هنا نقدم مفصلة، بروتوكول خطوة بخطوة لهندسة الجينوم CRISPR/Cas9 القائم على الخلايا B البشرية الأولية لضربة قاضية الجينات (KO) وضرب في (KI) لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات في الخلايا B وتطوير العلاجات B-الخلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
هندسة الجينوم للخلايا B البشرية الأولية باستخدام CRISPR/Cas9
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا البائية هي خلايا لمفاوية مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم وهي مكون رئيسي في الذراع الفكاهي للجهاز المناعي التكيفي. أنها تجعل المرشحين جذابة للعلاجات القائمة على الخلايا بسبب سهولة عزلها عن الدم المحيطي، وقدرتها على التوسع في المختبر، وطول عمرها في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام وظيفتها البيولوجية الطبيعية - لإنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة - للتعبير عن كميات كبيرة جدا من البروتين العلاجي ، مثل جسم مضاد مؤتلف لمكافحة العدوى ، أو إنزيم لعلاج أمراض الأنزيموباث. هنا، نقدم أساليب مفصلة لعزل الخلايا B البشرية الأولية من خلايا الدم الأحادية الطرفية (PBMCs) وتفعيل / توسيع الخلايا B المعزولة في المختبر. ثم نقوم بإظهار الخطوات التي ينطوي عليها استخدام نظام CRISPR/Cas9 ل KO الخاص بالموقع للجينات الذاتية في الخلايا B. هذه الطريقة تسمح لكو كفاءة الجينات المختلفة، والتي يمكن استخدامها لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات ذات الأهمية. ثم نقوم بإظهار خطوات استخدام نظام CRISPR/Cas9 جنبا إلى جنب مع ناقل فيروسي (rAAV) مرتبط بال أدينو للتكامل الفعال لكل موقع من كاسيت التعبير المتحول في الخلايا B. يوفر هذا البروتوكول معا منصة هندسية خطوة بخطوة يمكن استخدامها في الخلايا B البشرية الأولية لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات وكذلك لتطوير علاجات الخلايا B.
المقدمة
الخلايا B هي مجموعة فرعية من سلالة الخلايا الليمفاوية المستمدة من الخلايا الجذعية الدموية. أنها تؤدي دورا حاسما في الجهاز المناعي الفكاهي التكيفية من خلال إنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة استجابة للتحديات المناعية1. الخلايا B هي أيضا سلائف خلايا الذاكرة B وخلايا البلازما المتمايزة بشكل نهائي وطويلة العمر ، وبالتالي توفير مناعة فكاهة دائمة2. خلايا البلازما، على وجه الخصوص، هي فريدة من نوعها بين الخلايا المناعية في قدرتها على إنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة محددة أثناء البقاء على قيد الحياة لسنوات أو عقود3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن سهولة العزلة عن الدم المحيطي تجعل نسب الخلية B مرشحا ممتازا ل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على عينات من المتبرعين الأصحاء من بنك دم محلي. تم تحديد جميع التجارب الموصوفة هنا لتكون معفاة للبحوث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) ووافقت عليها لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) في جامعة مينيسوتا.
ملاحظة: أجريت جميع التجارب امتثالا للاحتياطات العالمية لمسببات الأمراض المنقولة بالدم، باستخدام تقنيات معقمة/مطهرة ومعدات مناسبة للسلامة البيولوجية من المستوى 2.
1. إعداد ملاحق لB-الخلية توسيع المتوسطة
- إعادة تشكيل CpG oligonucleotide إلى تركيز 1 ملغ / مل.
- إعادة تشكيل CD40 ligand (CD40L) إلى تركيز 100 ميكروغرام / مل.
- إعادة تشكيل الإنسان المؤتلف IL-10 (rhIL-10) إلى تركيز ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مكن بروتوكول التوسع والتنشيط المحدث من التوسع السريع للخلايا B حتى 44 ضعفا في 7 أيام(الشكل 1؛ n = 3 الجهات المانحة). في تجربة KO، أظهر عدد الخلايا B باستخدام تلطيخ تريبان الأزرق أكثر من 80٪ خلايا قابلة للحياة مع انخفاض طفيف في استعادة الخلايا في كل من التحكم وعينات CD19 KO عند 24 ساعة بعد الكهرومporation(الشكل 2A؛ p ≥ 0.05، n = 3 المتبرعين). تشير هذه النتيجة إلى أن الكهرومporation أثر بشكل طفيف على صحة الخلية B بشكل عام. تم جمع الخلايا B في اليوم 5 بعد العدوى لق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد تم هندسة الجينوم دقيقة في الخلايا B البشرية الأولية تحديا حتى وقت قريب9،10. كنا قد نشرت سابقا بروتوكولات باستخدام CRISPR / Cas9 لهندسة الخلايا B البشريةالأولية 9. هنا ، نوضح البروتوكولات المحسنة لعزل الخلايا B ، والتوسع ، والهندسة للسماح بكفاءة KO من CD19 أو لضرب في EGFP.
هنا نحن نثبت أن لدينا بروتوكول التوسع يسمح التوسع السريع للخلايا B في الثقافة لمدة تصل إلى 44 أضعاف التوسع في 7 أيام
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تم إيداع براءة اختراع حول طرق صنع واستخدام خلايا B المحررة من الجينوم مع M.J.J. و K.L. و B.S.M كمخترعين. B.S.M هو مستشار ويملك الأسهم في شركة Immusoft شركة Immusoft رعت البحوث في مختبر B.S.M.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق أبحاث سرطان الأطفال (CCRF) والمعاهد الوطنية للصحة R01 AI146009 إلى B.S.M.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| يتوفر أيضا Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3 البروتين ، 500 ug | IDT | 1081059 | حجم أصغر |
| Amaxa P3 خلية أولية 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza | V4XP-3032 | ||
| الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) | جودة بيولوجية | 118-156-101 | |
| CleanCap معدل كيميائيا Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 مجم | Invivogen | TLRL-2006-5 | أحجام مختلفة |
| متوفرة Cryostor CS10 ، 100 مل | تقنية STEMCELL | 7930 | |
| CTS خلية مناعية SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep طقم عزل الخلايا البائية البشرية | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience صبغة قابلة للإصلاح eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media ، Xeno-free | R& D Systems | CCM031 | الخلية البائية المتوسطة |
| فالكون 14 مل من مادة البولي بروبيلين أنبوب دائري | كورنينج | 352059 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | R & D Systems | S11550 | لإذابة الخلايا البائية فقط |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip & reg ؛ 8 شرائط 0.2 مل أنابيب PCR مع أغطية قبة فردية متصلة | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (بدون Ca ، لا Mg) أو 1x PBS | GE علوم | الحياة SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector الوحدة الأساسية | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X وحدة | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | لتجميد الخلايا |
| Pen / Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP مضاد للإنسان CD19 استنساخ HIB19 | biolegend | يتوفر أيضا 302228 | الحجم الأصغر |
| rAAV6 SA-GFP (مع كاسيت SA-GFP الخاص بنا ، انظر الشكل 4.) | Vigene Biosciences | N / A | عبوة واسعة النطاق ، 1e13 GC / مل ، 500 مل |
| بروتين IL-10 البشري المؤتلف 250 ug | R & D Systems | 217-IL-250 | أحجام مختلفة متوفرة |
| بروتين IL-15 البشري المؤتلف 25 ug | R & تتوفر أحجام مختلفة من D Systems | 247-ILB-025 | |
| تقنية STEMCELL ذات الحجم الكبير السهل EasySep | Magnet 18001 | أحجام مختلفة متوفرة | |
| من Tris-EDTA (TE) | Fisher Scientific | BP2476100 |
المراجع
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka,....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
