مقالة منهجية

تحديد شبه كمي لكثافة الخلايا العصبية الدوبامين في Substantia Nigra من نماذج القوارض باستخدام تحليل الصورة الآلي

DOI:

10.3791/62062

⸱

فبراير 2, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Krembil Research Institute, Toronto Western Hospital, University Health Network, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Department of Surgery, Division of Neurosurgery, University of Toronto, 4Department of Medicine, Division of Neurology, University of Toronto, 5Department of Medicine, Division of Neurology, Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease and the Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Clinic, Toronto Western Hospital, University Health Network, 6Tanz Centre for Research in Neurodegenerative Diseases, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم طريقة آلية لتحديد شبه كمي لعدد الخلايا العصبية الدوبامين في الجرذ substantia nigra pars compacta.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدير عدد الخلايا العصبية الدوبامين في نيجرا substantia هو وسيلة رئيسية في أبحاث مرض باركنسون قبل السريرية. وفي الوقت الراهن، فإن العد غير المتحيز للخلايا هو المعيار للقياس الكمي لهذه الخلايا، ولكنه لا يزال عملية شاقة وتستغرق وقتا طويلا، وقد لا تكون مجدية لجميع المشاريع. هنا، نقوم بوصف استخدام منصة تحليل الصور، والتي يمكنها تقدير كمية الخلايا المسماة بدقة في منطقة اهتمام محددة مسبقا. نحن نصف بروتوكول خطوة بخطوة لهذه الطريقة في التحليل في دماغ الفئران ونثبت أنه يمكن تحديد انخفاض كبير في الخلايا العصبية الإيجابية هيدروكسيلوز التيروزين بسبب التعبير عن متحولة α سينوكلين في نيجرا substantia. لقد صدقنا على هذه المنهجية من خلال المقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها من خلال التجسم غير المتحيز. معا, هذه الطريقة توفر عملية فعالة من حيث الوقت ودقيقة للكشف عن التغيرات في عدد الخلايا العصبية الدوبامين, وبالتالي مناسبة لتحديد كفاءة تأثير التدخلات على بقاء الخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض باركنسون (PD) هو اضطراب الحركة العصبية السائدة التي تتميز بوجود مجاميع البروتين التي تحتوي على α-سينوكلين (α-syn) والخسارة التفضيلية للخلايا العصبية الدوبامين في substantia nigra pars compacta (SNpc)1. يعد التحديد الكمي لعدد الخلايا العصبية الدوبامين جزءا حيويا من أبحاث PD لأنه يسمح بتقييم سلامة النظام النيغروستريتال ، وبالتالي ، مما يوفر نقطة نهاية مهمة لتقييم فعالية العلاجات المحتملة لتعديل المرض. حاليا، معيار القياس الكمي لعدد الخلية هو عد غير متحيزة stereological، والذي يستخدم ثنائي الأبعاد (2D) المقاطع العرضية من الأنسجة لتقدير السمات الحجمية في الهياكل ثلاثية الأبعاد (3D)2،3،4. تستخدم الأساليب الحديثة القائمة على التصميم إجراءات أخذ عينات عشوائية شاملة وتطبق بروتوكولات العد (المعروفة باسم المسابير) لتجنب القطع الأثرية المحتملة والأخطاء المنهجية ، مما يسمح بالكشف الموثوق عن الاختلافات أكبر قليلا فقط من الاختلاف بينالحيوانات 5. في حين أن علم الجسم يوفر أداة تحليلية قوية للدراسات النسيجية الحية ، إلا أنه يستغرق وقتا طويلا ، ويفترض إعداد عينات موحدة ، ويتطلب التحقق من الصحة في عدة خطوات ، والتي يمكن أن تؤثر على الكفاءة المطلوبة بشكل متزايد للتحقيق قبل السريرية.

إن التقدم التكنولوجي الحديث في العلوم الرقمية يجعل من الممكن اعتماد تطبيقات جديدة لتقييمات أكثر كفاءة لعلم الأمراض دون منظار مجسم ، مع تلبية الحاجة كبديل للتجسيم غير المتحيز. هذه الأساليب تزيد من السرعة ، والحد من الخطأ البشري ، وتحسين استنساخ التقنيات stereological6،7. هالو هي واحدة من هذه منصة تحليل الصور لتحليل الأنسجة الكمية في علم الأمراض الرقمية. وهو يتألف من مجموعة متنوعة من وحدات مختلفة وتقارير بيانات التعبير المورفولوجية ومتعددة الخلايا على أساس كل خلية على حدة عبر أقسام الأنسجة بأكملها باستخدام خوارزميات التعرف على الأنماط. تقيس وحدة FL النووية النووية الإيجابية المناعية لعلامات الفلورسنت في النواة أو السيتوبلازم. وهذا يسمح للإبلاغ عن عدد الخلايا الموجبة لكل علامة، ودرجة كثافة لكل خلية. يمكن تكييف الوحدة لتوفير أحجام الخلايا الفردية وقياسات الكثافة ، على الرغم من أن هذه الميزة ليست مطلوبة للقياس الكمي للخلايا العصبية الدوبامين.

والهدف من هذه الدراسة هو التحقق من هذه الطريقة مع نموذج الفئران الفيروسية التي تم التحقق من صحتها سابقا على أساس ناقلات α سين من التنكس العصبي nigral8,9,10. في هذا النموذج, الإنسان متحولة A53T α-syn وأعرب في SNpc عن طريق الحقن المجسمة من الفيروس المرتبطة أدينو الهجين النمط المصلي 1/2 (AAV1/2), مما أدى إلى تنكس عصبي كبير على مدى فترة 6 أسابيع. قد تكون SNpc غير المنضروبة ، في بعض الدراسات ، بمثابة مراقبة داخلية للجانب المحقون. أكثر شيوعا، يتم استخدام حقن ناقلات AAV فارغة (AAV-EV) في مجموعة مراقبة من الحيوانات كتحكم سلبي. نقدم دليل خطوة بخطوة لتقدير كثافة الخلايا العصبية الدوبامين المتبقية في SNpc حقن بعد 6 أسابيع باستخدام برنامج تحليل الصور الآلي (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان التابعة للشبكة الصحية الجامعية على جميع الإجراءات وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعها المجلس الكندي لرعاية الحيوان.

1. حقن مجسمة

  1. زوج منزل الكبار الإناث سبراغ دولي الفئران (250-280 غرام) في أقفاص مع الفراش الخشب والوصول إلى الإعلان ليب الغذاء والماء. الحفاظ على مستعمرة الحيوان في دورة العادية 12 ساعة ضوء / الظلام (أضواء على 06:30) مع درجة حرارة ثابتة والرطوبة.
  2. تنفيذ حقن مجسمة من جانب واحد من AAV مباشرة إلى SNPC على الجانب الأيمن من الدماغ (الجانب الأيمن أو الأيسر، وفقا لتفضيلات كل مختبر) كما هو موضح سابقا8،10. حقن 2 ميكرولتر من AAV1/2 في titer النهائي من 3.4 × 1012 الجسيمات الجينومية / مل.

2. تقزم الدماغ والكيمياء المناعية (IHC)

  1. تخدير الفئران مع 5٪ isoflurane عن طريق وضع في غرفة تخدير لمدة 3 دقائق. ويمكن استخدام أساليب أخرى معتمدة لهذه الخطوة بعد الاستعراض المؤسسي المناسب.
  2. بمجرد وصول الجرذ إلى مستوى جراحي من التخدير العميق ، قم بنقله إلى مخروط الأنف الملصق بقوة على طاولة التشريح. تأمين الجرذ الأمامية الكفوف باستخدام الشريط واستخدام إصبع القدم قرصة استجابة طريقة لتحديد عمق التخدير. يجب أن يكون الحيوان لا يستجيب قبل المتابعة.
  3. إجراء شق الجانبية تحت القص وقطع من خلال الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري لفضح تجويف الجنبي. رفع ومشبك القص مع hemostat ومكان فوق الرأس.
  4. المشبك القلب باستخدام ملقط وإدراج إبرة فراشة متصلة مضخة التغلغل في النهاية الخلفية للبطين الأيسر. Perfuse الفئران عبر القلب مع 150 مل من المالحة الهيبارين، أو حتى العينين والجلد واضحة. قد يفضل التخثر مع 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)، بدلا من المالحة، لتسهيل التثقيب المناعي مع أجسام مضادة معينة أو تقسيم الدماغ أرق.
  5. بمجرد اكتمال التشوه ، وقطع الرأس مع المقصلة واستخراج الدماغ إلى مصفوفة الدماغ ، والسطح البطني التي تواجه.
  6. باستخدام شفرة حلاقة جديدة، وجعل قطع في الطائرة التاجية 2 مم rostral إلى chiasm البصرية. الشريحة شفرة من جانب إلى آخر لتجنب تشويه الدماغ أثناء تشريح.
  7. تزج الجزء الخلفي من الدماغ في قارورة وصفت مسبقا تحتوي على ما يقرب من 20 مل من 4٪ PFA لمدة 48 ساعة من تثبيت ما بعد في درجة حرارة الغرفة. الجزء الأمامي من الدماغ قد يكون فلاش المجمدة في 2-ميثيلبوتان مبردة إلى -42 درجة مئوية قبل التخزين في -80 درجة مئوية.
  8. بعد 48 ساعة، نقل العقول الثابتة إلى قارورة المسمى تحتوي على 30٪ السكروز في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS) وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى تغرق (48-72 ساعة).
  9. إعداد microtome عن طريق وضع الجليد الجاف في الحوض الصغير من مرحلة العينة، تليها الإيثانول 100٪. مرة واحدة وقد بردت المرحلة، والضغط على درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) مركب على خشبة المسرح حتى يشكل دائرة 2 سم في القطر و 0.5 سم سميكة. بمجرد أن تجمد جزئيا ، قم بخفض الدماغ بعناية على تلة OCT ، مما يضمن بقاء سطح القطع المخطط موازيا للمرحلة.
  10. إضافة المزيد من الجليد الجاف إلى المرحلة لمساعدة الدماغ على تجميد. بمجرد أن يتحول الدماغ إلى لون كريم ، قم بمسح مرحلة الجليد الجاف.
  11. كزة حفرة في الجانب الأيمن من الدماغ مع إبرة 25G للتمييز بين نصفي الكرة الأرضية الأيمن والأيسار. الحرص على عدم تمرير الإبرة من خلال الهياكل التشريحية ذات الأهمية.
  12. قطع تسلسلي 40 مقطع μm في الطائرة التاجية ابتداء من bregma -3.8 وتنتهي في bregma -6.8.
  13. تخزين ستة سلسلة في أنابيب المسمى مع حل مضاد للتجميد (40٪ برنامج تلفزيوني، 30٪ 2-ethoxyethanol، 30٪ الجلسرين). يجب أن تحتوي كل سلسلة على 12 مقطعا في الدماغ.
  14. حدد مجموعة واحدة من المقاطع لتلطيخ المناعية الكيميائية، وغسل قبالة المضادة للتجميد الحل مع يغسل 3 × 10 دقيقة في 0.2٪ PBS-T.
  15. كتلة لمدة 1 ساعة في RT مع الجوز لطيف في حل حجب (10٪ مصل الماعز العادي (NGS)، 2٪ ألبوم مصل البقر (BSA) في 0.2٪ PBS-T). اتبع هذا مع الحضانة مع أرنب المضادة للتيروزين هيدروكسيلاز (TH) الأجسام المضادة (1:500) والفأر المضادة α سين الأجسام المضادة (1:500) في 2٪ NGS في 0.2٪ PBS-T بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  16. غسل الأجسام المضادة الأولية مع 3 × 5 دقيقة يغسل في 0.2٪ PBS-T، تليها 1 ح الحضانة مع الماعز المضادة للأرانب اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية (1:500) والماعز المضادة للفأرة اليكسا فلور 555 الأجسام المضادة الثانوية في 2٪ NGS في 0.2٪ PBS-T. تأكد من حماية المقاطع من الضوء والجوز بلطف.
  17. غسل الأجسام المضادة الثانوية مع يغسل 3 × 5 دقائق في 0.2٪ PBS-T وجبل مجموعة كاملة من المقاطع على الشرائح المحمية من الضوء والغبار باستخدام فرشاة الطلاء الضيقة. Coverslip مع مضان تصاعد المتوسطة وختم مع الورنيش الأظافر واضحة.

3. كونفوجكال المجهر والحصول على صورة

  1. التقاط صور IHC باستخدام البرامج إلى جانب المجهر confocal في التكبير 10x. فتح الثقب إلى 1.5 الاتحاد الافريقي لالتقاط طائرة واسعة يبلغ مجموعها ~ 1.5 ميكرومتر وتعيين التركيز على الجانب حقن من الدماغ.
  2. في علامة التبويب اكتساب، تحقق من خيار التصوير "مسح الإطارات المتجانبة" ثم قم بتعيين الأبعاد إلى 10 × 4.
  3. ضمن لوحة وضع الامتلاك، قم بتعيين التكبير/التصغير إلى 1.1. وهذا يساعد على تجنب أي علامات خياطة واضحة بين صور مسح البلاط.
  4. تعيين حجم الإطار إلى 1024 × 1024 بكسل ومتوسط إلى 2 لضمان الحصول على صورة عالية الجودة.
  5. في لوحة القنوات، حدد المسار 1 إلى Alexa488 وتتبع 2 إلى Alexa555.
  6. تحميل الشريحة على خشبة المسرح واختيار قسم مع تلطيخ TH قوية. انقر على لايف على لوحة الاستحواذ.
  7. في لوحة القنوات، قم بتعيين قوة الليزر وكسب إلى المستويات التي تزيد من الإشارة والحد من الضوضاء من الخلفية. استخدم مؤشر النطاق لضمان عدم تعريض الإشارات بشكل مفرط (كما هو مبين في تراكب أحمر داكن).
  8. كرر الخطوة أعلاه مع شرائح متعددة لضمان تلطيخ متناسقة بين الشرائح كما قوة الليزر / كسب لا يمكن تعديلها بين الشرائح.
  9. في علامة التبويب اكتساب، حدد المربع المواضع.
  10. عند هذه النقطة، كنت على استعداد لبدء التصوير. باستخدام العدسة، اختر القسم الأول الذي يظهر تلطيخ TH الإيجابي، وحدد التركيز عند نقطة الاهتمام (أي SNpc) ثم قم بنقل المرحلة إلى خط الوسط في القسم. وهذا يحفظ الموضع في محاور x و y و z وسيتم تصوير مسح التجانب التقاط المقطع بأكمله.
  11. كرر الخطوة المذكورة أعلاه لجميع الأقسام في جميع أنحاء SNpc إعطاء مجموعة كاملة من الصور من SNpc. إذا كان التحليل التفصيلي للجانب غير المصحح مطلوبا، يجب تكرار الخطوات من 3.10 إلى 3.11 عن طريق تعيين التركيز على الجانب غير المصحح.

4. تحليل الصورة والكمية

  1. ملفات صور منفصلة باستخدام البرامج المناسبة واستيراد ملفات الصور إلى برنامج تحليل الصور الآلي.
  2. حدد منطقة الاهتمام بتحديد أداة التعليق التوضيحي القلم لرسم تعليق توضيحي حول SNpc.
    ملاحظة: في المقاطع التي لديها كمية كبيرة من فقدان الخلايا العصبية الدوبامين, زيادة مؤقتا انبعاث / امتصاص يمكن أن تساعد على تحديد واضح لSNpc (الشكل 2).
  3. الانتقال إلى علامة التبويب تحليل ومن القائمة المنسدلة تحليل، حدد ضبط الوقت الحقيقي. يفتح هذا إطار منفصل على صورة المقطع يسمح بتعديل معلمات التحليل في الوقت الفعلي (الشكل 3).
  4. ضمن قسم تكبير التحليل، حدد تكبير الصورة المناسب.
  5. تحت قسم الكشف عن الخلايا، حدد الصبغة النووية كصبغة تستخدم لتلطيخ TH (اليكسا فلور 488).
  6. ضبط عتبة التباين النووي، الحد الأدنى من الكثافة النووية، العدوانية التقسيم النووي، وإعدادات الحجم النووي أثناء مراقبة بعناية نافذة ضبط الوقت الحقيقي.
    ملاحظة: تمثيل دقيقة لكل خلية فردية كخلية واحدة في إطار ضبط الوقت الحقيقي أمر حيوي للدقة. هذه الإعدادات على نطاق تعسفي اعتمادا على البرمجيات المستخدمة، ولكن هناك حاجة إلى تعديل صحيح للسماح للبرنامج للتمييز بدقة بين الخلايا الفردية، وبين الخلايا والخلفية (الشكل 3).
  7. كرر هذه العملية مع ما لا يقل عن 10 عينات منفصلة لضمان اتفاق موحد على ما يشكل خلية عبر أقسام مختلفة.
    ملاحظة: يمكن تحديد علامات خلايا إضافية (مثل α-syn أو NeuN) داخل نفس منصة التحليل باستخدام مقاطع علامة 1 أو علامة 2 في علامة التبويب التحليل.
  8. بمجرد أخذ عينات من عدد مناسب من الصور وتعديل الضبط في الوقت الفعلي وفقا لذلك، احفظ إعدادات التحليل في القائمة المنسدلة إجراءات الإعدادات.
  9. حدد جميع الصور التي سيتم تحليلها وانقر على تحليل.
  10. اختر إعداد التحليل الذي قمت بحفظه للتو، وفي إطار منطقة التحليل، حدد المربع طبقة(طبقات) التعليق التوضيحي. ثم، تحقق من الطبقة 1 وانقر على تحليل.
    ملاحظة: بالنسبة لدماغ واحد، يستغرق التحليل عادة حوالي 5 دقائق. ستظهر النتيجة المكتملة بوضوح كل عنصر تم احتسابه كخلية(الشكل 4).
  11. وبمجرد الانتهاء، قم بتصدير بيانات التحليل الموجز لجميع الأقسام. هناك خيار لتصدير بيانات تحليل الكائن، والتي ستعطي بيانات مفصلة ، بما في ذلك حجم الخلية لكل خلية على حدة تم اكتشافها. يمكن استخدام مجموعة البيانات هذه لفحص التغيرات في حجم الخلية استجابة للسموم / العلاجية.
  12. إضافة إجمالي الخلايا من كل قسم تحليل لكل والمنطقة تحليلها الكلي (مم2). تقسيم العدد الإجمالي للخلايا حسب المساحة الإجمالية التي تم تحليلها لحساب عدد الخلايا/مم2 في SNpc لكل فأر

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال تطبيق الأساليب المذكورة أعلاه على أنسجة الدماغ التي تم جمعها بعد 6 أسابيع من حقن AAV ، أظهرنا أن الحقن المجسم ل AAV الذي يعبر عن متحولة A53T α-syn (AAV-A53T) في SNpc من دماغ الفئران يؤدي إلى انخفاض كبير في كثافة الخلايا العصبية الدوبامين مقارنة بحقن ناقلات فارغة AAV (AAV-EV) كعنصر تحكم(الشكل 5A، B). وكان متوسط عدد الخلايا العصبية الإيجابية TH / مم2 في SNpc من الفئران حقنها مع AAV-EV 276.2 ± 34.7، وفي SNpc من الفئران حقنها مع AAV-A53T كان 41.2 ± 17 (P <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التقييم الموثوق لسلامة النظام الدوبامين في نماذج ما قبل السريرية من PD أمر بالغ الأهمية لتحديد فعالية العلاجات المحتملة تعديل المرض. لذلك، من المهم السيطرة على الإرباكات المحتملة التي قد تقلل من موثوقية البيانات الهستوبولوجية وإعادة إنتاجها وتقليلها. ويمكن أن توفر النتائج الكمية الدقيقة معلومات أكثر من الأوصاف النوعية أو شبه الكمية وحدها. وفي الوقت نفسه، يجب أن ندرك أن القيود في الوقت والموارد يمكن أن تجعل من الصعب إجراء عد غير متحيز للأمراض لكمية التغيرات المرضية أو فقدان الخلايا. ومع ذلك ، مع التقدم الأخير ، يمكن استيف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يبلغ المؤلفان عن أي مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يشكروا جميع العاملين في مرفق الفحص المجهري البصري المتقدم في الشبكة الصحية الجامعية على وقتهم ومساعدتهم في وضع هذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
A-Syn الأجسام المضادةThermoFisher Scientific32-8100
ABC EliteVector LabsPK-6102
Alexa Fluor 488 الجسم المضاد الثانويThermoFisher ScientificA-11008
Alexa Fluor 555 الجسم المضاد الثانويThermoFisher ScientificA-28180
القلوية المترافقة مع الفوسفاتيز المضادة للأرانب igGجاكسون Immuno111-055-144
Biotinylated المضادة للفأر IgGVector LabsBA-9200
مصل الأبقار الألبومينSigmaA2153
DAKO الفلورسنت mouting mediumAgilentS3023
HALO & trade ؛إنديكا
هيستو كلير IIثنائي الأبعادHS202
ImmPACT DAB مختبرات ناقلات الركيزةSK-4105
LSM880 مجهر متحد البؤرZeiss
NeuN الأجسام المضادةMilliporeMAB377
مختبرات ناقلاتمصل الماعز العاديS-1000-20
أكتوبرTissue-Tek
ParaformaldehydeBioShopPAR070.1
انزلاق ميكروتومLeicaSM2010 R
محقق ستيريوMBF علم
السكروزBioShopSUC700
TH الأجسام المضادةThermoFisher ScientificP21962
VectaMount تصاعد وسطVector LabsH-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase SubstrateVector LabsSK-5300
Zen Black SoftwareZeiss
Zen BlueSoftware Zeiss
مختبرات بيروكسيداز حيوي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  2. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
  3. Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  4. Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196(2015).
  5. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  6. Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
  7. Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68(2017).
  8. Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43(2010).
  9. Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson's disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698(2011).
  10. McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17(2020).
  11. Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
  12. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11(2017).
  13. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Dopaminergic Neuron DensitySubstantia NigraAutomated Image AnalysisParkinson s DiseaseTyrosine Hydroxylase StainingConfocal MicroscopyUnbiased StereologyCell DetectionRodent BrainAlpha Synuclein

مقالات ذات صلة