هنا هو إجراء للتعبير عن وتنقية الميوزين 5a تليها مناقشة توصيفه، وذلك باستخدام كل من الفرقة وجزيء واحد في المختبر مضان المقايسات المستندة إلى المجهر، وكيف يمكن تعديل هذه الأساليب لوصف غير عضلة ميوسين 2b.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بروتينات الميسين ربط والتفاعل مع أكتين خيوط (F-أكتين) وتوجد في الكائنات الحية عبر شجرة phylogenetic. يتم تكييف بنيتها وخصائصها الأنزيمية للوظيفة الخاصة التي تنفذها في الخلايا. Myosin 5a يمشي بشكل عملي على F-actin لنقل الميلانوسومات والحويصلات في الخلايا. وعلى العكس من ذلك، يعمل الميوسين غير العضلي 2b كخيوط ثنائية القطب تحتوي على ما يقرب من 30 جزيء. يتحرك F-actin من القطبية المعاكس نحو وسط خيوط، حيث جزيئات الميوسين تعمل بشكل غير متزامن لربط أكتين، ونقل السكتة الدماغية السلطة، وتفكك قبل تكرار الدورة. غير عضلة ميوزين 2B، جنبا إلى جنب مع غيرها من الميوزين 2 isoforms غير عضلة، والأدوار التي تشمل الالتصاق الخلية، السيتوكينيس، وصيانة التوتر. يمكن دراسة قياس الميوسينيز عن طريق إجراء فحوصات الحركة المختبرية باستخدام البروتينات المنقى. في مقايسة خيوط أكتين المزلقة ، ترتبط الميوسين بسطح غطاء المجهر وتناسل الفلورسنت المسمى F-actin ، والذي يمكن تتبعه. في جزيء واحد / فرقة المقايسة الحركة، ومع ذلك، لا بد F-actin إلى coverlip ويلاحظ حركة جزيئات الميوسين المسمى الفلورسنت على F-actin. في هذا التقرير، يتم تحديد تنقية الميوسين المؤتلف 5a من خلايا Sf9 باستخدام الكروماتوغرافيا التقاربية. بعد ذلك ، نحدد اثنين من المقايسات المستندة إلى المجهر الفلوري: المقايسة خيوط actin المزلقة ونقس الحركة المقلوب. من هذه المقايسات، يمكن استخراج معلمات مثل سرعات نقل أكتين وأطوال وسرعات تشغيل جزيء واحد باستخدام برنامج تحليل الصور. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنيات لدراسة حركة خيوط واحدة من الميوزين غير العضلي 2 isoforms، التي نوقشت هنا في سياق 2B ميوسين غير عضلي. يمثل سير العمل هذا بروتوكولا ومجموعة من الأدوات الكمية التي يمكن استخدامها لدراسة جزيء واحد وديناميكيات الفرقة من الميوسين غير العضلي.
المقدمة
الميوسين هي البروتينات الحركية التي تمارس القوة على خيوط أكتين باستخدام الطاقة المستمدة من التحلل المائي الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)1. Myosins تحتوي على الرأس والرقبة ، والذيل المجال. يحتوي مجال الرأس على منطقة ربط أكتين بالإضافة إلى موقع ربط ATP والتحلل المائي. وتتكون مجالات الرقبة من الزخارف IQ، والتي ترتبط سلاسل الضوء، كالمودولين، أو كالمودولين مثل البروتينات2،3. منطقة الذيل لديها العديد من الوظائف المحددة لكل فئة من الميوسين، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر إلى تضاؤل سلسلتين ثقيلتين، وربط جزيئات البضائع، وتنظيم الميوسين عن طريق التفاعلات الأوتينهيبيتورية مع نطاقات الرأس
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تنقية البروتين
- تحلل الخلايا واستخراج البروتين
- إعداد مخزن استخراج 1.5x استنادا إلى الجدول 1. تصفية وتخزين عند 4 °C.
- بدء ذوبان الكريات الخلية على الجليد. بينما الكريات هي ذوبان الجليد, تكملة 100 مل من استخراج العازلة مع 1.2 m M dithiothreitol (DTT), 5 ميكروغرام / مل ليوبيتين, 0.5 ميكرومتر فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) واثنين من أقراص مثبطة البروتيز. ابق على الجليد.
- بمجرد ذوبان بيليه، إضافة 1 مل من المخزن المؤقت استخراج تكملة لكل 10 مل من ثقافة الخلية. على سبيل المثال، إذا تشكلت الكريات الخلية من 500 مل من ثقافة الخلية، ثم إضافة 50 مل من ملحق استخراج العازلة إلى بيليه.
- Sonicate الكريات الخلية مع ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تنقية الميوسين يمكن تقييمها عن طريق أداء الحد من الصوديوم دودسيل كبريتات-بولياكريلاميد (SDS-PAGE) هلام-electrophoresis كما هو موضح في الشكل 2. في حين أن هذا الرقم يمثل الميسين النهائي ، بعد dialyzed ، يمكن إجراء SDS-PAGE على aliquots من مختلف مراحل إجراء التطهير لتحديد أي منتجات فقدت للناموست. Myosin 5a HMM لديه فرقة في نطاق 120-130 kDa وكامل طول myosin 2b غيرmuscle لديه الفرقة في نطاق 200-230 kDa، المقابلة لسلاسل ثقيلة29،44. و5a myo.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا هو سير العمل لتنقية وتوصيف في المختبر من 5a ميوزين و2b غير عضلة ميوسين. هذه المجموعة من التجارب مفيدة لتحديد الخصائص الميكانيكية الكيميائية لبنى الميوسين المنقى بطريقة سريعة وقابلة للاستنساخ. على الرغم من أن اثنين من الميوسين هو مبين هنا ليست سوى مثالين محددين من بين العديد من الاحتمالات، يمكن تطبيق الشروط والتقنيات، مع بعض الخياطة، لمعظم الميوسين والعديد من البروتينات الحركية الأخرى.
تخضع البروتوكولات التي تمت مناقشتها هنا لاختلافات اعتمادا على الاحتياجات الفردية للمختبر والتجارب. على سبي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونشكر الدكتور فانغ زانغ على المساعدة التقنية في إعداد الكواشف المستخدمة لجمع هذه البيانات. تم دعم هذا العمل من قبل NHLBI / NIH صندوق برنامج البحوث داخل الجافية HL001786 إلى J.R.S.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>1 مل حقنة< / قوي> | دينار بحريني | 309628 | |
| <قوي>2< / قوي> M CaCl2 < / sub>Solution | VWR | 10128-558 | |
| 2 M MgCl< / strong>2 < / sub>Solution | VWR | 10128-298 | |
| 27 مقياس إبرة< / قوي> | بكتون ديكنسون | 309623 | |
| <قوي > 5 م محلول كلوريد الصوديوم < / قوي > | دينار كويتي طبي | RGE-3270 | |
| <قوي > حمض الخليك < / قوي > | ThermoFisher Scientific | 984303 | |
| <قوي > أسيتات أميل < / قوي > | لاد للصناعات البحثية | 10825 | |
| < قوي > مضاد للعلم M2 هلام تقارب < / قوي > | ميليبور سيجما | A2220 | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf |
| <قوي>ATP | Millipore Sigma | A7699 | |
| <قوي>بيوتينيلated G-Actin | Cytoskeleton، Inc. | AB07 | |
| <قوي>ألبومين مصل البقر< قوي> | Millipore Sigma | 5470 | |
| bPEG-silane | Laysan Bio، Inc | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Bradford Recode Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calmodulin | PMID: 2985564 | ||
| <قوي > كاتالاز < / قوي > | Millipore Sigma | C40 | |
| < قوي > خط خلية (Sf9) في SF-900 II SFM < / strong > ThermoFisher | Scientific | 11496015 | http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf |
| <قوي > ورق ترشيح دائري - فحص انزلاقي < / قوي> | Millipore Sigma | WHA1001125 | |
| ورق ترشيح دائري <قوي > - مقايسة مقلوبة < / قوي > | Millipore Sigma | WHA1001090 | |
| قوية > cOmplete ، خالية من EDTA < / قوية > | Millipore Sigma | 5056489001 | يجب تخزين هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يمكن استخدام الأقراص مباشرة أو يمكن إعادة تكوينها كمحلول مخزون 25x عن طريق إذابة قرص واحد في 2 مل من الماء المقطر. يمكن تخزين المحلول الناتج عند 4 درجات ؛ C لمدة 1-2 أسابيع أو 12 أسبوعا على الأقل عند -20 درجة مئوية |
| <أنابيب مركزة قوية > (100,000 MWCO) < / قوية > | EMD شركة Millipore | UFC910024 | MWCO للأنبوب ليس بالضرورة "مقاس واحد يناسب الجميع" ، طالما أن MWCO أقل من الوزن الجزيئي الكلي للبروتين الذي يتم تنقيه. تم تركيز NM2b هنا بأنبوب 100,000 MWCO وتم تركيز M5a بأنبوب 30,000 MWCO. |
| <قوي>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye< / strong> | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Coverslip Rack< / strong> | Millipore Sigma | Z688568-1EA | |
| Coverslips: فحص خيوط التمثيل المنزلق < / strong> | VWR International | 48366-227 | |
| Coverslips: فحص الحركة المقلوب < / قوي> | أنابيب غسيل الكلى Azer Scientific | ES0107052 | |
| (3500 Dalton MCWO)< / strong> | Fischer Scientific | 08-670-5A | يمكن أن يختلف قطر أنبوب غسيل الكلى ، ولكن يجب أن يكون MWCO هو نفسه. تم غسيل الكلى NM2b المستخدم هنا في أنبوب غسيل الكلى 18 مم. يمكن تخزين الأنابيب في محلول كحول بنسبة 20٪ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| <قوي>DL-Dithiothreitol< / strong> | Millipore Sigma | D0632 | |
| Double-Sided Tape | Office Depot | 909955 | |
| DYKDDDDK Peptide | GenScript | RP10586 | يمكن إذابة هذا في مخزن مؤقت يحتوي على 0.1 M كلوريد الصوديوم ، 0.1 ملي مولار EGTA ، 3 ملي مولار NaN3< / sub> ، و 10 ملي مولار MOPS (درجة الحموضة 7.2) إلى تركيز نهائي يبلغ 50 مجم / مل. يمكن تخزين هذا عند -20 درجة ؛ C مثل 300 & L aliquots. |
| <قوي>EGTA< / قوي> | Millipore Sigma | E4378 | |
| Elution Column< / strong> | Bio-Rad | 761-1550 | يمكن إعادة استخدامها. للتنظيف ، اشطف العمود بأحجام 2-3 أعمدة من PBS والماء المقطر. برد العمود عند 4 درجات ؛ ج قبل الاستخدام. |
| <قوي>الإيثانولفيشر | العلمي | A4094 | |
| <قوي>G-أكتين | PMID: | يمكن تخزين مخزون 4254541 G-actin في 200 مو ؛ M في السائل N2. | |
| <قوي>الجلوكوز< قوي> | ميليبور سيجما | G8270< | |
| قوي>الجلوكوز أوكسيديز | ميليبور سيجما | G2133< | |
| قوي>محلول عازلة جلايسين ، 100 ملم ، درجة الحموضة 2-2.5 ، 1 لتر < / قوي > | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-295018 | |
| HaloTag< / strong> | Promega | G100A | |
| <قوي> حمض الهيدروكلوريك < / قوي> | ميليبور سيجما | 320331< | |
| قوي>KCl< / قوي> | فيشر العلمي | P217-500< | |
| قوي> رؤوس ماصة ذات فتحة كبيرة< / قوي> | فيشر Scientific | 02-707-134 | |
| <قوي>مثبط بروتياز ليوببتين< قوي> | ثيرموفيشر العلمي | 78435 | |
| سلم قياسي <قوي>Mark12 غير ملوث< قوي> | ThermoFisher Scientific | LC5677 | |
| Methanol< / strong> | Millipore Sigma | MX0482 | |
| Methylcellulose< / strong> | Millipore Sigma | M0512 | |
| Microscope Slides< / strong> | Fischer Scientific | 12-553-10 | |
| <قوي>مماسح < / قوي> | فيشر العلمي | BP308-100 | |
| mPEG-silane | Laysan Bio, Inc | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Myosin Light Chain Kinase | PMID: يمكن تنقية | MLCK 23148220 الموسومة بعلامة FLAG بنفس الطريقة التي تم بها تنقية الميوسين الموسوم بعلامة FLAG هنا. | |
| <قوي>NaN3< / sub>< / strong> | Millipore Sigma | S8032 | |
| NeutrAvidin< / strong> | ThermoFisher Scientific | 31050 | |
| Nitrocellulose< / strong> | Ladd Research Industries | 10800 | |
| NuPAGE 4 إلى 12٪ Bis-Tris Mini Protein Gel ، 15 جيدا < / قويا > | ThermoFisher عازلة عينة علمية | NP0323PK2 | |
| <قوية>NuPAGE LDS (4X) < / قوي> ThermoFisher | Scientific | NP0007 | |
| <قوي > محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4< / قوي> | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| PMSF< / strong> | Millipore Sigma | 78830 | يمكن صنع PMSF كمحلول مخزون 0.1 متر في الأيزوبروبانول وتخزينه في 4 درجات مئوية. تؤدي إضافة الأيزوبروبانول إلى ترسيب بلوري ، والذي يمكن إذابته عن طريق التقليب في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام مباشرة ، يمكن إضافة PMSF بالتنقيط إلى محلول سريع التحريك إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1 مليمتر. |
| <قوية >شفرات الحلاقة< قوية > | مستودع مكتب | 397492 | |
| <قوي> الرودامين-فالويدين< / قوي> | ThermoFisher Scientific | R415 | في 100٪ من الميثانول إلى تركيز نهائي يبلغ 200 مو. |
| Sf9 Media< / strong> | ThermoFisher Scientific | 12658-027 | يجب تخزين هذا في 4 درجة مئوية. مدة صلاحيتها 18 شهرا من تاريخ التصنيع. |
| طبق ثقافة الأنسجة <قوي> - فحص الانزلاق< / القوي > | 353025 | يمكن أن يحتوي كل طبق لزراعة الأنسجة على ما يقرب من تسعة أغطية. | |
| طبق زراعة الأنسجة <قوي> - 353003 الفحص المقلوب < / قوي > | كورنينج | أن يحتوي كل طبق لزراعة الأنسجة على ما يقرب من أربعة أغطية. | |
| <قوي> على نحو سلس 200 & مايكرو; L نصائح الماصة< / قوي> | توماس Scientific | 1158U38 | |
| < قوي > المعدات < / قوي > | |||
| < قوي > جهاز طرد مركزي < / قوي > ThermoFisher | Scientific | 75006590 | |
| < قوي > المجهر < / قوي > | نيكون نموذج: Eclipse Ti مع نظام H-TIRF مع هدف 100x TIRF (NA 1.49) | ||
| <قوية >كاميرا مجهر< / قوية > | نموذج Andor | : كاميرا iXon DU888 EMCCD (تنسيق مستشعر 1024 × 1024) | |
| <قوي > مجهر صندوق التحكم البيئي < / قوي> | Tokai HIT | مخصص Thermobox | |
| < قوي > وحدة ليزر مجهر < / قوي > | نيكون | LU-n4 أربع وحدات ليزر مع ليزر الحالة الصلبة ل 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 640 نانومتر | |
| <قوي > منتصف مقاعد البدلاء الطرد المركزي < / قوي > | ThermoFisher النموذج العلمي | : CR3i | |
| < قوي > Misonix Sonicator < / قوي > | Misonix | XL2020 | |
| < قوي > Optima Max-XP جهاز طرد مركزي < / قوي > | بيكمان كولتر | 393315 | |
| < قوي > منظف البلازما < / قوي > | داينر الإلكترونية GmbH + Co. نظام KG | النوع: Zepto | |
| < قوي > مسبار سونيكاتور (3.2 مم) < / قوي > | Qsonica | 4418 | |
| <قوي > حاضنة قياسية < / قوي > | الموثق | نموذج: 56 | |
| < قوي > خلاط أنبوب ويفرلي < قوي > | ويفرلي | TR6E | |
| <قوي > برنامج < / قوي > | |||
| <قوي> ImageJ FIJI | https://imagej.net/Fiji/Downloads | ||
| FAST (الإصدار 1.01) | http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements | FAST متاح للأنظمة المستندة إلى Mac OSX و Linux. | |
| البرنامج المساعد <قوي > مثبت الصور < / قوي > | https://imagej.net/Image_Stabilizer | ||
| <قوي> ImageJ TrackMate < / قوي > | https://imagej.net/TrackMate | ||
| < قوي > برنامج التصوير < / عناصر قوية > | NIS (حزمة AR) | ||
| http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html | |||
| https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md https://github.com/turalaksel/FASTrack File:TrackMate-manual.pdf | |||
المراجع
- Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
- Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
- Rhoads, A. R., Friedberg, ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
