Method Article

التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر

DOI:

10.3791/62180

⸱

February 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا هو إجراء للتعبير عن وتنقية الميوزين 5a تليها مناقشة توصيفه، وذلك باستخدام كل من الفرقة وجزيء واحد في المختبر مضان المقايسات المستندة إلى المجهر، وكيف يمكن تعديل هذه الأساليب لوصف غير عضلة ميوسين 2b.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتينات الميسين ربط والتفاعل مع أكتين خيوط (F-أكتين) وتوجد في الكائنات الحية عبر شجرة phylogenetic. يتم تكييف بنيتها وخصائصها الأنزيمية للوظيفة الخاصة التي تنفذها في الخلايا. Myosin 5a يمشي بشكل عملي على F-actin لنقل الميلانوسومات والحويصلات في الخلايا. وعلى العكس من ذلك، يعمل الميوسين غير العضلي 2b كخيوط ثنائية القطب تحتوي على ما يقرب من 30 جزيء. يتحرك F-actin من القطبية المعاكس نحو وسط خيوط، حيث جزيئات الميوسين تعمل بشكل غير متزامن لربط أكتين، ونقل السكتة الدماغية السلطة، وتفكك قبل تكرار الدورة. غير عضلة ميوزين 2B، جنبا إلى جنب مع غيرها من الميوزين 2 isoforms غير عضلة، والأدوار التي تشمل الالتصاق الخلية، السيتوكينيس، وصيانة التوتر. يمكن دراسة قياس الميوسينيز عن طريق إجراء فحوصات الحركة المختبرية باستخدام البروتينات المنقى. في مقايسة خيوط أكتين المزلقة ، ترتبط الميوسين بسطح غطاء المجهر وتناسل الفلورسنت المسمى F-actin ، والذي يمكن تتبعه. في جزيء واحد / فرقة المقايسة الحركة، ومع ذلك، لا بد F-actin إلى coverlip ويلاحظ حركة جزيئات الميوسين المسمى الفلورسنت على F-actin. في هذا التقرير، يتم تحديد تنقية الميوسين المؤتلف 5a من خلايا Sf9 باستخدام الكروماتوغرافيا التقاربية. بعد ذلك ، نحدد اثنين من المقايسات المستندة إلى المجهر الفلوري: المقايسة خيوط actin المزلقة ونقس الحركة المقلوب. من هذه المقايسات، يمكن استخراج معلمات مثل سرعات نقل أكتين وأطوال وسرعات تشغيل جزيء واحد باستخدام برنامج تحليل الصور. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنيات لدراسة حركة خيوط واحدة من الميوزين غير العضلي 2 isoforms، التي نوقشت هنا في سياق 2B ميوسين غير عضلي. يمثل سير العمل هذا بروتوكولا ومجموعة من الأدوات الكمية التي يمكن استخدامها لدراسة جزيء واحد وديناميكيات الفرقة من الميوسين غير العضلي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميوسين هي البروتينات الحركية التي تمارس القوة على خيوط أكتين باستخدام الطاقة المستمدة من التحلل المائي الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP)1. Myosins تحتوي على الرأس والرقبة ، والذيل المجال. يحتوي مجال الرأس على منطقة ربط أكتين بالإضافة إلى موقع ربط ATP والتحلل المائي. وتتكون مجالات الرقبة من الزخارف IQ، والتي ترتبط سلاسل الضوء، كالمودولين، أو كالمودولين مثل البروتينات2،3. منطقة الذيل لديها العديد من الوظائف المحددة لكل فئة من الميوسين، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر إلى تضاؤل سلسلتين ثقيلتين، وربط جزيئات البضائع، وتنظيم الميوسين عن طريق التفاعلات الأوتينهيبيتورية مع نطاقات الرأس1.

خصائص متحركة من الميوسين تختلف اختلافا كبيرا بين الطبقات. وتشمل بعض هذه الخصائص نسبة الواجب (جزء من دورة myosin الميكانيكية التي لا بد أن المايوسين actin) و processivity (قدرة المحرك على اتخاذ خطوات متعددة على مسارها قبل مفرزة)4. تم تحديد أكثر من 40 فئة من الميوسين على أساس تحليلات التسلسل5،6،7،8. تصنف المايوسينات من الفئة 2 على أنها "تقليدية" لأنها كانت أول من درس. جميع الطبقات الأخرى من الميوسين، لذلك، تصنف على أنها "غير تقليدية".

Myosin 5a (M5a) هو فئة 5 myosin وهو محرك معالجي ، مما يعني أنه يمكن أن يتخذ خطوات متعددة على طول actin قبل الانفصال. لديها نسبة واجب عالية، مما يدل على أنها تنفق جزءا كبيرا من دورتها الميكانيكية ملزمة actin9،10،11،12،13،14. على غرار الميوسينات الأخرى ، تحتوي السلسلة الثقيلة على مجال محرك N-terminal يتضمن كلا من ربط actin وموقع التحلل المائي ATP متبوعا بمنطقة الرقبة التي تعمل كذراع ذراع ، مع ستة زخارف IQ ترتبط بالسلاسل الخفيفة الأساسية (ELC) والكالمودولين (CaM)15. تحتوي منطقة الذيل على α-helical ملفوف-لفائف، والتي تغمغم جزيء، تليها منطقة ذيل كروي للشحن ملزمة. حركيته تعكس مشاركتها في نقل الميلانوسومات في الخلايا الصباغية و الشبكية endoplasmic في الخلايا العصبية Purkinje16,17. ويعتبر M5A نقل البضائع النموذجية المحرك18.

فئة 2 myosins، أو الميوسين التقليدية، وتشمل الميوسين أن تقلص الطاقة من الهيكل العظمي، والقلب، والعضلات الملساء بالإضافة إلى الميوزين غير العضلي 2 (NM2) isoforms، NM2a، 2B، و 2C19. وNM2 isoforms موجودة في السيتوبلازم لجميع الخلايا ولها أدوار مشتركة في السيتوكينيس، التصاق، مورفوجينيسيس الأنسجة، وهجرة الخلايا19،20،21،22. تناقش هذه الورقة بروتوكولات الميوسين التقليدية في سياق الميوزين غير العضلي 2b (NM2b)23. NM2b، بالمقارنة مع M5a، لديها نسبة واجب منخفض وأبطأ أنزيميا معماكس V من 0.2 ق-123 مقارنة ماكسV M5a من ≈18 ق-124. وتجدر الإشارة إلى أن بنيات NM2b المبتورة برأسين لا تتحرك بسهولة بشكل عملي على actin؛ بدلا من ذلك، كل لقاء مع actin النتائج في السكتة الدماغية السلطة تليها فصافر من جزيء25.

NM2b يحتوي على سلسلتين ثقيلتين myosin، كل مع مجال الرأس كروي واحد، واحد رافعة الذراع (مع ELC واحد وسلسلة ضوء تنظيمية واحدة (RLC)،)، وقضيب ملفوف α-helical-لفائف / المجال الذيل، ما يقرب من 1100 الأحماض الأمينية طويلة، أن يقلل من هذه السلسلتين الثقيلة. وينظم النشاط الأنزيمي والدولة الهيكلية من NM2b عن طريق الفوسفور من RLC23. NM2b unphosphorylated، في وجود ATP والقوة الأيونية الفسيولوجية (ما يقرب من 150 mM الملح)، ويعتمد تشكيل المدمجة حيث جعل الرأسين المشاركة في التفاعل غير المتماثل والذيل طيات مرة أخرى فوق رؤوس في مكانين23. في هذه الحالة، لا يتفاعل الميوسين بقوة مع أكتين ولديه نشاط أنزيمي منخفض جدا. على الفوسفور RLC بواسطة كيناز سلسلة ضوء الميوسين المعتمدة على كالمودولين (MLCK) أو كيناز البروتين المرتبط برو ، يمتد الجزيء ويرتبط مع الميوسينات الأخرى عبر منطقة الذيل لتشكيل خيوط ثنائية القطب من حوالي 30 جزيء ميوزين23. الفوسفور المذكورة أعلاه من RLC يؤدي أيضا إلى زيادة النشاط ATPase أكتين تنشيط NM2b من قبل ما يقرب من أربع مرات26،27،28. هذا الترتيب خيوط ثنائي القطب, يضم العديد من المحركات الميوسين في كل نهاية, هو الأمثل لأدوار في انكماش وصيانة التوتر, حيث يمكن نقل خيوط أكتين مع القطبية معارضة بالنسبة لبعضها البعض23,29. وبناء على ذلك، وقد ثبت NM2b لتكون بمثابة مجموعة من المحركات عند التفاعل مع أكتين. العدد الكبير من المحركات داخل هذه خيوط تسمح خيوط NM2b للتحرك بشكل عملي على خيوط أكتين، مما يجعل في عملية خيوط المختبر ممكن لتوصيف29.

في حين تم إحراز تقدم في فهم دور الميوسين في الخلية، هناك حاجة لفهم خصائصها الفردية على مستوى البروتين. لفهم تفاعلات أكتوميوسين على مستوى تفاعل بسيط بين البروتين والبروتين ، بدلا من داخل الخلية ، يمكننا التعبير عن وتنقية الميوسين المؤتلف للاستخدام في الدراسات المختبرية. نتائج مثل هذه الدراسات ثم إبلاغ علماء الأحياء الميكانيكية حول الخصائص الفيزيائية الحيوية من الميوسين محددة التي تدفع في نهاية المطاف العمليات الخلوية المعقدة12،13،14،25،29. عادة، يتم إنجاز ذلك عن طريق إضافة علامة تقارب إلى بناء myosin كامل الطول أو مبتورة وتنقية عبر الكروماتوغرافيا تقارب29،30،31. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن هندسة البناء ليشمل الفلوروفور القابل للتكويد وراثيا أو علامة لوضع العلامات على البروتين مع الفلوروفور الاصطناعي. عن طريق إضافة مثل هذه التسمية الفلورسنت، يمكن إجراء دراسات التصوير جزيء واحد لمراقبة ميكانيكا اليوسين والحركية.

بعد تنقية, يمكن أن تتميز الميسين في عدة طرق. ويمكن قياس النشاط ATPase من خلال أساليب colorimetric، وتوفير نظرة ثاقبة استهلاك الطاقة الشاملة وتقارب أكتين من المحرك تحت ظروف مختلفة32. لمعرفة المزيد عن التماثل الميكانيكي لحركيته ، هناك حاجة إلى مزيد من التجارب. تفصل هذه الورقة طريقتين في المختبر تعتمدان على المجهر الفلوري ويمكن استخدامهما لتوصيف الخصائص المتحركة لبروتين الميوسين المنقى.

أول هذه الطرق هو المقايسة خيوط أكتين المزلقة ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الخصائص الكمية لفرقة محركات الميوسين ، وكذلك دراسة جودة دفعة من البروتين النقي33. على الرغم من أن هذه الورقة تناقش استخدام المجهر الكلي الانعكاس الداخلي (TIRF) لهذا المقايسة، يمكن إجراء هذه التجارب بشكل فعال باستخدام مجهر مضان واسع المجال مجهز بكاميرا رقمية، توجد عادة في العديد من المختبرات34. في هذا المقايسة، يتم إرفاق طبقة مشبعة من محركات الميوسين إلى غطاء. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام النيتروسليلوز، والأجسام المضادة، والأغشية، SiO2-اشتقاق السطوح (مثل تريميثيلكلوروسيلين)، من بين أمور أخرى29،33،35،36،37،38. يتم تمرير خيوط أكتين المسمى Fluorescently من خلال غرفة coverslip ، التي يرتبط عليها actin إلى الميوسين المرفق بالسطح. عند إضافة ATP (وkinases في دراسة NM2) ، يتم تصوير الغرفة لمراقبة نقل خيوط الأكتين بواسطة الميوسين المرتبط بالسطح. تتبع البرمجيات يمكن استخدامها لربط سرعة وطول كل مزلق actin خيوط. يمكن أن توفر برامج التحليل أيضا مقياسا لعدد خيوط actin المتحركة والقرطاسية ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد جودة إعداد الميوسين المعطى. ويمكن أيضا أن تكون نسبة خيوط المتوقفة عمدا تحويرها الربط السطحي من أكتين إلى البروتينات الأخرى وقياسها لتحديد الاعتماد على تحميل من39الميوسين . لأن كل خيوط أكتين يمكن أن تدفعها عدد كبير من المحركات المتاحة، وهذا المقايسة قابلة للاستنساخ جدا، مع السرعة النهائية المقاسة يجري قوية للاضطرابات مثل التعديلات في تركيز الميوسين بدءا أو وجود عوامل إضافية في الحل. وهذا يعني أنه يمكن تعديلها بسهولة لدراسة نشاط الميوسين في ظل ظروف مختلفة، مثل الفوسفور المتغيرة، ودرجة الحرارة، والقوة الأيونية، و لزوجة الحل، وآثار الحمل الناجم عن الحبال السطحية. على الرغم من أن عوامل مثل الميسين قوية الربط "رؤساء القتلى" غير قادر على التحلل المائي ATP يمكن أن يسبب خيوط أكتين المتوقفة، توجد أساليب متعددة للتخفيف من هذه القضايا والسماح لقياسات دقيقة. خصائص الحركية من الميوسين تختلف اختلافا كبيرا عبر الطبقات، واعتمادا على الميسين محددة المستخدمة، وسرعة مزلق خيوط أكتين في هذا المقايسة يمكن أن تختلف من أقل من 20 نانومتر / ثانية (myosin 9)40،41،وحتى 60،000 نانومتر / ثانية (Characean myosin 11)42.

المقايسة الثانية عكس هندسة مزلق actin خيوط المقايسة12. هنا ، يتم إرفاق خيوط الأكتين بسطح الغطاء ويتم تصور حركة جزيئات واحدة من M5a أو خيوط ثنائية القطب فردية من NM2b. يمكن استخدام هذا المقايسة لتحديد أطوال وسرعات تشغيل جزيئات الميوسين المفردة أو خيوطها على actin. غطاء مغطى بمجمع كيميائي يمنع الربط غير المحدد ويميز السطح في نفس الوقت، مثل البيوتين البولي إيثيلين غليكول (البيوتين-PEG). إضافة مشتقات avidin المعدلة ثم يعبي السطح ويتم تمرير أكتين البيوتينات من خلال الغرفة، مما أدى إلى طبقة من F-actin ملزمة بشكل ثابت إلى أسفل الغرفة. وأخيرا، يتم تدفق الميوسين المنشط والمسمي بالفلورسنت (عادة 1-100 nM) من خلال الغرفة، والتي يتم تصويرها بعد ذلك لمراقبة حركة الميوسين فوق خيوط الأكتين الثابتة.

تمثل هذه الطرائق أساليب سريعة وقابلة للاستنساخ يمكن استخدامها لدراسة ديناميكيات كل من الميوسين غير العضلي والعضلات. يحدد هذا التقرير الإجراءات لتنقية وتوصيف كل من M5a و NM2b ، مما يمثل الميوسين غير التقليدي والتقليدي ، على التوالي. ويلي ذلك مناقشة لبعض التعديلات الخاصة بالميسين، والتي يمكن إجراؤها لتحقيق التقاط الحركة بنجاح في نوعي المقايسة.

التعبير والبيولوجيا الجزيئية
يجب استنساخ cDNA لmيوزين من الفائدة على ناقلات pFastBac1 المعدلة التي ترميز إما لC-محطة FLAG-tag (DYKDDDDK) إذا كان التعبير عن M5a-HMM, أو علامة FLAG N-المحطة إذا أعرب عن جزيء كامل الطول من NM2b23,43,44,45,46. C-محطة FLAG-العلامات على NM2b النتائج في تقارب ضعف البروتين للعمود العلم تقارب. في المقابل، البروتين N-terminally FLAG الموسومة عادة يربط جيدا إلى العمود العلم تقارب23. يحتفظ البروتين الموسوم بشكل نهائي بالنشاط الأنزيمي والنشاط الميكانيكي والتنظيم المعتمد على الفوسفور23.

في هذه الورقة، تم استخدام ماوس مبتور M5a meromyosin الثقيلة (HMM) مثل بناء مع GFP بين العلامة FLAG وC-terminus من سلسلة الميوزين الثقيلة. لاحظ أنه على عكس NM2b، يمكن وضع علامة على M5a-HMM بنجاح وتنقيته باستخدام علامات FLAG N-أو C-terminal وفي كلتا الحالتين سيكون البناء الناتج نشطا. تم اقتطاع سلسلة M5a الثقيلة في الأحماض الأمينية 1090 ويحتوي على ثلاثة وصلة الأحماض الأمينية (GCG) بين GFP ومنطقة ملفوف لفائف من M5a47. لم يتم إضافة رابط إضافي بين GFP و FLAG-tag. M5a-HMM شارك في التعبير مع كالمودولين. وقد شارك في التعبير عن بناء NM2b البشري الكامل الطول مع ELC و RLC. تم دمج N-termini من RLC مع GFP عبر رابط من خمسة أحماض أمينية (SGLRS). تعلق مباشرة إلى العلامة FLAG كان HaloTag. بين هالوتاغ والنهاء ن من سلسلة الميسين الثقيلة كان رابط مصنوع من اثنين من الأحماض الأمينية (AS).

تم تنقية كل من الاستعدادات الميوسين من لتر واحد من ثقافة الخلية Sf9 المصابة بفيروس baculo في كثافة حوالي 2 × 106 خلايا / مل. تعتمد أحجام الفيروس الكولو لكل وحدة فرعية على تعدد عدوى الفيروس كما تحددها تعليمات الشركة المصنعة. في حالة M5a ، كانت الخلايا مصابة بفيروسين باكولو مختلفين - واحد للكالمودولين ، وواحد لسلسلة M5a الثقيلة. في حالة NM2b ، كانت الخلايا مصابة بثلاثة فيروسات مختلفة - واحد ل ELC ، واحد ل RLC ، وواحد لسلسلة NM2b الثقيلة. للمختبرات التي تعمل مع مجموعة متنوعة من الميوسين (أو غيرها من البروتينات متعددة التعقيد)، وهذا النهج هو كفاءة لأنه يسمح للعديد من تركيبات من سلاسل الثقيلة والخفيفة والسلاسل الخفيفة المستخدمة عادة مثل كالمودولين يمكن أن تكون مشتركة مع العديد من سلاسل ثقيلة myosin مختلفة. تم الانتهاء من جميع أعمال الخلية في خزانة السلامة البيولوجية مع تقنية معقمة مناسبة لتجنب التلوث.

للتعبير عن كل من M5a و NM2b ، تم جمع خلايا Sf9 المنتجة للميوسين المؤتلف بعد يومين إلى 3 أيام من العدوى ، عن طريق الطرد المركزي ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم الحصول على الكريات الخلية عن طريق الطرد المركزي خلايا SF9 المصابة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 2800 × ز. يتم تفصيل عملية تنقية البروتين أدناه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنقية البروتين

  1. تحلل الخلايا واستخراج البروتين
    1. إعداد مخزن استخراج 1.5x استنادا إلى الجدول 1. تصفية وتخزين عند 4 °C.
    2. بدء ذوبان الكريات الخلية على الجليد. بينما الكريات هي ذوبان الجليد, تكملة 100 مل من استخراج العازلة مع 1.2 m M dithiothreitol (DTT), 5 ميكروغرام / مل ليوبيتين, 0.5 ميكرومتر فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) واثنين من أقراص مثبطة البروتيز. ابق على الجليد.
    3. بمجرد ذوبان بيليه، إضافة 1 مل من المخزن المؤقت استخراج تكملة لكل 10 مل من ثقافة الخلية. على سبيل المثال، إذا تشكلت الكريات الخلية من 500 مل من ثقافة الخلية، ثم إضافة 50 مل من ملحق استخراج العازلة إلى بيليه.
    4. Sonicate الكريات الخلية مع الاحتفاظ بها على الجليد. لكل بيليه، استخدم الشروط التالية: 5 ق ON، 5 ق OFF، مدة 5 دقائق، السلطة 4-5.
    5. جمع كل lysate متجانسة في كوب وإضافة ATP (0.1 M حل الأسهم؛ pH 7.0) بحيث التركيز النهائي من ATP هو 1 mM. يحرك المزيج لمدة 15 دقيقة في غرفة باردة. ينأى ATP الميسين النشط عن أكتين، مما يسمح بفصله في خطوة الطرد المركزي التالية. ولذلك، فمن الضروري المضي قدما إلى الخطوة التالية على الفور لتقليل إمكانية استنفاد ATP وإعادة ربط إلى actin.
    6. طرد مركزي للlysates في 48،000 × ز ل 1 ساعة في 4 درجة مئوية. في حين أن هذا يحدث، تبدأ غسل 1-5 مل من الطين 50٪ من راتنج تقارب مكافحة FLAG (لبيليه شكلت من 1 لتر من الخلايا) مع 100 مل الفوسفات العازلة المالحة (PBS)، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. على سبيل المثال، ل5 مل من الراتنج، اغسل 10 مل من الطين بنسبة 50٪. في خطوة الغسيل النهائية، إعادة إنفاق الراتنج مع 1-5 مل من برنامج تلفزيوني مع حجم كاف لخلق الطين 50٪.
    7. بعد الطرد المركزي lysate، والجمع بين supernatant مع الطين الراتنج غسلها والصخور بلطف في غرفة باردة لمدة 1-4 ساعة. أثناء الانتظار، قم بإجراء المخازن المؤقتة الموضحة في الجدول 1 وإبقائها على الجليد.
  2. إعداد تنقية تقارب FLAG
    1. الطرد المركزي الحل في الخطوة 1.7 في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. الراتنج سوف تكون معبأة في الجزء السفلي من الأنبوب. دون إزعاج الراتنج، وإزالة supernatant.
    2. إعادة إنفاق الراتنج في 50 مل من العازلة A كما هو مفصل في الجدول 1 والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. دون إزعاج الراتنج، وإزالة supernatant.
    3. إعادة إنفاق الراتنج في 50 مل من المخزن المؤقت B كما هو مفصل في الجدول 1 والطرد المركزي عند 500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى وإعادة إنفاق الراتنج في 20 مل من المخزن المؤقت B. ثم، مزيج الراتنج والعازلة جيدا عن طريق عكس بلطف أنبوب باليد ما يقرب من 10 مرات.
  3. البروتين الغبطة والتركيز
    1. جعل 30 مل من Elution العازلة كما هو موضح في الجدول 1 والسماح لها البرد على الجليد.
    2. إعداد عمود elution في غرفة باردة. صب بلطف الطين الراتنج في العمود. اغسل العمود بأحجام عمود 1-2 من Buffer B كما حزم الراتنج في الأسفل، مما يضمن عدم جفاف الراتنج.
    3. تدفق 1 مل من العازلة Elution من خلال الراتنج وجمع تدفق من خلال في أنبوب 1.5 مل. كرر ذلك بحيث يتم جمع 12، 1 مل كسور.
    4. عند هذه النقطة، إجراء اختبار برادفورد الخام على الكسور لتحديد نوعيا الكسور التي هي الأكثر تركيزا48. على صف واحد من لوحة 96 جيدا، ماصة 60 ميكرولتر 1x برادفورد كاشف. كما يتم جمع الكسور، مزيج 20 ميكرولتر من كل جزء لكل بئر. تلوين أزرق أغمق يشير إلى الكسور الأكثر تركيزا.
    5. في أنبوب 50 مل، وجمع البروتين المتبقية عن طريق pipetting بلطف المخزن المؤقت Elution المتبقية من خلال العمود، للافراج عن أي ميوزين المتبقية ملزمة الراتنج في تدفق العمود. وسيتركز هذا التدفق في الخطوة التالية. تأكد من أن الراتنج يتم تجديده لإعادة استخدامه وتخزينه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    6. تجمع الكسور الثلاثة الأكثر تركيزا وزيادة تركيز التدفق من خلال في أنبوب 50 مل، فضلا عن الكسور المتبقية 1 مل باستخدام أنبوب التركيز MWCO 100،000. قم بتحميل العينة المجمعة على أنبوب التركيز والطرد المركزي عند 750 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وكرر حتى يتم تركيز جميع البروتين المتبلور إلى حجم نهائي يبلغ حوالي 0.5-1 مل.
      ملاحظة: يسمح حجم المسام هذا بالاحتفاظ بجزيئات الميوسين ، التي تحتوي على كتل عدة أضعاف قطع الوزن الجزيئي. سلاسل الضوء لا تزال ملزمة بإحكام إلى المجالات الحركية خلال هذا الوقت من التركيز، كما تم التحقق من خلال أداء SDS-PAGE هلام electrophoresis على المنتج النهائي.
  4. غسيل الكلى وتجميد الفلاش
    1. جعل 2 L من المخزن المؤقت غسيل الكلى، كما هو موضح في الجدول 1. قم بتحميل العينة في كيس غسيل الكلى أو الغرفة و dialyze بين عشية وضحاها في الغرفة الباردة. لاحظ أن تكوين مخازن غسيل الكلى يختلف عن NM2b و M5a.
      ملاحظة: في حالة NM2b، الغرض من هذه الخطوة غسيل الكلى هو تشكيل خيوط myosin في العازلة قوة الأيونية منخفضة. ثم يوفر ترسيب هذه الخيوط خطوة تنقية إضافية ويسمح بتركيز العينة. لذلك، سيكون هناك عجل أبيض مرئي في غرفة غسيل الكلى في اليوم التالي. وسيتم جمع هذه الخيوط عن طريق الطرد المركزي وإزالة الطابعة في الخطوة 5-1. في حالة M5a-HMM ، بعد غسيل الكلى بين عشية وضحاها ، سيكون البروتين نقيا بما يكفي للاستخدام في المقايسات اللاحقة. يمكن تنفيذ المزيد من خطوات تنقية مثل الترشيح هلام أو الكروماتوغرافيا تبادل الأيونية، إذا لزم الأمر. للتعافي M5a بعد غسيل الكلى، انتقل إلى الخطوة 5.2.
  5. يتعافى الميسين بعد غسيل الكلى
    1. بالنسبة إلى NM2b، قم بتفريغ العينة بأكملها بعناية من كيس غسيل الكلى أو الغرفة والطرد المركزي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 49000 × ز لجمع خيوط الميوسين. تجاهل supernatant وإضافة التخزين المخزن المؤقت تدريجيا إلى بيليه كما هو موضح في الجدول 1 حتى يذوب. لطيف صعودا وهبوطا pipetting يساعد على تليين بيليه. عادة، وهذا لا يتطلب أكثر من 500 ميكرولتر لكل أنبوب. بعد التأكد من أن بيليه يذوب تماما في العازلة تخزين قوة الأيونية عالية، يمكن تنفيذ خطوة الطرد المركزي إضافية (15 دقيقة في 49،000 × ز) لإزالة المجاميع غير المرغوب فيها إذا لزم الأمر، لأن الميوسين الآن أن تكون غير مكتملة وستبقى في supernatant.
    2. بالنسبة إلى M5a-HMM، اجمع العينة بأكملها بعناية من غرفة غسيل الكلى والطرد المركزي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة عند 49000 × ز في حالة وجود أي مجاميع غير مرغوب فيها. خذ الناسخ الخارق
  6. تحديد التركيز وتجميد الفلاش
    1. لتحديد تركيز المنتج، قم بقياس الامتصاص باستخدام مطياف ضوئي عند الأطوال الموجية 260 و280 و290 و320 نانومتر. حساب التركيز في ملغم / مل (جملغ / مل) مع المعادلة 1, حيث يمثل A280 امتصاص في 280 نانومتر و A320 يمثل امتصاص في 320 نانومتر. يمكن تحويل التركيز الناتج في ملغم / مل إلى ميكرومتر من جزيئات الميوسين مع المعادلة 2، حيث M هو الوزن الجزيئي للبروتين بأكمله (بما في ذلك السلاسل الثقيلة والسلاسل الخفيفة والفلوروفوريس وجميع العلامات).
      جملغم / مل = (A280 - A320) / ε (1)
      جزيئات ميكرومتر = 1000cملغم/مل/م (2)
      ملاحظة: إذا كان تخفيف ضروري، ثم يجب أن يتم ذلك في عازلة قوة الأيونية عالية. يمكن تحديد معامل الانقراض (ε) عن طريق استيراد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين إلى برنامج مثل ExPASy. العائد النموذجي للM5a-HMM هو ما يقرب من 0.5-1 مل من البروتين 1-5 ملغم / مل وNM2b كامل الطول هو 0.5-1 مل من 0.5-2 ملغ / مل. معامل الانقراض ل M5a-HMM المستخدمة في هذه الورقة كان 0.671. معامل الانقراض لNM2b المستخدمة في هذه الورقة كان 0.611.
    2. تخزين الميوسين المنقى في واحدة من الطريقتين. Aliquot بين 10-20 ميكرولتر في أنبوب رقيقة الجدران، مثل أنبوب تفاعل سلسلة البلمرة، وإسقاط الأنبوب في وعاء من النيتروجين السائل لتجميد فلاش. بدلا من ذلك، ماصة مباشرة بين 20-25 ميكرولتر من الميوسين في النيتروجين السائل وتخزين الخرز المجمدة من البروتين في أنابيب التبريد العقيمة. وفي كلتا الحالتين، يمكن تخزين الأنابيب الناتجة في -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل للاستخدام في المستقبل.
      ملاحظة: منذ كل من المقايسات الحركة الموصوفة أدناه تتطلب كميات صغيرة جدا من البروتين، والتخزين في aliquots الصغيرة، كما هو موضح، هو اقتصادي.

2. مزلق actin خيوط المقايسة

  1. إعداد غطاء الغطاء
    1. جعل حل نيتروسيلولوس 1٪ في خلات أميل.
    2. احصل على طبق زراعة نسيج (150 × 25 مم) وأضف ورق فلتر دائري (قطره 125 مم) إلى أسفل الطبق.
    3. تحميل ثمانية رقم 1.5 سمك 22 مم coverslips مربع على رف ويغسل مع ما يقرب من 2-5 مل من الإيثانول 200 واقية تليها 2-5 مل من الماء المقطر (DH2O). كرر خطوة الغسيل هذه، وتنتهي بالماء. ثم، الجافة coverlips تماما باستخدام خط الهواء المصفاة أو N2-خط.
    4. تأخذ واحدة coverslip وماصة ببطء 10 ميكرولتر من محلول نيتروسيلولوس 1٪ على طول حافة واحدة من زلة. ثم، في حركة واحدة على نحو سلس، تشويه عبر بقية coverslip باستخدام الجانب من طرف ماصة 200 ميكرولتر على نحو سلس من جانب. وضع هذا coverslip على طبق زراعة الأنسجة مع الجانب النيتروسليلوز حتى. كرر للأغطية المتبقية والسماح لهم لتجف أثناء إعداد الكواشف المتبقية واستخدام coverlips في غضون 24 ساعة بعد الطلاء.
  2. إعداد الغرفة
    1. امسح شريحة المجهر بورق عدسة بصري لتنظيف الحطام الكبير. قطع قطعتين من الشريط على الوجهين، ما يقرب من 2 سم في الطول.
    2. ضع قطعة واحدة على طول منتصف الحافة الطويلة لشريحة المجهر. تأكد من محاذاة حافة الشريط مع حافة الشريحة. ضع القطعة الثانية من الشريط تقريبا 2 مم تحت القطعة الأولى من الشريط بحيث تكون متوازية ومتوائمة. وهذا يخلق غرفة تدفق التي يمكن أن تعقد ما يقرب من 10 ميكرولتر من الحل (انظر الشكل 1).
    3. خذ واحدة من الأغطية المغلفة بالنيتروسليلوز من الجزء 1. عصا بعناية coverslip على الشريط بحيث الجانب المغلفة مع nitrocellulose هو إجراء اتصال مباشر مع الشريط ، (انظر الشكل 1). باستخدام تلميح ماصة، اضغط برفق لأسفل على واجهة شريط الشرائح لضمان أن غطاء الغطاء قد التزم بشكل صحيح بالشريحة. قطع الشريط الزائد معلقة على حافة الشريحة مع شفرة حلاقة.
  3. إعداد أكتين
    1. جعل 20 ميكرومتر F-أكتين عن طريق البلمرة أكتين كروي (G-أكتين) في البلمرة العازلة (50 MM KCl, 2 م م MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (درجة الحموضة 7.0)) في 4 °C بين عشية وضحاها.
    2. تمييع F-actin إلى 5 ميكرومتر في العازلة الحركة (20 م MOPS, 5 م م MgCl2, 0.1 م EGTA, 1 mM DTT (درجة الحموضة 7.4)). تسمية مع ما لا يقل عن 1.2x الضرس الزائد من رودامين-phalloidin. ترك (مغطاة رقائق الألومنيوم) لمدة 2 ساعة على الأقل على الجليد. ويمكن استخدام هذا لمدة تصل إلى 1-2 أشهر، وتخزينها على الجليد.
  4. أداء الميوسين 5a مزلق actin خيوط المقايسة
    ملاحظة: في هذا القسم، يتم توفير تفاصيل الفحص المزلق myosin 5a (HMM).
    1. إعداد حلول ل 5a myosin الموصوفة في الجدول 2 والاحتفاظ بها على الجليد.
    2. تدفق في 10 ميكرولتر من 5A ميوزين (50-100 nM) من خلال غرفة التدفق وانتظر لمدة 1 دقيقة.
    3. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 ملغم / مل BSA في 50 ميجابايت مع 1 MM DTT ("الملح المنخفض" العازلة). كرر هذا الغسيل مرتين أخريين وانتظر لمدة دقيقة واحدة بعد الغسيل الثالث. استخدم ركن ورق الأنسجة أو ورق التصفية لتكتيل المحلول عبر القناة عن طريق وضع ركن الورق برفق عند مخرج غرفة التدفق.
    4. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    5. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول أكتين الأسود (5 ميكرومتر F-أكتين، 1 ميكرومتر كالمودولين، و 1 MM ATP في 50 ميجابايت مع 1 MM DTT) للقضاء على "رؤساء القتلى"، كما نوقش في قسم المناقشة.
      1. ماصة الحل مع حقنة 1 مل و 27 إبرة G لقص خيوط أكتين قبل إدخال الحل إلى الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين وانتظر دقيقة واحدة بعد المرة الثالثة. ما يقرب من 20 أحداث pipetting كافية.
      2. لأداء تدور "الرأس الميت" ، إضافة كمية من القياسات القياسية F -actin إلى ميوزين في وجود 1 MM ATP و 1 mM MgCl2 بتركيز ملحي قدره 500 mM. ثم أجهزة الطرد المركزي الفائق في 480،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. الميسين الميت سيكون في بيليه
    6. تدفق في 50 ميكرولتر من 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT و 1 MM ATP لاستنفاد غرفة خيوط أكتين الحرة.
    7. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين لاستنفاد غرفة أي ATP.
    8. تدفق في 10 ميكرولتر من 20 nM رودامين أكتين (Rh-Actin) حل يحتوي على 1 MM DTT في 50 م م م MB وانتظر لمدة 1 دقيقة للسماح لصرامة ملزمة من خيوط أكتين إلى 5a myosin تعلق على سطح coverlip.
    9. غسل مع 10 ميكرولتر من 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT لغسل خيوط Rh-Actin غير ملزمة إلى السطح. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    10. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي.
    11. تسجيل الصور على المجهر الفلوري باستخدام الطول الموجي الإثارة من 561 نانومتر لتصور Rh-Actin. وقت التعرض المناسب هو 200 مللي ثانية في 1.4 كيلوواط طاقة الليزر لمدة اقتناء مجموع 0.5-1 دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من أن معدل الاستحواذ يتم قياسه بشكل مناسب إلى سرعة خيوط الحركة. يعتبر معدل إطار الاستحواذ أحد الاعتبارات الهامة قبل جمع البيانات لاستخدامها مع برامج التتبع. ستؤدي حركات subpixel بين الإطارات إلى المبالغة في تقدير السرعة ، ويلزم حركات عدة مئات من النانومتر للحصول على قيم دقيقة. يتميز معدل الامتلاك الأمثل باقتناز actin لمسافة بكسل واحدة على الأقل بين الإطارات. في حالة المجهر TIRF المستخدمة للتصوير هنا، يترجم هذا عتبة إلى 130 نانومتر. لذلك، يجب تصوير الميوسين المتوقع أن يسافر 1 ميكرومتر/ثانية بمعدل 5 إطارات/ثانية (فاصل زمني 0.2 ثانية) لتحقيق 200 نانومتر من الحركة بينما يتطلب الميوسين المتوقع أن يسافر 10 نانومتر/ثانية 0.05 إطار/ثانية (فترات 20 ثانية). ولذلك يمكن تقليص البيانات في هذه المرحلة إذا لزم الأمر (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
  5. أداء غيرmuscle ميوزين 2b مزلق actin خيوط المقايسة
    ملاحظة: في هذا القسم، يتم توفير تفاصيل المقايسة مزلق myosin 2b كامل الطول. غيرmuscle myosin 2b مزلق actin خيوط بروتوكول المقايسة يختلف عن بروتوكول 5A myosin في خطوات معينة. تأكد من استخدام المخازن المؤقتة الصحيحة لكل من هذه الخطوات. على سبيل المثال، يتطلب الفحص NM2b مرفق من الميوسين إلى coverlip في المخزن المؤقت الملح عالية بينما يمكن إرفاق M5a إلى غطاء في مخازن الملح عالية أو منخفضة. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم مقايسة خيوط أكتين المزلق M5a تركيز أقل من الميسين للتخفيف من تكرار خيوط أكتين التي تتفكك أثناء الاستحواذ.
    1. إعداد حلول لNM2b كما هو موضح في الجدول 2 والاحتفاظ بها على الجليد.
    2. تدفق في 10 ميكرولتر من ميوسين غير عضلي 2b (0.2 ميكرومتر) في 500 متر موتورز العازلة (MB) ("الملح العالي" العازلة) و 1 م dithiothreitol (DTT) من خلال غرفة التدفق وانتظر لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: مخازن الملح العالية ينفصم خيوط الميوزين والسماح لمرفق جزيئات الميوسين واحد إلى السطح، كما يمكن أن يبوليمر ميوسين 2B غير عضلة في خيوط بتركيز أيوني <150 mM.
    3. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 ملغم / مل ألبوم مصل البقري (BSA) في 500 ميجابايت مع 1 MM DTT ("الملح العالي" العازلة) كما هو موضح في الجدول 2. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين وانتظر لمدة دقيقة واحدة بعد الغسيل الثالث. استخدم زاوية ورقة نسيج أو ورقة تصفية لتكتيل الحل من خلال القناة.
    4. غسل مع 10 ميكرولتر من 500 ميجابايت مع 1 MM DTT كما هو موضح في الجدول 2. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    5. تدفق في 10 ميكرولتر من حل أكتين السوداء على النحو المبين في الجدول 2 للقضاء على "رؤساء القتلى"، كما نوقش كذلك في قسم المناقشة. يحتوي محلول الأكتين الأسود على 5 ميكرومتر من F-actin غير المصنفة ، و 1-10 nM MLCK ، و 1 mM ATP ، و 0.2 m M CaCl2، و 1 μM CaM ، و 1 mM DTT في 50 m M NaCl العازلة للفوسفورات غير العضلية الميوسين 2b على سطح الغرفة.
      1. ماصة الحل مع حقنة 1 مل و 27 إبرة G لقص خيوط أكتين قبل إدخال الحل إلى الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين وانتظر دقيقة واحدة بعد المرة الثالثة. تقريبا، 20 أحداث pipetting كافية.
    6. تدفق في 50 ميكرولتر من 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT و 1 MM ATP لاستنفاد غرفة خيوط أكتين الحرة.
    7. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين لاستنفاد غرفة أي ATP.
    8. تدفق في 10 ميكرولتر من 20 nM Rh-Actin الحل الذي يحتوي على 1 MM DTT في 50 م MB وانتظر لمدة 1 دقيقة للسماح لصرامة ملزمة من خيوط أكتين إلى 2B ميوسين غير عضلي تعلق على سطح coverlip.
    9. غسل مع 10 ميكرولتر من 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT لغسل خيوط Rh-Actin غير ملزمة إلى السطح. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    10. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي. لغيرmuscle myosin 2b مزلق actin خيوط المقايسة، المخزن المؤقت النهائي يشمل أيضا كالمودولين، CaCl2،وسلسلة ضوء كيناز الميوسين لتوفير الفوسفور الكامل من 2B ميوسين nonmuscle أثناء التصوير بالفيديو. 0.7٪ ميثيلسليلوز يمكن أيضا أن تدرج في المخزن المؤقت النهائي إذا كانت خيوط أكتين مقيدة فقط فضفاضة أو ليست ملزمة إلى السطح. هذا هو مزيد من المناقشة في قسم المناقشة.
    11. تسجيل الصور على المجهر الفلوري باستخدام الطول الموجي للإثارة من 561 نانومتر. وقت التعرض المناسب هو 200 مللي ثانية في 1.4 كيلوواط طاقة الليزر لمدة اقتناء مجموع 0.5 -3دقيقة.
      ملاحظة: تأكد من أن معدل الاستحواذ يتم قياسه بشكل مناسب إلى سرعة خيوط الحركة. يعتبر معدل إطار الاستحواذ أحد الاعتبارات الهامة قبل جمع البيانات لاستخدامها مع برامج التتبع. ستؤدي حركات subpixel بين الإطارات إلى المبالغة في تقدير السرعة ، ويلزم حركات عدة مئات من النانومتر للحصول على قيم دقيقة. يتميز معدل الامتلاك الأمثل باقتناز actin لمسافة بكسل واحدة على الأقل بين الإطارات. في حالة المجهر TIRF المستخدمة للتصوير هنا، يترجم هذا عتبة إلى 130 نانومتر. لذلك، يجب تصوير الميوسين المتوقع أن يسافر 1 ميكرومتر/ثانية بمعدل 5 إطارات/ثانية (فاصل زمني 0.2 ثانية) لتحقيق 200 نانومتر من الحركة بينما يتطلب الميوسين المتوقع أن يسافر 10 نانومتر/ثانية 0.05 إطار/ثانية (فترات 20 ثانية). ولذلك يمكن أخذ عينات من البيانات في هذه المرحلة، إذا لزم الأمر (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).

3. جزيء واحد TIRF المقايسة

  1. إعداد غطاء الغطاء
    1. تقسيم مسحوق المخزون إلى 10 ملغ aliquots (في أنابيب 1.5 مل) من ميثوكسي-بيغ سيلان (mPEG) و 10 ملغ aliquots من البيوتين-بيغ-سيلان (bPEG). يخزن عند -20 درجة مئوية في حاوية مغلقة وخالية من الرطوبة ويستخدم في غضون 6 أشهر.
    2. تحميل ثمانية رقم 1.5H (عالية الدقة) سمك 22 ملم coverslips مربع على رف ويغسل مع 2-5 مل من الإيثانول 200 واقية تليها 2-5 مل من الماء المقطر. كرر خطوة الغسيل هذه، وتنتهي بالماء. ثم، وتجفيف الأغطية تماما باستخدام خط الهواء أو N2 والبلازما نظيفة مع الأرجون لمدة 3 دقائق.
    3. ضع الأغطية النظيفة على ورق الفلتر (90 مم) في طبق زراعة الأنسجة (100 × 20 مم) واحتضنها في فرن 70 درجة مئوية أثناء تنفيذ الخطوات التالية.
      ملاحظة: يمكن استبدال تنظيف البلازما مع طرق التنظيف الكيميائية الأخرى49.
    4. إعداد 80٪ حل الإيثانول مع DH2O وضبط درجة الحموضة إلى 2.0 باستخدام HCl. إضافة 1 مل من هذا إلى 10 ملغ aliquot من mPEG و 1 مل إلى 10 ملغ aliquot من bPEG. دوامة لتذوب، والتي لا ينبغي أن يستغرق أكثر من 30 ثانية.
    5. خذ 100 ميكرولتر من محلول bPEG وأضف 900 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ (درجة الحموضة 2.0). هذا الحل هو 1 ملغم/ مل bPEG. ثم، وجعل حل كل من PEGs على النحو التالي، والاختلاط بدقة.
      1. 200 ميكرولتر من 10 ملغم/مل من المليغرام (التركيز النهائي: 2 ملغم/مل).
      2. 10 ميكرولتر من 1 ملغم/مل bPEG (التركيز النهائي: 10 ميكروغرام/مل).
      3. 790 ميكرولتر من محلول الإيثانول 80٪ (درجة الحموضة 2.0).
    6. أخرجي قطع الأغطية من الفرن الاستغناء بعناية 100 ميكرولتر من محلول PEG على مركز كل غطاء، وضمان أن السطح العلوي فقط هو الرطب. ثم ضعي القسائم في الفرن واحتضني لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
    7. عندما تبدأ الأغطية في الظهور بمظهر دائري ، مع دوائر صغيرة واضحة عبر السطح ، قم بإزالتها من الفرن.
    8. غسل كل غطاء مع الإيثانول 100٪، الجافة مع خط الهواء، ووضعها مرة أخرى في الفرن. احتضان فقط للوقت اللازم لإنشاء غرف في الخطوة 2.
  2. إعداد الغرفة
    1. تنظيف شريحة المجهر لاستخدامها في صنع الغرفة. قطع قطعتين من الشريط على الوجهين، ما يقرب من 2 سم في الطول.
    2. ضع قطعة واحدة على طول منتصف الحافة الطويلة لشريحة المجهر. تأكد من محاذاة حافة الشريط مع حافة الشريحة. ضع القطعة الثانية من الشريط تقريبا 2 مم تحت القطعة الأولى من الشريط بحيث تكون متوازية ومتوائمة.
    3. خذ واحدة من الأغطية الوظيفية من الفرن (تم إنشاؤها في 3.1). عصا بعناية coverslip على الشريط بحيث الجانب المغلفة PEG هو وجهه لأسفل وإجراء اتصال مباشر مع الشريط، كما هو مبين في الشكل 1. باستخدام تلميح ماصة، اضغط برفق لأسفل على واجهة شريط الشرائح لضمان أن غطاء الغطاء قد التزم بشكل صحيح بالشريحة.
    4. قطع الشريط الزائد معلقة على الشريحة مع شفرة حلاقة. يمكن استخدام هذه الغرف على الفور أو وضعها بشكل زوجي في أنبوب سعة 50 مل وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. من المهم تخزين فورا أو السطح سوف تتحلل.
  3. أداء الفحص المجهري myosin 5a TIRF
    1. إعداد الحلول لميوسين 5a المقايسة الحركة مقلوب وصفها في الجدول 3 والاحتفاظ بها على الجليد.
    2. اغسل الغرفة ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 mM DTT.
    3. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 ملغم / مل BSA في 50 ميجابايت مع 1 MM DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين وانتظر لمدة دقيقة واحدة بعد الغسيل الثالث. استخدم زاوية ورقة نسيج أو ورقة تصفية لتكتيل الحل من خلال القناة.
    4. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    5. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول NeutrAvidin في 50 ميغا بايت مع 1 MM DTT وانتظر لمدة 1 دقيقة.
    6. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    7. تدفق في 10 ميكرولتر من البيوتينيلات رودامين أكتين (bRh-Actin) التي تحتوي على 1 MM DTT في 50 MM MB وانتظر لمدة 1 دقيقة. لهذه الخطوة، استخدم طرف ماصة كبيرة بالملل وتجنب الأنابيب صعودا وهبوطا للحد من القص من خيوط أكتين الفلورسنت لضمان أن خيوط أكتين طويلة يمكن إرفاقها إلى السطح (20-30 ميكرومتر أو أكثر). بديل فعال هو قطع مخروط طرف ماصة القياسية (مع فتح ≈1-1.5 ملم).
    8. اغسله ب 10 ميكرولتر من 50 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    9. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي مع 10 nM myosin 5a المضافة، ثم تحميل فورا على المجهر TIRF وتسجيل بعد العثور على التركيز الأمثل لTIRF طريقة التصوير. مرات التعرض بين 100-200 مللي ثانية مناسبة في 1.4 كيلوواط طاقة الليزر لactin وGFP المسمى ميوزين. وقت الاقتناء المناسب لتحليل السرعة هو 3 دقائق.
  4. أداء غير عضلة ميوزين 2b TIRF الفحص المجهري
    ملاحظة: في هذا القسم، يتم توفير تفاصيل المقايسة TIRF myosin 2b غير الميوسين باستخدام خيوط بلمرة وفوسفوريلاتيد. بروتوكول مفصل (أقسام 4.1-4.3) لفوسفوريلاتينج والبوليمرة يتم تضمين ميوسين-2b غير عضلة في أنبوب.
    1. لفوسفور NM2b المنقى، وجعل مزيج كيناز 10x مع الشروط التالية: 2 MM CaCl2،1 μM CaM، 1-10 nM MLCK، و 0.1 M ATP. يمكن جلب هذا إلى وحدة التخزين مع 500 ميغا بايت مع 10 MM DTT. إضافة مزيج كيناز 10x إلى الميوسين بنسبة حجمية من 1:10 والسماح لهذا لاحتضان لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عادة، تركيز الميوسين لهذه الخطوة هو 1 ميكرومتر.
    2. لبلمرة الفوسفوريلات الميسين إلى خيوط، وخفض تركيز الملح من NM2b إلى 150 mM NaCl. للقيام بذلك، قم بعمل مخزن مؤقت للحركية 1x (1x MB) بدون ملح عن طريق تخفيف 4x MB أربع مرات في dH2O. يمكن استخدام هذا 1x ميغابايت لخفض تركيز الملح لأنه تم تجميد NM2b في مخزن ملحي 500 mM.
    3. لكل 3 ميكرولتر من المخزون NM2b، أضف 7 ميكرولتر من 1x MB لخفض تركيز الملح إلى 150 mM NaCl واحتضان على الجليد لمدة 20-30 دقيقة لتشكيل خيوط NM2b.
      ملاحظة: الترتيب في الأقسام 4.1-4.3 ليس حاسما طالما أن NM2b هو فوسفوريلاتي وتركيز الملح النهائي هو 150 mM. الحضانة على ترتيب 30 دقيقة -1 ساعة يسمح الوقت الكافي للفوسفور الكامل والبوليمرة.
    4. إعداد الحلول لغيرmuscle myosin 2b المقايسة الحركة المقلوبة الموصوفة في الجدول 3 والاحتفاظ بها على الجليد.
    5. اغسل الغرفة ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا متر ميجابايت مع 1 mM DTT.
    6. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 ملغم / مل BSA في 150 ميجابايت مع 1 mM DTT كرر هذا غسل مرتين أكثر وانتظر لمدة 1 دقيقة بعد غسل الثالث. استخدم زاوية ورقة نسيج أو ورقة تصفية لتكتيل الحل من خلال القناة.
    7. اغسله ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    8. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول NeutrAvidin في 150 ميغا بايت مع 1 MM DTT وانتظر لمدة 1 دقيقة.
    9. اغسله ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    10. تدفق في 10 ميكرولتر من bRh-Actin وانتظر لمدة 1 دقيقة. لهذه الخطوة، استخدم طرف ماصة كبير بالملل وتجنب الأنابيب صعودا وهبوطا لتقليل القص من خيوط أكتين الفلورسنت، لضمان أن خيوط أكتين طويلة يمكن إرفاقها إلى السطح (20-30 ميكرومتر أو أكثر). بديل فعال هو قطع مخروط طرف ماصة القياسية.
    11. اغسله ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا متر ميجابايت مع 1 ميجا متر دي ت. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    12. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول ميوسين 2b غير عضلي (حوالي 30 nM) وانتظر لمدة دقيقة واحدة.
    13. اغسله ب 10 ميكرولتر من 150 ميجا بايت مع 1 mM DTT. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.
    14. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي، ثم تحميل فورا على المجهر TIRF وتسجيل بعد العثور على التركيز الأمثل لTIRF طريقة التصوير. مرات التعرض بين 100-200 مللي ثانية مناسبة في 1.4 كيلوواط طاقة الليزر لactin وGFP المسمى ميوزين. وقت الاقتناء المناسب لتحليل السرعة هو 3 دقائق.

4. تحليل الصور

  1. تحليل الصورة لانزلاق actin خيوط المقايسة
    ملاحظة: يمكن تحليل الصور باستخدام البرامج والكتيبات المرتبطة في قائمة المواد. من المهم ملاحظة أن البرنامج الموضح هنا يتطلب مداخن TIFF للتحليل. عملية تحليل مزلق actin خيوط المقايسة على النحو التالي50.
    1. تحميل مكدسات الفيلم الخام في بنية مجلد محدد وإدخال الدليل الأعلى في معظم مجلدات الفيلم في البرنامج.
      ملاحظة: البرنامج بتحليل الملفات عبر هذا الدليل والدلائل الفرعية، معاملة الدلائل أدنى مستوى كما replicates. وسيتم إنتاج إحصاءات متوسطة لكل مجموعة من النسخ المتماثلة. في هذه الحالة، تم استخدام فيلم واحد لكل الميسين. عند توصيف رواية myosin أو التحقيق في حالة تجريبية جديدة ، يوصى بتحليل الأفلام من ثلاثة مجالات للآراء (FOV) لكل غرفة لما مجموعه ثلاث غرف وتكرار سير العمل هذا لثلاثة تحضيرات للميسين التي يجري التحقيق فيها.
    2. استخدم البرنامج النصي "stack2tifs" بالتزامن مع معدل الإطار المدخل من قبل المستخدم لتحويل كل مكدس TIFF إلى مجلد يحتوي على سلسلة من ملفات TIFF الفردية وملف بيانات تعريف مقابلة.txt يحتوي على وقت بدء كل إطار. بالنسبة للبيانات غير بتنسيق مكدس TIFF، يجب أولا تطبيق تحويل باستخدام برامج مثل تلك المدرجة في جدول المواد.
      ملاحظة: هذا البرنامج النصي هو جزء من حزمة البرامج. يمكن العثور على معلومات البرنامج النصي هنا: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. استخدم المعلمة -px، وهي حجم البكسل (بالنم) أثناء الامتلاك. في هذه الحالة، حجم بكسل هو 130 نانومتر. استخدم المعلمات -xmax و-ymax لتوسيع المحاور لمخرجات المخطط المبعثر. هذه تتوافق مع أطول طول خيوط مرسومة والسرعة القصوى المرسومة (في نانومتر / ثانية).
      ملاحظة: هذه قيم مقدرة ويمكن تعيينها إلى قيم أعلى من المتوقع لضمان احتواء البيانات في المخطط. وبعد التحليل، يمكن أيضا تصدير البيانات الأولية لاستخدامها في برامج إحصائية أو رسوم بيانية أخرى للعرض والتحليل.
    4. استخدم المعلمة -minv، وهي معلمة الحد الأدنى لقطع السرعة، لتحديد خيوط التي لا تتحرك، وبالتالي، يمكن استبعادها من التحليل. لبطء myosin مثل NM2b، يجب أن تكون هذه المعلمة منخفضة (في هذا المثال، 5 نانومتر / ثانية) لتجنب الاستغناء عن حركات الانزلاق الحقيقية. للحصول على myosin سريع مثل M5a، يمكن أن تكون هذه المعلمة أعلى (في هذا المثال، 100 نانومتر / ثانية) لتطبيق مرشح أكثر صرامة، مع الاحتفاظ بتوزيع سرعة الانزلاق الحقيقي.
    5. Usethe -pt قطع المعلمة لتحديد حركة سلسة. لكل إطار أخذ عينات، يتم حساب قيمة تعادل سرعة الانحراف المعياري/متوسط السرعة 100 × السرعة. المسارات ذات القيم الأعلى من القطع ، لديها سرعات متغيرة أكثر ويتم استبعادها من مزيد من التحليل. في هذا المثال، تم استخدام قيمة قطع 33. المسارات ذات القيم العالية لها سرعات متغيرة أكثر ويتم استبعادها من مزيد من التحليل.
    6. استخدم -maxd لتعيين مسافة ربط مسموح بها كحد أقصى بين الإطارات. هذه مسافة محسوبة من الإطار إلى الإطار تتحرك بواسطة السنترويد للخيوط في وحدات نانومتر. ويمكن أن يكون مفيدا لاستبعاد الحركات المتفرقة أو الربط غير الصحيح بين خيوط. في الأمثلة هنا، تم ترك المعلمة على القيمة الافتراضية 2000 نانومتر.
  2. تحليل الصورة لإجراء الفحص المجهري TIRF
    ملاحظة: عملية تحليل اختبار TIRF جزيء واحد على برنامج التصوير المدرجة خصيصا في جدول المواد كما يلي29.
    1. انقر واسحب الفيديو المجهري المسجل إلى مساحة عمل البرنامج لفتحه51. ثم، تقسيم قنوات الاستحواذ. انقر على > الصور اللون > تقسيم القنوات.
      ملاحظة: في حالة الانجراف مرحلة ملحوظة أثناء الاستحواذ، يجب تثبيت الصور لتصحيح الانجراف مفيدة على متن الطائرة التصوير. في هذه الحالة، لم يتم استخدام أي تعويض عن الانجراف محور Z كما المجهر المستخدمة للحصول على هذه البيانات يستقر على التركيز Z جيدا. لتثبيت الصورة على برنامج تحليل الصور، قم بتثبيت المكون الإضافي المناسب المثبت المرتبط في قائمة المواد. يفترض مثبت الصورة مواضع ثابتة للكائنات الموجودة في الصورة ويستخدم متوسطا متجددا للإطارات السابقة كمرجع. ولذلك فإن الإجراء الموصى به هو أن تبدأ القناة التي تحتوي على صور من actin المسمى، لأن هذا هو في موقف ثابت.
    2. انقر على الإضافات، ثم العثور على مثبت الصورة؛ تأكد من تحديد الترجمة والاحتفاظ بالإعدادات الافتراضية. حدد المربع بجوار معاملات تحويل السجل. يسمح تطبيق خطوة السجل هذه بتطبيق معلمات الإزاحة المحسوبة على القناة الأخرى في الخطوة التالية. السماح لإكمال العملية.
    3. ثم افتح القناة مع myosin المسمى وتطبيق الاستقرار بالنقر على الإضافات > صورة مثبت سجل التطبيق. إذا لم يتم الحصول على صور أكتين خلال نفس الاستحواذ بسبب شرط التصوير بمعدل أعلى في قناة واحدة ، فإن الانجراف يعمل على استقرار كومة الصور عن طريق اختيار منطقة تحتوي على أجسام ثابتة مثل علامة fiducial ذات اللاتينيات الحيوية أو الفلوروفورات المرتبطة بشكل غير محدد بسطح BIOTIN-PEG. يمكن اقتصاص هذه المنطقة من المكدس الأصلي وتثبيتها، متبوعة بتطبيق قيم الإزاحة الناتجة إلى المكدس الأصلي.
      ملاحظة: في الممارسة العملية، والانجراف لوحظ في التجارب الحركة لن تذكر بالنسبة لحركة الميوسين التي تتحرك في عدة مئات نانومتر / ثانية، ولكن لأبطأ myosins هذا يصبح اعتبارا هاما.
    4. ثم، فتح TrackMate، انقر على الإضافات. ثم، في القائمة المنسدلة انقر على تتبع وأخيرا على TrackMate. عند هذه النقطة ، يخضع تحليل الصورة للتحسين استنادا إلى معلمات ظروف الفلوروفور والحسوب. ومع ذلك، معلمات البدء المثالية كما يلي.
      1. إعدادات المعايرة: احتفظ بجميع القيم الافتراضية.
      2. كاشف: كاشف لوغ.
      3. قطر النقطة المقدر: 0.5-1.0 ميكرون.
      4. العتبة: 25-200. (يمكن تحديد ذلك بالنقر فوق معاينة بعد اختيار رقم لمعرفة ما إذا كانت البقع المكتشفة تتطابق مع الفيلم وضبطها بشكل مناسب.)
      5. العتبات الأولية: لم يتم تعيينها.
      6. طريقة العرض: عرض HyperStack.
      7. تعيين عوامل التصفية على البقع: لم يتم تعيينها.
      8. تعقب: تعقب LAP بسيطة.
        ملاحظة: تعتمد هذه على معدل الإطار وسرعة الميسين ويجب أن تكون كبيرة بما يكفي لربط المواقف اللاحقة مع استبعاد الاتصالات غير المرغوب فيها بين الجسيمات المختلفة.
      9. ربط الحد الأقصى للمسافة: 1.0 ميكرون.
      10. الفجوة إغلاق الحد الأقصى المسافة: 1.0 ميكرون.
      11. الفجوة إغلاق الحد الأقصى للفجوة الإطار: 1.
      12. تعيين المرشحات على المسارات: المسار النزوح (>0.39- لتشمل البقع فقط تتحرك أكثر من 3 بكسل)، البقع في المسارات (>3-لتشمل المسارات فقط مع ما لا يقل عن 3 البقع). قد يتم إدخال مرشحات أخرى مثل الحد الأدنى من السرعة لاستبعاد البقع التي تماطل لفترات طويلة. يجب التحقق من نتائج التصفية عن طريق الفحص البصري للمسارات لضمان إزالة المسارات الزائفة (أي حركة الميوسين في الخلفية التي ليست على طول مسار actin) مع الاحتفاظ بالمسارات المرتبطة actin.
    5. بمجرد أن تظهر شاشة خيارات العرض، انقر على تحليل للمخرجات ذات الصلة. حفظ الجداول الثلاثة المنتجة (تتبع الإحصاءات، وصلات في تتبع الإحصاءات، والبقع في تتبع الإحصاءات). وسيحتوي جدول إحصاءات المسار على بيانات السرعة والتشريد التي يمكن تحليلها بعد ذلك لتوصيف بروتين جديد أو آثار حالة تجريبية معينة، على سبيل المثال.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنقية الميوسين يمكن تقييمها عن طريق أداء الحد من الصوديوم دودسيل كبريتات-بولياكريلاميد (SDS-PAGE) هلام-electrophoresis كما هو موضح في الشكل 2. في حين أن هذا الرقم يمثل الميسين النهائي ، بعد dialyzed ، يمكن إجراء SDS-PAGE على aliquots من مختلف مراحل إجراء التطهير لتحديد أي منتجات فقدت للناموست. Myosin 5a HMM لديه فرقة في نطاق 120-130 kDa وكامل طول myosin 2b غيرmuscle لديه الفرقة في نطاق 200-230 kDa، المقابلة لسلاسل ثقيلة29،44. و5a myo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا هو سير العمل لتنقية وتوصيف في المختبر من 5a ميوزين و2b غير عضلة ميوسين. هذه المجموعة من التجارب مفيدة لتحديد الخصائص الميكانيكية الكيميائية لبنى الميوسين المنقى بطريقة سريعة وقابلة للاستنساخ. على الرغم من أن اثنين من الميوسين هو مبين هنا ليست سوى مثالين محددين من بين العديد من الاحتمالات، يمكن تطبيق الشروط والتقنيات، مع بعض الخياطة، لمعظم الميوسين والعديد من البروتينات الحركية الأخرى.

تخضع البروتوكولات التي تمت مناقشتها هنا لاختلافات اعتمادا على الاحتياجات الفردية للمختبر والتجارب. على سبي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر الدكتور فانغ زانغ على المساعدة التقنية في إعداد الكواشف المستخدمة لجمع هذه البيانات. تم دعم هذا العمل من قبل NHLBI / NIH صندوق برنامج البحوث داخل الجافية HL001786 إلى J.R.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>1 مل حقنة< / قوي>دينار بحريني309628
<قوي>2< / قوي> M CaCl2 < / sub>SolutionVWR10128-558
2 M MgCl< / strong>2 < / sub>SolutionVWR10128-298
27 مقياس إبرة< / قوي>بكتون ديكنسون309623
<قوي > 5 م محلول كلوريد الصوديوم < / قوي >دينار كويتي طبيRGE-3270
<قوي > حمض الخليك < / قوي >ThermoFisher Scientific984303
<قوي > أسيتات أميل < / قوي >لاد للصناعات البحثية10825
< قوي > مضاد للعلم M2 هلام تقارب < / قوي >ميليبور سيجماA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
<قوي>ATPMillipore SigmaA7699
<قوي>بيوتينيلated G-ActinCytoskeleton، Inc.AB07
<قوي>ألبومين مصل البقر< قوي>Millipore Sigma5470
bPEG-silaneLaysan Bio، IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Recode ConcentrateBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
<قوي > كاتالاز < / قوي >Millipore SigmaC40
< قوي > خط خلية (Sf9) في SF-900 II SFM < / strong > ThermoFisherScientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
<قوي > ورق ترشيح دائري - فحص انزلاقي < / قوي>Millipore SigmaWHA1001125
ورق ترشيح دائري <قوي > - مقايسة مقلوبة < / قوي >Millipore SigmaWHA1001090
قوية > cOmplete ، خالية من EDTA < / قوية >Millipore Sigma5056489001يجب تخزين هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يمكن استخدام الأقراص مباشرة أو يمكن إعادة تكوينها كمحلول مخزون 25x عن طريق إذابة قرص واحد في 2 مل من الماء المقطر. يمكن تخزين المحلول الناتج عند 4 درجات ؛ C لمدة 1-2 أسابيع أو 12 أسبوعا على الأقل عند -20 درجة مئوية
<أنابيب مركزة قوية > (100,000 MWCO) < / قوية >EMD شركة MilliporeUFC910024MWCO للأنبوب ليس بالضرورة "مقاس واحد يناسب الجميع" ، طالما أن MWCO أقل من الوزن الجزيئي الكلي للبروتين الذي يتم تنقيه. تم تركيز NM2b هنا بأنبوب 100,000 MWCO وتم تركيز M5a بأنبوب 30,000 MWCO.
<قوي>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye< / strong>ThermoFisher Scientific20278
Coverslip Rack< / strong>Millipore SigmaZ688568-1EA
Coverslips: فحص خيوط التمثيل المنزلق < / strong>VWR International48366-227
Coverslips: فحص الحركة المقلوب < / قوي> أنابيب غسيل الكلى Azer ScientificES0107052
(3500 Dalton MCWO)< / strong>Fischer Scientific08-670-5Aيمكن أن يختلف قطر أنبوب غسيل الكلى ، ولكن يجب أن يكون MWCO هو نفسه. تم غسيل الكلى NM2b المستخدم هنا في أنبوب غسيل الكلى 18 مم. يمكن تخزين الأنابيب في محلول كحول بنسبة 20٪ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
<قوي>DL-Dithiothreitol< / strong>Millipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP10586يمكن إذابة هذا في مخزن مؤقت يحتوي على 0.1 M كلوريد الصوديوم ، 0.1 ملي مولار EGTA ، 3 ملي مولار NaN3< / sub> ، و 10 ملي مولار MOPS (درجة الحموضة 7.2) إلى تركيز نهائي يبلغ 50 مجم / مل. يمكن تخزين هذا عند -20 درجة ؛ C مثل 300 & L aliquots. 
<قوي>EGTA< / قوي>Millipore SigmaE4378
Elution Column< / strong>Bio-Rad761-1550يمكن إعادة استخدامها. للتنظيف ، اشطف العمود بأحجام 2-3 أعمدة من PBS والماء المقطر. برد العمود عند 4 درجات ؛ ج قبل الاستخدام.
<قوي>الإيثانولفيشرالعلميA4094
<قوي>G-أكتينPMID:يمكن تخزين مخزون 4254541 G-actin في 200 مو ؛ M في السائل N2.
<قوي>الجلوكوز< قوي>ميليبور سيجماG8270<
قوي>الجلوكوز أوكسيديزميليبور سيجماG2133<
قوي>محلول عازلة جلايسين ، 100 ملم ، درجة الحموضة 2-2.5 ، 1 لتر < / قوي >سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-295018
HaloTag< / strong>PromegaG100A
<قوي> حمض الهيدروكلوريك < / قوي>ميليبور سيجما320331<
قوي>KCl< / قوي>فيشر العلميP217-500<
قوي> رؤوس ماصة ذات فتحة كبيرة< / قوي>فيشر Scientific02-707-134
<قوي>مثبط بروتياز ليوببتين< قوي>ثيرموفيشر العلمي78435
سلم قياسي <قوي>Mark12 غير ملوث< قوي>ThermoFisher ScientificLC5677
Methanol< / strong>Millipore SigmaMX0482
Methylcellulose< / strong>Millipore SigmaM0512
Microscope Slides< / strong>Fischer Scientific12-553-10
<قوي>مماسح < / قوي>فيشر العلميBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: يمكن تنقيةMLCK 23148220 الموسومة بعلامة FLAG بنفس الطريقة التي تم بها تنقية الميوسين الموسوم بعلامة FLAG هنا.
<قوي>NaN3< / sub>< / strong>Millipore SigmaS8032
NeutrAvidin< / strong>ThermoFisher Scientific31050
Nitrocellulose< / strong>Ladd Research Industries10800
NuPAGE 4 إلى 12٪ Bis-Tris Mini Protein Gel ، 15 جيدا < / قويا >ThermoFisher عازلة عينة علميةNP0323PK2
<قوية>NuPAGE LDS (4X) < / قوي> ThermoFisherScientificNP0007
<قوي > محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4< / قوي>ThermoFisher Scientific10010023
PMSF< / strong>Millipore Sigma78830يمكن صنع PMSF كمحلول مخزون 0.1 متر في الأيزوبروبانول وتخزينه في 4 درجات مئوية. تؤدي إضافة الأيزوبروبانول إلى ترسيب بلوري ، والذي يمكن إذابته عن طريق التقليب في درجة حرارة الغرفة. قبل الاستخدام مباشرة ، يمكن إضافة PMSF بالتنقيط إلى محلول سريع التحريك إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1 مليمتر.
<قوية >شفرات الحلاقة< قوية >مستودع مكتب397492
<قوي> الرودامين-فالويدين< / قوي>ThermoFisher ScientificR415في 100٪ من الميثانول إلى تركيز نهائي يبلغ 200 مو.
Sf9 Media< / strong>ThermoFisher Scientific12658-027يجب تخزين هذا في 4 درجة مئوية. مدة صلاحيتها 18 شهرا من تاريخ التصنيع.
طبق ثقافة الأنسجة <قوي> - فحص الانزلاق< / القوي >353025يمكن أن يحتوي كل طبق لزراعة الأنسجة على ما يقرب من تسعة أغطية.
طبق زراعة الأنسجة <قوي> - 353003 الفحص المقلوب < / قوي >كورنينجأن يحتوي كل طبق لزراعة الأنسجة على ما يقرب من أربعة أغطية.
<قوي> على نحو سلس 200 & مايكرو; L نصائح الماصة< / قوي>توماس Scientific1158U38
< قوي > المعدات < / قوي >
< قوي > جهاز طرد مركزي < / قوي > ThermoFisherScientific75006590
< قوي > المجهر < / قوي >نيكون نموذج: Eclipse Ti مع نظام H-TIRF مع هدف 100x TIRF (NA 1.49)
<قوية >كاميرا مجهر< / قوية >نموذج Andor: كاميرا iXon DU888 EMCCD (تنسيق مستشعر 1024 × 1024)
<قوي > مجهر صندوق التحكم البيئي < / قوي>Tokai HITمخصص Thermobox
< قوي > وحدة ليزر مجهر < / قوي >نيكونLU-n4 أربع وحدات ليزر مع ليزر الحالة الصلبة ل 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 640 نانومتر
<قوي > منتصف مقاعد البدلاء الطرد المركزي < / قوي >ThermoFisher النموذج العلمي: CR3i
< قوي > Misonix Sonicator < / قوي >MisonixXL2020
< قوي > Optima Max-XP جهاز طرد مركزي < / قوي >بيكمان كولتر393315
< قوي > منظف البلازما < / قوي >داينر الإلكترونية GmbH + Co. نظام KG النوع: Zepto
< قوي > مسبار سونيكاتور (3.2 مم) < / قوي >Qsonica4418
<قوي > حاضنة قياسية < / قوي >الموثقنموذج: 56
< قوي > خلاط أنبوب ويفرلي < قوي >ويفرليTR6E
<قوي > برنامج < / قوي >
<قوي> ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (الإصدار 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST متاح للأنظمة المستندة إلى Mac OSX و Linux.
البرنامج المساعد <قوي > مثبت الصور < / قوي >https://imagej.net/Image_Stabilizer
<قوي> ImageJ TrackMate < / قوي >https://imagej.net/TrackMate
< قوي > برنامج التصوير < / عناصر قوية >NIS (حزمة AR)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md https://github.com/turalaksel/FASTrack File:TrackMate-manual.pdf
أقراص مثبطات البروتياز < ؛ يمكن تخفيف مخزون يمكن

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032(2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903(2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936(2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554(2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myosin Motility AssaysFluorescence MicroscopyGliding Actin FilamentInverted Motility AssayNonmuscle Myosin 2bMyosin 5a PurificationActin Filament TrackingSingle Molecule DynamicsTotal Internal ReflectionAffinity Chromatography

Related Articles