغ (مسحوق) من كربونات الإيثيلين.
    2. تخلط جيدا باستخدام دوامة لإذابة كربونات الإيثيلين (تأكد من إذابة كل المسحوق ومحلول شفاف).
    3. أضف 25 ميكرولتر من 10٪ (الحجم / الحجم (v / v)) Tween-20 وما يكفي من الماء الخالي من النيوكلياز لإكمال 2.5 مل (محلول 2x).
      ملاحظة: يمكن العثور على وصفة المخزن المؤقت للتهجين المقدمة في الجدول 3 أدناه. الحل مستقر لمدة أسبوع. تأكد من الخلط الكافي لمنظف Tween-20 ، مع الحرص على منع فقاعات المحلول.
الكاشفتركيز المخزونملاحظات إضافية
مياه خالية من النيوكليازغير متوفر
ديكستران كبريتات50٪ (وزن / رأسي)لزج جدا
كلوريد الصوديوم5 م
سترات الصوديوم (درجة الحموضة 6.2)200 مللي متريحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية
كربونات الإيثيلينغير متوفرذرور
توين -2010٪ (V / V)

الجدول 3: قائمة الكواشف العازلة للتهجين.

5. الحضانة باستخدام مجسات التهجين المستهدفة DNA / RNA: ترتبط مجسات قليل النوكليوتيد المستهدفة بالمنطقة (المناطق) ذات الأهمية ، مما يؤدي إلى إنشاء سقالة جزيئية لمكبرات الصوت المسبقة ومكبرات الصوت ومجسات الفلورسنت لربطها.

ملاحظة: يتم تسخين مجسات الحمض النووي / الحمض النووي الريبي عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (أثناء نفاذية الخلية) وتبرد إلى RT لمدة 10 دقائق على الأقل ، إذا لم يتم تضمين علاج RNase. إذا كانت هناك حاجة إلى معالجة RNase أو مزيد من معالجة العينة قبل تهجين المسبار المستهدف ، فقم بإجراء مجسات دافئة وفقا لذلك. قم بتدوير مجسات C2 و C3 بعد الاحترار وتخفيفها في المخزن المؤقت للتهجين. بعد التخفيف ، يمكن تسخين مجسات C2 و C3 لفترة وجيزة. قم بتسخين محلول الغسيل 50x (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل) عند 40 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة وقم بتخفيفه إلى 1x في ماء بدرجة البيولوجيا الجزيئية.

  1. احتضان 200 ميكرولتر من مخزن التهجين عند 67 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل إضافة مسبار (مسبار) التهجين. تمييع التحقيق في التهجين العازلة (وصفة المدرجة في الجدول 2). أضف 50 ميكرولتر / غطاء غطاء.
  2. احتضان في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (ساعة). مجسات صب وشرائح غمر في 1x غسل العازلة . حرك بواسطة طبق هزاز لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x.

6. مكبر للصوت (أمبير) 1-FL التهجين: إضافة مضخم مسبق مكمل لتسلسل الذيل لمجسات الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المستهدفة (الخطوة 5)

ملاحظة: يجب أن تكون مكبرات الصوت في RT قبل الاستخدام. أخرج كل مكبر صوت فردي من الثلاجة قبل 30 دقيقة من الاستخدام واتركه على المقعد في RT.

  1. قم بإزالة الشرائح من 1x محلول غسيل واضغط / امتصها لإزالة السائل الزائد.
  2. أضف قطرة واحدة من Amp 1-FL على غطاء الغطاء. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. صب أمبير 1-FL وتغمر في 1x غسل العازلة. حرك عن طريق هزاز الطبق لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x.

7. تهجين Amp 2-FL: الحضانة مع مضخم الإشارة مع تسلسل التعرف المماثل على مكبرات الصوت المسبقة (Amp 1-FL)

  1. قم بإزالة الشرائح من 1x محلول غسيل واضغط / امتصها لإزالة السائل الزائد.
  2. أضف قطرة واحدة من Amp 2-FL على غطاء الغطاء. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. صب أمبير 2-FL وتغمر في 1x غسل العازلة. حرك عن طريق هزاز الطبق لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x.

8. تهجين Amp 3-FL: الحضانة مع مضخم الإشارة الثاني

  1. قم بإزالة الشرائح من 1x محلول غسيل واضغط / امتصها لإزالة السائل الزائد.
  2. أضف 1 قطرة من Amp 3-FL على غطاء الغطاء. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. صب أمبير 3-FL وتغمر في 1x غسل العازلة. حرك عن طريق هزاز الطبق لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x.

9. تهجين Amp 4-FL: تسمية الفلورسنت وخطوة التهجين النهائية

ملاحظة: أولا ، انظر الجدول 4 لاختيار Amp 4 المناسب (A أو B أو C) - FL بناء على قنوات المسبار (المسبار) المستهدف. قم بتقييم ما هو Amp 4-FL المطلوب لتسمية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي محل الاهتمام. يتم توفير مثال في الجدول أدناه:

ABC
قناة الحمض النووي 1 (C1)488550550
قناة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي 2 (C2)550488647
قناة الحمض النووي الريبي 3 (C3)647647488

الجدول 4: اختيار مسبار الفلورسنت Amp 4 (A أو B أو C) -FL ل ISH المتعدد.

ملاحظة: بالنسبة ل FISH متعدد الإرسال (أهداف متعددة) ، يعد اختيار Amp 4 (A أو B أو C) - FL الصحيح أمرا بالغ الأهمية لتسمية هدفك (اهتماماتك) بشكل صحيح. تحتوي المجسات المستهدفة (الخطوة 5) على قنوات ألوان مختلفة (C1 أو C2 أو C3) ، والتي تملي تسمية الفلورسنت الخاصة بها (Alexa 488 أو Atto 550 أو Alexa 647) ، بناء على Amp 4-FL المختار. يتم توفير أمثلة على اختيار مجموعات الفلوروفور للتصوير المتعدد في أساطير الشكل 2 والشكل 3. كمثال إضافي ، سيؤدي اختيار Amp 4B-FL إلى تسمية مجسات DNA C1 بشكل انتقائي باستخدام مجسات Atto 550 و RNA C3 باستخدام Alexa 647.

  1. قم بإزالة الشرائح من 1x محلول غسيل واضغط / امتصها لإزالة السائل الزائد.
  2. أضف 1 قطرة من Amp 4-FL على غطاء الغطاء. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: باتباع الخطوة 9.2 ، احتفظ بالعينات مغطاة ومحمية من الضوء.
  3. صب أمبير 4-FL وتغمر في 1x غسل العازلة. حرك بواسطة طبق هزاز لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x. يغسل مع 1x PBS (2 دقيقة) وتخزينها في PBS.

10. تلطيخ البروتين المناعي: لتسمية البروتين (البروتينات) ذات الأهمية

  1. صب PBS وإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر (1٪ w / v BSA ، 10٪ v / v FBS في PBS مع 0.1٪ v / v Tween-20 (PBST)) إلى غطاء الغطاء. احتضان 1 ساعة في RT.
  2. صب العازلة حجب وتطبيق 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف في PBST + 1٪ w / v BSA. احتضان 1 ساعة في RT.
  3. اغسل الشريحة مرتين باستخدام PBST لمدة 10 دقائق في RT مع الرج.
  4. تطبيق الجسم المضاد الثانوي المفضل لمدة 1 ساعة في RT في PBST + 1٪ w / v BSA.
  5. اغسل الشريحة باستخدام PBST لمدة 10 دقائق في RT مع الاهتزاز.

11. تلطيخ النووية: مكافحة وصمة عار النوى بعد المناعية

  1. صب PBST وتطبيق DAPI أو بقعة نووية من اختيارك لمدة 1 دقيقة في RT.
  2. اغسل الشريحة مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق في RT مع الاهتزاز.

12. تصاعد

  1. ضع 1 قطرة من محلول مضاد للتلاشي (على سبيل المثال ، Prolong Gold) على شريحة زجاجية معقمة جديدة (أولا ، نظف الشريحة باستخدام EtOH واتركها تجف لضمان عدم وجود بقايا على الزجاج). بنفس الطرف ، انشر قطرة المحلول المضاد للتلاشي لتغطية مساحة بحجم قسيمة الغطاء تقريبا.
    ملاحظة: المحلول المضاد للتلاشي لزج للغاية وقد يكون من الصعب ماصته. قد يؤدي قطع الطرف من طرف 200 ميكرولتر قبل السحب إلى التخفيف من هذه المشكلات.
  2. قم بإزالة غطاء الغطاء مع عينة الخلية من الشريحة واغمرها في PBS لإزالة طلاء الأظافر المتبقي في الخلف باستخدام الملقط و PBS. ملقط جاف وظهر غطاء باستخدام Kimwipe.
  3. قم بتضمين غطاء الغطاء برفق في قطرة المحلول المضاد للتلاشي ، مع وضع جانب العينة (الجانب مع طبقة الخلية) من غطاء الغطاء عند السقوط).
  4. دع العينات تجف بين عشية وضحاها.

13. التصوير

  1. صورة مع المجهر epifluorescent.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصور الشكل 1 مخططا ل MICDDRP. يتبع وضع العلامات على الحمض النووي والحمض النووي الريبي تلطيخ المناعة. يزيد استخدام مكبرات الصوت المتفرعة من الإشارة ، مما يسمح باكتشاف جزيئات الحمض النووي المفردة.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي ل MICDDRP وسير العمل خطوة بخطوة. (أ) يتم تضخيم إشارة bDNA عبر الحمض النووي المتفرع للمكبر الأولي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما يتطلب التصور المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين تحسينا واسع النطاق. طريقتان شائعتان هما وضع العلامات 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) و DNA FISH. تم تطبيق وسم EdU لتصور الحمض النووي الفيروسي والبروتين في وقت واحد ، حيث تم دمج EdU في الحمض النووي الناشئ وتم تصنيفه لاحقا بأصباغ فلورية تحتوي على أزيد عبر كيمياء النقر. وبالتالي يمكن استخدام وسم EdU لمراقبة حركية تكاثر الفيروسات الأصلية لفيروسات الحمض النووي أو الفيروسات باستخدام قوالب الحمض النووي للتكرار12. ومع ذلك ،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل كليا أو جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI121315 و R01 AI146017 و R01 AI148382 و R01 AI120860 و R37 AI076119 و U54 AI150472). نشكر الدكتور ريموند ف. شينازي وسادي أميشاي على توفير الخلايا المصابة بفيروس الأنفلونزا أ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ PFA
50٪ كبريتات ديكسترانأمريسو198للمخزن المؤقت لتهجين الحمض النووي
50X مخزن مؤقت الغسيلACD Bio320058
6 آبار مكبر
للصوت 1-FLACD Bio
Amplifier 2-FLACD Bio
Amplifier 3-FLACD مكبر للصوت الحيوي
4-FLACD BioConsult Amp-4 الجدول في البروتوكول
المضاد لفيروس التهاب الكبد C NS5a الجسم المضادAbcamab13833Mouse أحادي النسيلة ؛ يعمل مع الأنماط الجينية لفيروس التهاب الكبد C 1a و 1b و 3 و 4
Anti-HIV-1 p24 الأجسام المضادة أحادية النسيلةبرنامج كاشف المعاهد الوطنية للصحةالإيدز 3537
الأجسام المضادة المضادة ل Mov10Abcamab80613الأرنب متعدد النسيلة
الجسم المضاد ل PB1GeneTexGTX125923الجسم المضاد ضد بروتين الأنفلونزا
ألبومينكاشف حجب للتلطيخ
المناعي وسائط الخلية مع المكملاتالغذائية وسائل الإعلام المناسبة لنموذج الخلية
Coverslips
DAPIACD BioNuclear Stain (مجموعة RNAscope من ACD Bio)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (1X PBS)Gibco14190250خال من الكالسيوم والمغنيسيوم
كربونات الإيثيلينSigmaE26258
مصل بقري الجنين (FBS)استخدم FBS محددا بناء على الجسم المضاد الثانوي في المصل الذي تم تربيته فيه (مثل الماعز FBS)
شرائح المجهر الملونة فيشربراندفيشر ساينتفيك12-550-17 / 18/19قبل التنظيف
مسبار HCV-GT2a-sense-C2ACD Bio441371HCV (+) إحساس مسبار الحمض النووي
الريبي HIV-gagpol-C1ACD Bio317701HIV-1 مسبار (كدنا
HIV-nongagpol-C3ACD Bio317711-CHIV-1 مسبار الحمض النووي الريبي
HybEZ فرن التهجينACD Bio321710/321720
ImmEdge حاجز مسعور قلمناقلات مختبراتH-4000
الأظافرلغطاء الانزلاق قبل معالجة البروتياز
ماء خال من النوكليزAmbionAM9937
Poly-d-lysine (PDL)معطف في 20 & micro ؛ جم / مل من PDL لمدة 30 دقيقة
مسبار مخففACD Bio300041لتخفيف مجسات الحمض النووي الريبي C2 أو C3
إطالة الذهب المضاد للبهتانInvitrogenP36930
Protease IIIACD Bio322337
RNAscope & reg ؛   مسبار- V-الأنفلونزا-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221
RNase AQiagen
الأجسام
تنزلق
كلوريدالصوديوم لمخزن تهجين الحمض النووي
سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 6.2للمخزن المؤقت لتهجين الحمض النووي
Tween-20للمخزن المؤقت لتهجين الحمض النووي و PBS-T
V-HBV-GTDACD Bio441351Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2ACD Bio465531-C2مسبار HBV pgRNA
مسبار V-HCV-GT2a مسبارACD Bio441361HCV (-) مسبار الحمض النووي الريبي الإحساس
V-HTLV-HBZ-sense-C3ACD Bio495071-C3HTLV-1 (-) مسبار الحمض النووي الريبي الاستحساس يستهدف HBZ
V-HTLV1-GAG-C2ACD Bio495051-C2HTLV-1 مسبار الحمض النووي
V-HTLV1-GAG-POL-senseACD Bio495061HTLV-1 (+) مسبار الحمض النووي الريبي الإحساس
V-الأنفلونزا-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221IAV مسبار الحمض النووي الريبي
V-ZIKA-pp-O2ACD Bio464531مسبار الحمض النووي الريبي Zika(+) استشعار
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2ACD Bio478731-C2Zika (-) sense RNA مجس
مصل البقر ) طلاء غطاء المضادة الثانوية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
  2. Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882(2017).
  4. Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
  5. Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
  6. Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  8. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721(2019).
  9. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  10. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
  11. Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  12. Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
  13. Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
  14. Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505(2020).
  15. Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Multiplex Fluorescence ImagingViral Nucleic Acid DetectionViral Protein VisualizationSingle Cell AnalysisBranched DNA ISH TechnologyImmunofluorescent Cell Based DetectionConfocal MicroscopyHIV 1 Infection StudyHBV RNA QuantificationHCV Infection Imaging

مقالات ذات صلة