يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل من 3D الجهازيات الرئة الكاملة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لنمذجة البيولوجيا التنموية الرئة والمرض

8.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62456

⸱

أبريل 12, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of California, San Diego School of Medicine, 2Sanford Consortium for Regenerative Medicine, 3Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

في هذه المقالة

ملخص

ويصف المقال خطوة الحكمة الموجهة التمايز من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى الأجهزة الرئوية الكاملة ثلاثية الأبعاد التي تحتوي على كل من خلايا الرئة الظهارية القريبة والقاصية جنبا إلى جنب مع mesenchyme.

الملخص

كان من الصعب دراسة نمو الرئة البشرية والمرض بسبب عدم وجود نظم نموذجية ذات صلة بيولوجيا في المختبر . يمكن تمييز الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSCs) بشكل تدريجي إلى أعضاء رئوية متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، مصنوعة من مجموعات خلايا ظهارية ونسينشيمالية. نحن تلخيص الإشارات التنموية الجنينية من خلال إدخال زمنيا مجموعة متنوعة من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتوليد بكفاءة endoderm نهائي، الأمامية الأمامية الاندوديرم، وبعد ذلك خلايا السلف الرئة. ثم يتم تضمين هذه الخلايا في عامل النمو خفضت (GFR) الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط، مما يسمح لهم لتطوير عفويا إلى organoids الرئة 3D استجابة لعوامل النمو الخارجية. تخضع هذه الأعضاء الرئوية الكاملة (WLO) لمراحل نمو الرئة المبكرة بما في ذلك مورفوجينيسيس المتفرع والنضج بعد التعرض للديكساميثازون والتضخيم الدوري والإيزوبوتيلكانثين. تمتلك WLOs خلايا ظهارية مجرى الهواء تعبر عن علامات KRT5 (القاعدية) وSCGB3A2 (النادي) وMUC5AC (الكؤوس) وكذلك الخلايا الظهارية السنفية التي تعبر عن HOPX (النوع السنفي الأول) وSP-C (النوع الثاني من السنفية). الخلايا الميسينشيمالية موجودة أيضا، بما في ذلك أكتين العضلات الملساء (SMA)، ومستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية A (PDGFRα). يمكن الحفاظ على WLOs المشتقة من iPSC في ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد لعدة أشهر ويمكن فرزها لعلامات السطح لتنقية مجموعة خلايا محددة. ويمكن أيضا استخدام WLOs iPSC المستمدة لدراسة نمو الرئة البشرية، بما في ذلك الإشارات بين ظهارة الرئة وmesenchyme، لنموذج الطفرات الوراثية على وظيفة خلايا الرئة البشرية والتنمية، وتحديد السمية الخلوية للعوامل المعدية.

المقدمة

الرئة هي معقدة، غير متجانسة، الجهاز الديناميكي الذي يتطور في ست مراحل متميزة - الجنينية، الزائفة، القناني، saccular، الحويصلات، والنضج الأوعية الدموية الدقيقة1،2. تحدث المرحلتان الأخيرتان قبل الولادة وبعدها في النمو البشري بينما تحدث المراحل الأربع الأولى حصريا أثناء نمو الجنين ما لم تحدث الولادة المبتسرة3. تبدأ المرحلة الجنينية في طبقة جرثومة الجلد وتنتهي ببراعم القصبة الهوائية والرئة الناشئة. يحدث تطور الرئة جزئيا عن طريق الإشارة بين الخلايا الظهارية والخلايا الظهارية4. هذه التفاعلات تؤدي إلى تفريع الرئة، والانتشار، وتحديد المصير الخلوي والتمايز الخلوي للرئة النامية. تنقسم الرئة إلى مناطق إجراء (القصبة الهوائية إلى الشعب الهوائية الطرفية) ومناطق الجهاز التنفسي (القصبات الهوائية التنفسية إلى الحويصلات الهوائية). كل منطقة تحتوي على أنواع فريدة من الخلايا الظهارية; بما في ذلك القاعدية، إفراز، ciliated، فرشاة، الغدد الصماء العصبية، والخلايا الأيونية في مجرى الهواء إجراء5، تليها الخلايا السنفية النوع الأول والثاني في ظهارة الجهاز التنفسي6. الكثير لا يزال غير معروف حول تطوير والاستجابة لإصابة أنواع الخلايا المختلفة. تمكن نماذج الأعضاء الرئوية المشتقة من iPSC من دراسة الآليات التي تدفع نمو الرئة البشرية ، وآثار الطفرات الوراثية على الوظيفة الرئوية ، واستجابة كل من الظهارة والميسينشيم للعوامل المعدية دون الحاجة إلى أنسجة الرئة البشرية الأولية.

علامات المقابلة لمختلف مراحل التمايز الجنيني وتشمل CXCR4، cKit، FOXA2، وS SOX17 لاندوديرم نهائي (DE)7، FOXA2، TBX1، وS SOX2 لاندوديرم الأمامية (AFE)8، وNKX2-1 لخلايا السلف الرئة في وقت مبكر9. في تطور الرئة الجنينية ، يقسم الرغوت إلى المريء الظهري والرغامى البطنية. براعم الرئتين اليمنى واليسارية تظهر كما اثنين من النعومات المستقلة حول bud10 القصبة الهوائية. أثناء المورفوجين المتفرع ، ينتج الميسنشيم المحيط بالظهارة أنسجة مرنة وعضلات ناعمة وغضاريف وvasculature11. التفاعل بين الظهارة والميسينشيم ضروري لتطور الرئة الطبيعي. وهذا يشمل إفراز FGF1012 من قبل mesenchyme وSHH13 التي تنتجها ظهارة.

هنا، ونحن نصف بروتوكول للتمايز الموجه من hiPSCs إلى ثلاثي الأبعاد (3D) الأجهزة الرئوية كلها (WLO). في حين أن هناك نهج مماثلة التي تتضمن عزل خلايا السلف الرئة عن طريق الفرز في مرحلة LPC لجعل الأجهزة العضوية مثل السنفية 14,15 (البعيدة) أو organoids airway16 (قريبة) ، أو توليد الفيرويدات الأمامية البطنية لجعل أعضاء الرئة البشرية التي تعبر عن الخلايا الحويصلة الهوائية وعلامات الميسنشيمال وبراعم تلميح ، قوة هذه الطريقة هي إدراج كل من أنواع الخلايا الظهارية الرئوية والخلية الظهارية mesenchymal لنمط وتنسيق مورفوجينيسيس متفرعة الرئة، والنضج، والتوسع في المختبر.

يستخدم هذا البروتوكول جزيئات صغيرة وعوامل نمو لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات من خلال بطانة الرحم النهائية ، واندوديرم الأمامي ، وخلايا سلف الرئة. ثم يتم حث هذه الخلايا في 3D الأجهزة الرئوية الكاملة من خلال خطوات النمو الهامة، بما في ذلك المتفرعة والنضج. 10- يرد موجز بروتوكول التمايز في الشكل 1 أ مع صور تمثيلية من التمايز بين الاندوديرمال والأعضاء تظهر في الشكل 1ب. الشكل 1c،d تظهر تفاصيل التعبير الجيني للتمايز إندوديرمال، فضلا عن التعبير الجيني لكل من المجموعات القريبة والبعدية من الخلايا الظهارية الرئة بعد الانتهاء من التمايز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة هذا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لبرنامج حماية الأبحاث البشرية في UCSD (181180).

1. التعريفي endoderm نهائي من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (اليوم 1 - 3)

  1. عامل نمو ذوبان ببطء خفضت (GFR) الطابق السفلي غشاء (BM) مصفوفة المتوسطة على الجليد 30 دقيقة قبل الاستخدام. في DMEM/F12 الباردة، خليط، تمييع مصفوفة GFR BM المتوسطة 1:1 بحيث يشكل 50٪ من هذه الوسيلة. ضع نصائح ماصة P1000 في الثلاجة للاسترخاء قبل الاستخدام.
  2. معطف كل بئر من لوحة 12 جيدا مع 500 ميكروغرام من 50٪ GFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة المعدة في الجليد الباردة DMEM/F12. بمجرد أن يتم طلاء العدد المطلوب من الآبار، قم بإزالة أي خليط متوسط زائد و / أو فقاعات من الآبار ووضع الطبق على الثلج أو الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتعيينها. ثم، نقل لوحة إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى هلام والجافة.
  3. مرة واحدة hiPSCs تصل إلى التقاء 70-90٪، إضافة 10 ميكرومتر من كيناز المرتبطة رو (روك) المانع Y-27632 ساعة قبل الانفصال. يستنشق قبالة وسائل الإعلام ويغسل مرة واحدة مع الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS). hiPSCs ينفصم عن طريق إضافة الخلية مفرزة المتوسطة (0.5 مل / بئر من لوحة 12 بئرا) واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.
  4. إزالة لوحات من الحاضنة وإضافة 0.5 مل/12-بئر من الخلايا الجذعية تمرير المتوسطة (الجدول 1) إلى الآبار; خلايا تريتورات بلطف باستخدام طرف P1000 للحصول على تعليق خلية واحدة. نقل الخلايا المفككة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل؛ جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × ز.
  5. أسبيرات قبالة المتوسطة وإعادة إنفاق بيليه الخلية مع 1 مل من وسائل الإعلام mTeSR زائد تكملها مع مثبطات روك 10 ميكرومتر (Y-27632). إجراء عدد خلايا. إضافة 2.0 × 105 hiPSCs في 1 مل من mTeSR تكملها مع مثبط ROCK Y-27632 لكل بئر من 12 جيدا GFR-الطابق السفلي غشاء لوحة مغلفة المتوسطة. حضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يجب تحسين رقم البذر الخلية لكل سطر خلية. 24 ساعة بعد الطلاء، وينبغي أن تكون الآبار التقاء 50٪-70٪.
  6. في اليوم 1، يستنشق قبالة mTeSR زائد وإضافة Endoderm نهائي (DE) وسائل الإعلام التعريفي (الجدول 1) تكملها مع 100 نانوغرام / مل من activin الإنسان A و 5 ميكرومتر من مثبط GSK3β / Wnt المنشط CHIR99021.
    ملاحظة: يجب إزالة وسائط DE مع مثبط GSK3β / منشط WNT CHIR99021 في غضون 20-24 ساعة من اليوم 1 DE التعريفي للتمايز الناجح.
  7. في اليوم 2 واليوم 3، تغيير إلى وسائل الإعلام التعريفي DE تكملها مع 100 نانوغرام / مل من activin A فقط.
    ملاحظة: يجب أن لا يتجاوز تمايز DE إجمالي 72 ساعة، أو ستنخفض الفعالية. في اليوم 4، إذا لوحظ موت الخلايا الكبيرة، تقليل إجمالي الوقت التعرض وسائل الإعلام DE من قبل 6-12 ساعة.
  8. لتحليل كفاءة DE، تأكد من وجود أكثر من 90٪ CXCR4 و/أو تعبير cKit عبر قياس التدفق الخلوي أو تحليل الفلورة المناعية ل FOXA2 و/أو SOX17 (الشكل 2أ).

2. الأمامية الأمامية endoderm (AFE) التعريفي (اليوم 4 - 6)

  1. في اليوم 4، تغيير الوسائط إلى مصل المتوسط القاعدية الحرة (SFBM) (الجدول 1) تكملها مع 10 ميكرومتر SB431542 و 2 ميكرومتر دورسومورفين للتحريض AFE. تغيير وسائط AFE يوميا لمدة 3 أيام (اليوم 4، اليوم 5، واليوم 6).
  2. لتحليل كفاءة AFE، تأكد من التعبير القوي عن SOX2 و TBX1 و FOXA2 عن طريق تلطيخ immunofluorescence (الشكل 2ب).

3. الرئة سلف الخلية (LPC) التمايز (يوم 7 - 16)

  1. في اليوم 7، إذابة GFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة على الجليد. يستنشق قبالة وسائل الإعلام AFE ويغسل جيدا مع برنامج تلفزيوني 1x. إضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية واحتضان لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  2. إضافة 1 مل من وسائل التبريد (2٪ FBS في DMEM/F12) إلى الآبار التي تحتوي على محلول مفرزة الخلية. الحفاظ على الخلايا والمجاميع عن طريق pipetting صعودا وهبوطا بلطف. تأكد من إزاحة جميع الخلايا ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × ز.
  3. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في وسط Quenching تكملها 10 نانوغرام / مل من البروتين مورفوجينيك العظام المؤتلف البشرية-4 (BMP4)، 0.1 ميكرومتر من حمض الريتينويك جميع عبر (RA)، 3 ميكرومتر من مثبط GSK3β / WNT المنشط CHIR99021، و 10 ميكرومتر من مثبط الصخور Y-27632.
  4. إجراء عدد خلايا. إضافة 2.5 × 105 خلايا إلى 100 ميكرولتر من البارد GFR الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة المتوسطة، مزيج جيد، ووضع قطرة في بئر من لوحة 12 جيدا. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة للسماح للوسط لبوليمرة. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام LPC تستكمل مع 10 ميكرومتر من مثبط ROCK Y-27632 لكل بئر ضمان انخفاض المتوسطة مغمورة بالكامل واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. في اليوم 8، 24 ساعة بعد التعريفي LPC، تغيير LPC المتوسطة لإزالة مثبط ROCK Y-27632. تغيير متوسط LPC كل يومين لمدة إجمالية 9-11 يوما.
    ملاحظة: إذا أصبح الوسط أصفر خلال 24 ساعة، قم بتغيير الوسط كل يوم.
  6. لتحليل كفاءة LPC، تأكد من التعبير القوي عن عامل النسخ داخل الخلايا NKX2-1 أو قم بإجراء قياس التدفق الخلوي للعلامات السطحية CD47hi/CD26low15 أو CPM18 (الشكل 2c). بشكل صارخ، يجب أن تكون كرويدات LPC مستديرة وشفافة (الشكل 2c).
    ملاحظة: لا المضي قدما مع التمايز الجهازي الرئة إذا كانت كفاءة NKX2-1 أقل من 30٪.

4.3D تحريض الجهازية الرئوية (اليوم 16 - 22)

  1. في اليوم 17، إذابة GFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة على الجليد. يستنشق وسيطة التعريفي LPC. ثم أضف 2 ميكروغرام/مل من ديسباس (1 مل) إلى البئر وإعادة إنفاق الخليط المتوسط/التفكيكي مع ماصة P1000. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تريتورات الخليط مرة أخرى واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى.
  2. نقل ديسباس والخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل. استخدام برنامج تلفزيوني المبردة (2-3 مل) لغسل البئر وإعادة إنفاق خليط ديسباس / الخلية. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × ز. إزالة يدويا supernatant، مع الحرص على عدم distub طبقة بيليه المتوسطة / الخلية. كرر غسل PBS المبرد ، والطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي المخروطي لمدة 5 دقائق أخرى في 400 × ز.
  3. إزالة يدويا supernatant، ومن ثم إضافة 2 مل من حل التفكك القائم على التريبسين إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
  4. بعد الحضانة، وإعادة إنفاق الخلايا مع طرف ماصة P1000. ثم أضف حجما متساويا من وسائط التبريد إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي وتدور لأسفل عند 400 × ز لمدة 5 دقائق. يستنشق الخلايا الفائقة و resuspend في وسط التبريد + 10 ميكرومتر من مثبط ROCK Y-27632.
    ملاحظة: يحدث تحريض الجهاز الرئوي الناجح عندما يتم تضمين الخلايا كمجاميع ، وليس خلايا واحدة ، وضبط pipetting وفقا لذلك.
  5. إجراء عدد خلايا. حساب حجم اللازمة للحصول على 5.0-8.0 × 104 خلايا في بئر. تجمع خلية LPC في أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × ز. إزالة supernatant الزائدة، مع الحرص على عدم هياج بيليه الخلية. اترك 10 ميكرولتر فقط من الوسائط المتبقية.
  6. إعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من البارد GFR الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة وإضافة إلى إدراج غشاء ثقافة الخلية (قطر 6.5 ملم، 0.4 ميكرومتر المسام، غشاء البوليستر). احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة للسماح GFR الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة لبوليمرات.
  7. إضافة 1 مل من 3D organoid التعريفي المتوسط (الجدول 1) تستكمل مع عامل نمو الخلايا الليفية-7 (FGF7) (10 نانوغرام / مل), FGF10 (10 نانوغرام / مل), GSK3β المانع / W المنشط CHIR (3 ميكرومتر)، عامل نمو البشرة (EGF) (10 نانوغرام / مل)، و 10 ميكرومتر من مثبط ROCK Y-27632 إلى غرفة البازلات لإدراج الغشاء. تغيير المتوسطة كل يومين لمدة 6 أيام.

5.3D الرئة organoid المتفرعة (اليوم 23 - 28)

  1. في اليوم 23 تغيير إلى 3D المتفرعة المتوسطة (الجدول 1) تكملها FGF7 (10 نانوغرام / مل)، FGF10 (10 نانوغرام / مل)، GSK3β المانع / Wnt المنشط CHIR9902 1 (3 ميكرومتر)، RA (0.1 ميكرومتر)، EGF (10 نانوغرام/مل)، وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) / عامل نمو المشيمة (PlGF) (10 نانوغرام/مل). تغيير المتوسطة كل يومين لمدة 6 أيام.
    ملاحظة: في اليوم السادس من التمايز المتفرع ثلاثي الأبعاد، يجب أن تكون هناك عضويات متفرعة متعددة (الشكل 2).

6.3D نضوج الجهاز الرئوي (اليوم 29 - 34)

  1. في اليوم 29 ، قم بالتغيير إلى متوسط النضج ثلاثي الأبعاد (الجدول 1) ، وهو نفس متوسط التفريع ثلاثي الأبعاد ولكن مع إضافة ديكساميثازون (50 nM) ، cAMP (100 ميكرومتر) ، و 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) ، وهو مثبط فوسفوديستيراز يطلق عليه أيضا إيزوبوتيل زانثين (100 ميكرومتر). تغيير المتوسطة كل يومين لمدة 6 أيام.
    ملاحظة: في غضون 24 ساعة بعد النضج 3D، يجب توسيع organoids المتفرعة وتغييرها إلى مجالات شفافة.

7.3D الكيمياء المناعية العضوية الرئة

  1. لتحليل الجهازي الرئة كله 3D، إصلاح GFR-الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط في إدراج الغشاء مع 4٪ paraformaldehyde (PFA) لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية. تضمين في شمع البارافين وجبل على الشرائح وفقا للبروتوكولات المنشورة القياسية.
  2. إجراء استرجاع مستضد قبل تلطيخ. وتشمل علامات مجرى الهواء KRT5، MUC5AC، وSCGB3A2. تتضمن علامات Alveolar SP-C و SP-B و HTII-280 و HTI-56 و HOPX (الشكل 3).

8. إزالة الجهازيات الرئة كاملة من GFR الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة المتوسطة للمرور، FACS، أو cryopreservation

  1. لإلغاء نأي الأعضاء عن مصفوفة الغشاء GFR-basement المتوسطة، قم بإزالة الوسائط من الغرفة القاعدية وأضف 2 ميكروغرام/مل من التفكيك (1 مل) في الغرفة القاعدية.
  2. triturate بلطف خليط المتوسطة / dispase مع ماصة P1000 ومكان في الحاضنة لمدة 15 دقيقة. تريتورات بلطف الخليط مرة أخرى واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى.
  3. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني المبردة (4 درجة مئوية) ونقل organoids مع مصفوفة المتوسطة في أنبوب الطرد المركزي مخروطية 15 مل. تدور في 400 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant بعناية، وليس لإزعاج بيليه الخلية.
  4. يغسل مرة أخرى مع 1 مل المبردة PBS وتدور أسفل في 400 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant بعناية، وليس لإزعاج خليط متوسط / الخلية.
  5. إضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي، triturate بلطف resuspend مصفوفة الغشاء GFR-الطابق السفلي خليط متوسط / الخلية. ضع في الحاضنة لمدة 12 دقيقة لخلايا التمرير كمجاميع أو لالتبريد) ، أو 20 دقيقة لتعليق الخلية الواحدة.
  6. إضافة حجم متساو من وسائل الإعلام إخماد وتدور أسفل في 400 × ز لمدة 5 دقائق. Resuspend في إخماد المتوسطة + 10 ميكرومتر من مثبط روك Y-27632.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، لا ينبغي أن ينظر إلى أي وسيطة غشاء الطابق السفلي المتبقية في الأنبوب. إذا بقي متوسط متبقي، كرر الخطوتين 8.5 و8.6.
  7. إجراء عدد خلايا. حساب حجم الصوت المطلوب للتطبيقات المتلقين للمعلومات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

24 ساعة بعد الطلاء، اليوم 1، يجب أن تكون iPSCs التقاء 50٪-90٪. في اليوم الثاني، يجب أن يكون التقاء DE 90٪-95٪. أثناء تحريض DE ، من الشائع ملاحظة موت الخلايا بشكل كبير في اليوم 4 ولكن الخلايا المرفقة ستحتفظ مورفولوجيا حصاة مدمجة (الشكل 2ب). وقف التفريق إذا كانت غالبية الخلايا الملتصقة فصل والنظر في تقصير التعرض لوسائل الإعلام DE مع activin A من قبل 6-12 ساعة. أثناء تحريض AFE ، يكون موت الخلية ضئيلا ، وتظل الخلايا متمسكة ، ولكنها تبدو أصغر وأكثر تغايرا. يجب أن يتم تمرير الخلايا في اليوم 7 فقط ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعتمد التمايز الناجح لأجهزة الرئة الكاملة ثلاثية الأبعاد (WLO) على بروتوكول متعدد الخطوات لمدة 6 أسابيع مع الاهتمام بالتفاصيل ، بما في ذلك وقت التعرض لعوامل النمو والجزيئات الصغيرة ، والكثافة الخلوية بعد التمرير ، ونوعية hiPSCs. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، راجع الجدول 2. يجب أن تكون hiPSCs التقاء 70٪ -80٪ تقريبا ، مع أقل من 5٪ تمييز عفوي قبل الانفصال. يستدعي هذا البروتوكول وسيط "mTeSR زائد"; ومع ذلك، عادي "mTeSR" تم استخدام متوسط أيضا مع نتائج قابلة للمقارنة وأقل تكلفة. للمصفوفة خارج الخلية، ونحن نستخدم G...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<ثقافة خلية قوية> < / قوية>
12 ألواح بئرCorning3512
إدراج 12 بئر ، 0.4um ، شفافةVWR10769-208
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
حمض الأسكوربيكسيجماA4544
B27 بدون حمض الريتينويكThermoFisher12587010
ألبومين مصل الأبقار (BSA) Fraction V ، محلول 7.5٪Gibco15260-037
DispaseStemCellTech7913
DMEM / F12Gibco10565042
FBSGibco10082139
GlutamaxLife تقنيات35050061
Ham' s F12Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
Iscove ' s Dulbecco المعدل ' s متوسط (IMDM) + GlutamaxInvitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
MonothioglycerolSigmaM6145
mTeSR plus Kit (10 / حالة)Stem Cell Tech5825
N2ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
القلم / البكتيريا العقديةLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + GlutamaxLife Technologies12633012
TrypLEGibco12605-028
Y-27632 (مثبط الصخور)R & D Systems1254/1
<قوي>عوامل النمو / الجزيئات الصغيرة < / قوي>
Activin AR & D Systems338-AC
حمض الريتينويك المتحول بالكامل (RA)سيجما ألدريتشR2625
BMP4R & D Systems314-BP / CF
Br-cAMPسيجما ألدريتشB5386
CHIR99021Abcamab120890
ديكساميثازونسيجما ألدريتشD4902
دورسومرفينR & D Systems3093
EGFR& أنظمة D236-EG
FGF10R& أنظمة D345-FG / CF
FGF7R & D Systems251 كجم / CF
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
SB431542R& أنظمة D1614
VEGF / PIGFR & D Systems297-VP / CF
قوي > الأجسام المضادة الأولية < / قوي >< قوي > معدل التخفيف < / قوي >
CXCR4-PER & D SystemsFAB170P1:200 (F)
HOPXSanta Cruz Biotechsc-3987030.180555556
HTII-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2800.14583333
KRT5Abcamab526350.180555556
NKX2-1Abcamab760130.25
NKX2-1-APCLS-BIOLS-C2644371:1000 (F)
proSPCAbcamab408710.215277778
SCGB3A2Abcamab1818530.25
SOX2InvitrogenMA1-0140.180555556
SOX9R & D SystemsAF30750.180555556
SPB (ناضج)7 هيلز486041: 1500 (فهرنهايت) 1:500 (عرض) a< sup>
SPC (ناضج) LSBioLS-B91611:100 (F) ؛ 1: 500 (W) a< / sup>
<

المراجع

  1. Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
  2. Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
  3. Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36(2016).
  4. Hines, E. A., Sun, X. Tissue crosstalk in lung development. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).
  5. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  6. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  7. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  8. Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
  9. Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
  10. Schittny, J. C. Development of the lung. Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).
  11. Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
  12. Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
  13. Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
  14. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  15. Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
  16. McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51(2018).
  17. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
  18. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
  19. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  20. Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
  21. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  22. Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  23. Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
  24. McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
  25. Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
  26. Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450(2019).
  27. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  28. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
  29. McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
  30. Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).
  31. Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
  32. Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

جيل من 3D الجهازيات الرئة الكاملة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لنمذجة البيولوجيا التنموية الرئة والمرض
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.