ذبابة الرمل (Phlebotomus باباتاسي) الجنين الميكروبيكشن ل CRISPR/Cas9 موتاجينيسيس

ملخص

يفصل هذا البروتوكول خطوات تكوين الحشرات المستهدف CRISPR/Cas9 في ذباب الرمل: جمع الأجنة، والحقن، وتربية الحشرات، وتحديد الهوية، فضلا عن اختيار الطفرات ذات الاهتمام.

الملخص

الذباب الرملي هو النواقل الطبيعية لأنواع الليشمانيا ، الطفيليات البروتوزوانية التي تنتج طيفا واسعا من الأعراض التي تتراوح بين الآفات الجلدية إلى علم الأمراض الحشوي. فك طبيعة التفاعلات ناقلات / الطفيلي هو ذات أهمية أساسية لفهم أفضل لانتقال الليشمانيا إلى مضيفيهم. ومن بين البارامترات التي تتحكم في كفاءة ناقلات ذبابة الرمل (أي قدرتها على حمل مسببات الأمراض ونقلها)، تبين أن البارامترات المتأصلة في هذه الحشرات تلعب دورا رئيسيا. الاستجابة المناعية للحشرات ، على سبيل المثال ، تؤثر على كفاءة ناقلات ذبابة الرمل إلى الليشمانيا. وكانت دراسة هذه المعلمات محدودة بسبب عدم وجود أساليب لتعديل التعبير الجيني مكيفة للاستخدام في هذه الكائنات غير النموذجية. التنظيم الجيني من قبل الجيش الملكي النيبالي التدخل الصغيرة (siRNA) ممكن، ولكن بالإضافة إلى كونها صعبة من الناحية الفنية، وإسكات يؤدي إلى فقدان جزئي فقط للوظيفة، والتي لا يمكن أن تنتقل من جيل إلى جيل. تم مؤخرا تكييف mutagenesis المستهدفة من قبل التكنولوجيا CRISPR / Cas9 لذبابة الرمال Phlebotomus papatasi. تؤدي هذه التقنية إلى توليد طفرات قابلة للإنتهاك في مكان تم اختياره خصيصا ، مما يسمح بدراسة الجينات ذات الاهتمام. يعتمد نظام CRISPR/Cas9 على تحريض فواصل الحمض النووي المزدوجة المستهدفة ، التي تم إصلاحها لاحقا إما عن طريق الانضمام إلى النهاية غير المثلية (NHEJ) أو عن طريق إصلاح مدفوع بالهومولوجيا (HDR). يتكون NHEJ من إغلاق بسيط للكسر ويؤدي في كثير من الأحيان إلى أحداث الإدراج / الحذف الصغيرة. في المقابل ، يستخدم HDR وجود جزيء الحمض النووي المانح الذي يشارك علم الأوهام مع الحمض النووي المستهدف كنموذج للإصلاح. هنا ، نقدم طريقة التجميل الدقيق لجنين ذبابة الرمل للطفرات المستهدفة من قبل CRISPR / Cas9 باستخدام NHEJ ، وهي تقنية تعديل الجينوم الوحيدة المكيفة مع ناقلات ذبابة الرمل حتى الآن.

المقدمة

تشكل الأمراض المنقولة بالنواقل تهديدا رئيسيا للصحة العامة في تطور مستمر. مئات الأنواع الناقلة المنتشرة عبر أسر فيلوجينية متميزة جدا (مثل البعوض والقراد والبراغيث) هي المسؤولة عن انتقال عدد كبير من مسببات الأمراض الميكروبية، مما يؤدي إلى أكثر من 700،000 حالة وفاة بشرية سنويا، وفقا لمنظمة الصحة العالمية. ومن بين الحشرات الناقلة، يشكل ذباب الرمل البلوبوتومين (Diptera, Psychodidae) مجموعة واسعة، حيث يظهر 80 نوعا من ناقلات الأمراض المثبتة سمات وصفية وقدرات متجهية متميزة موجودة في مناطق جغرافية مختلفة. وهي ناقلات لطفيليات البروتوزوان من جنس الليشمانيا، مما تسبب في حوالي 1.3 مليون حالة جديدة من الليشمانيات وبين 20،000 و 30،000 حالة وفاة سنويا. نتائج الليشمانيات السر....

البروتوكول

تم استخدام الفئران كمصدر للدم لتغذية ذبابة الرمل وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبر للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه من NIAID ، المعاهد القومية للصحة (رقم البروتوكول LPD 68E). اللافقاريات غير مشمولة بالمبادئ التوجيهية للصحة القومية للصحة.

1. إعداد إبرة (الشكل 1)

1. سحب الإبر و شطبة كما هو موضح في موتي و هاريل¹⁹. لفترة وجيزة، وسحب الإبر على سحب الزجاج micropipette على مرحلة مزدوجة، وذلك باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية borosilicate.
2. شحذ الإبر عن طريق شطب الرطب على مجسم micropipette، وذلك باستخ....

النتائج

تم إنشاء بروتوكول CRISPR/Cas9 microinjection الموصوف هنا لتوليد طفرات ذبابة الرمل في منشور سابق⁴. وقد أدى هذا النهج إلى توليد طفرات عالية الكفاءة، حيث نجا 11 فردا من أصل 540 شخصا من هذا الإجراء، منهم 9 متحولين. عند تصميم أدلة لطفرة CRISPR/Cas9 ، فإن الخطوة الأولى الحرجة هي تسلسل المنطقة المحيطة بالمنطقة التي سيتم استهدافها. يجب أن يكون نموذج التسلسل من السلالة التي سيتم استخدامها كمصدر للأجنة للحقن. ومن الخطر الاعتماد فقط على تسلسل الجينوم المنشور لتصميم الأدلة. ليس من غير المألوف أن يكون هناك اخت.......

المناقشة

نحن نقدم هنا طريقة التلقيح الدقيق الجنين التي تم تطويرها مؤخرا لتولد الطفرات المستهدفة من قبل CRISPR / Cas9 في ذباب الرمال Phlebotomus papatasi. تم تطوير الميكرونجيكشن الجنيني للتعديل الوراثي للحشرات في دروسوفيلا في منتصف الثمانينيات²¹ ويستخدم الآن بشكل روتيني في مجموعة واسعة من الحشرات. تم تطوير طرق أخرى لتوصيل مواد التعديل الوراثي لاستخدامها في الحشرات ، مثل ReMOT^20و21و²²و

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ورق ترشيح أسود 4.25 سم PK100	VWR	28342-012	مقطعة إلى مستطيلات مقاس 46 × 22 مم تقريبا. يتم وضعها بين الشريحة والغطاء وتعمل كطبقة أساسية رطبة للأجنة أثناء الحقن.
Coverslips	Fisher Scientific	12-543A
تشريح المجهر	أي علامة تجارية		لمحاذاة الأجنة شرائح
زجاجية	Fisher Scientific	12-550-A3	الطبقة الأساسية من إعداد الحقن المجهري الشكل 2 أ
قفص حشرات	مخصص أو عدة خيارات		تجاريةقفص البولي كربونات للبالغين الذين يحملون وتزاوج محامي ، فيليب ، ميراي كيليك كندريك ، توبين رولاند ، إدغار روتون ، وبيتر فولف. “ الاستعمار المختبري والتربية الجماعية لذباب الرمل الفليبوتومين (Diptera ، Psychodidae)." الطفيلي 24. تم الوصول إليه في 6 أغسطس 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
طعام اليرقات	المخصص		مزيجا من طعام الأرانب وبراز الأرانب المحامي ، فيليب ، ميراي كيليك كندريك ، توبين رولاند ، إدغار روتون ، وبيتر فولف. " الاستعمار المختبري والتربية الجماعية لذباب الرمل الفليبوتومين (Diptera ، Psychodidae)." الطفيلي 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
مايكروكابس 100 مل	دروموند	1-000-1000	تستخدم لملء إبر الحقن المجهري
شفاط الفم	جون دبليو هوك شركة	موديل 612	شفاط الفم مع فلتر HEPA
أوليمبوس SZX12	علوم		المجهر الحقن
المجهري شركة Ovipots	Nalge		تصنع أوعية البيض من برطمانات بلولي بروبيلين ذات جوانب ضيقة سعة 125 مل أو 500 مل تم تعديلها عن طريق حفر ثقوب 2.5 سم في الأسفل ومليئة ب 1 سم من الجص في باريس. المحامي ، فيليب ، ميراي كيليك كندريك ، توبين رولاند ، إدغار روتون ، وبيتر فولف. “ الاستعمار المختبري والتربية الجماعية لذباب الرمل الفليبوتومين (Diptera ، Psychodidae)." الطفيلي 24. تم الوصول إليه في 6 أغسطس 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
فرشاة الطلاء 6-0	أي شركة توريد	فنية غير	مستخدمة لمحاذاة الأجنة
حمض البروبيونيك	سيجما ألدريتش	402907	عامل مضاد للفطريات
الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية	أدوات الدقة العالمية	1B100-3	تستخدم لصنع إبر الحقن المجهري
وحدة تحكم Trio-MPC100 و MP845 مناور	أدوات الحقن		و معالج دقيق

صنع أوليمبوس الحياة الدقيق