تصف هذه الطريقة تنقية التدفق الخلوي ل MEP و MKp من عظام الفخذ والساق وعظام الحوض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
خلايا نخاع العظم الضخمة هي خلايا متعددة الأضلاع كبيرة تضمن إنتاج الصفائح الدموية. أنها تنشأ من الخلايا الجذعية الدموية من خلال megakaryopoiesis. المراحل النهائية من هذه العملية معقدة وتنطوي كلاسيكيا على السلف Megakaryocyte-Erythrocyte ثنائي القدرة (MEP) وسلفات Megakaryocyte أحادية القدرة (MKp). هذه المجموعات السكانية تسبق تشكيل الخلايا الضخمة حسنة النية ، وعلى هذا النحو ، يمكن عزلها وتوصيفها تسمح للتحليل قوية وغير متحيزة لتشكيل megakaryocyte. يقدم هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراء لجمع الخلايا الدموية من نخاع عظم الفأر ، وإثراء السلف الدموية من خلال الاستنفاد المغناطيسي وأخيرا استراتيجية فرز الخلايا التي تسفر عن مجموعات MEP و MKp شديدة النقاء. أولا، يتم جمع خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ، والساق، وأيضا قمة الحرقفي، وهو العظم الذي يحتوي على عدد كبير من السلف الدموية. استخدام عظام قمة الحرقفي يزيد بشكل كبير من إجمالي عدد الخلايا التي تم الحصول عليها لكل فأر، وبالتالي يساهم في استخدام أكثر أخلاقية للحيوانات. تم تحسين استنفاد النسب المغناطيسي باستخدام حبات مغناطيسية 450 نانومتر مما يسمح لفرز الخلايا بكفاءة عالية عن طريق قياس التدفق الخلوي. وأخيرا ، فإن البروتوكول يقدم وضع العلامات وgating استراتيجية لفرز اثنين من السكان السلف megakaryocyte تنقية عالية : MEP (لين--SCA - 1--ج كيت+CD16/32--CD150+CD9خافت)وMKP (لين-- SCA - 1--ج كيت+CD16/32--CD150+CD9مشرق ). هذه التقنية سهلة التنفيذ وتوفر ما يكفي من المواد الخلوية لأداء 1) التوصيف الجزيئي لمعرفة أعمق لهويتها وبيولوجيتها ، 2) في اختبارات التمايز المختبري ، من شأنها أن توفر فهما أفضل لآليات نضوج الخلايا العملاقة ، أو 3) في نماذج المختبر للتفاعل مع بيئتها الدقيقة.
المقدمة
يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة الخلايا العملاقة. وتقع هذه الخلايا الكبيرة متعددة الأضلاع في نخاع العظام وبالنسبة لجميع خلايا الدم فهي مشتقة من الخلايا الجذعية الدموية (HSC)1. المسار الكلاسيكي لإنتاج megakaryocytes في نخاع العظام ينبع من HSC وينطوي على جيل من السلف المختلفة التي تقيد تدريجيا إمكاناتها التمايز2. أول سلف التوقيع على الالتزام النسب megakaryocytic هو Megakaryocyte-Erythrocyte السلف (MEP)، سلف ثنائي القدرة قادرة على إنتاج كل من خلايا الغدة الدرقية وmegakaryocytes3،4،5. ثم تنتج وزارة التربية والميكارسين سلف وحيد القد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت بروتوكولات تشمل الحيوانات وفقا للجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة لجامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). رقم التصريح: E67-482-10).
1. جمع العظام الماوس
- التضحية بالحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
ملاحظة: تم الحصول على البيانات الواردة في هذه المخطوطة من فئران C57Bl/6 التي يتراوح عمرها بين 8 أسابيع و12 أسبوعا. قد يختلف عدد الخلايا التي تم الحصول عليها وتواتر المجموعات السكانية المذكورة حسب العمر وسلالة الماوس. - رش الجسم مع الإيثانول 70٪.
- باستخدام مقص، وجعل شق 0.5-1 سم من الجلد عمودي على العمود الفقري وتمزيق الجلد ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إجراء تحليل Phenotypic للخلايا التي تم تحديدها على أنها MEP و MKp عن طريق قياس التدفق الخلوي. وسمت الخلايا بأجسام مضادة مضانة مترافقة مع CD41a وCD42c، وهي علامات كلاسيكية للنساب الضخمة والصفائح الدموية. وأعرب عن كل من علامات من قبل خلايا السكان MKP في حين لم يتم الكشف عن هذه العلامات حتى الآن على سطح خلايا السكان MEP (الشكل 4Ai، 4Aii). بوليبلويدي هو السمة المميزة للخلايا العملاقة. كما تم تحليل محتوى الحمض النووي للسكان فرزها وأظهرت أن الخلايا هي في معظمها 2N للسكان MEP ون.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة الموصوفة في هذه الورقة يسمح لاستخراج وتنقية الماوس MEP و MKp. وكان من السمات الهامة في تحسين البروتوكول الحصول على عدد كاف من الخلايا التي من شأنها أن تكون متوافقة مع معظم المقايسات الجزيئية والخلوية. عادة ما تتكون الممارسة العامة لجمع عظام الفأر لاستخراج الخلايا المكونة للدم في حصاد كل من عظم الفخذ والساق لكل فأر. وبالتالي غالبا ما يتم تجاهل عظم الحوض ، وهو مصدر آخر للمواد الدموية. أسباب عدم جمع قمة الحرقفي هو ضعف المعرفة من التشريح الداخلي للهيكل العظمي للفأر وحقيقة أن المستخدمين يجمعون كلاسيكيا hindlimbs عن طر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
ويود المؤلفون أن يشكروا مونيك فرويند وكاثرين زيسيل وكيتي على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل الرابطة العامة لمناهضة الانتخابات ومنظمة أطباء بلا حدود، وغرانت ANR-17-CE14-0001-01 إلى Henri.de la. سال.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| إبر قياس 21 | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| الأجسام المضادة Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | الاستنفاد المغناطيسي |
| الأجسام المضادة B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | الاستنفاد المغناطيسي |
| الأجسام المضادة Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | المغناطيسي استنفاد |
| الأجسام المضادة CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | النضوب المغناطيسي |
| الأجسام المضادة CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | النضوب المغناطيسي |
| الأجسام المضادة CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | استنفاد مغناطيسي |
| الأجسام المضادة CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | الاستنفاد المغناطيسي |
| الأجسام المضادة TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | استنفاد مغناطيسي |
| الأجسام المضادة CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | الاستنفاد المغناطيسي |
| الأجسام المضادة CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | فرز الخلايا |
| الأجسام المضادة CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | فرز الخلايا |
| الأجسام المضادة TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | فرز الخلايا |
| الأجسام المضادة CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | فرز الخلايا |
| الأجسام المضادة CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | فرز الخلايا |
| الأجسام المضادة CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | فرز الخلايا |
| الأجسام المضادة c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | فرز الخلايا |
| الأجسام المضادة Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | فرز الخلايا |
| الأجسام المضادة CD16 / 32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | فرز الخلايا |
| الأجسام المضادة CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | ثقافة فرز |
| الخلايا المتوسطة StemSpan-SFEM | تقنيات الخلايا الجذعية | # 09650 | |
| وسادة تشريح | فيشر Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| الإيثانول | vWR للكيماويات | 83813.360 | |
| ملقط | Euronexia | P-120-AS | |
| ماصة زجاجية | باستور Dutscher | 42011 | |
| مغناطيس : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| الخرز المغناطيسي: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| تقنيات الخلايا الجذعية | الضخمة # 04970 | ||
| MethoCult SF M3436 | تقنيات الخلايا الجذعية | # 03436 | |
| مصل العجل حديثي الولادة | Dutscher | 50750-500 | |
| تحلل الخلايا الحمراء حل | BD Bioscience | 555899 | |
| مشارط | فيشر 12308009 | ||
| مقص | Euronexia | C-165-ASB | |
| محاقن معقمة 1 مل | BD Bioscience | 303172 | |
| أنابيب معقمة 15 مل | Sarstedt | 62.554.502 | |
| بولي بروبلين معقمة 5 مل | Falcon | 352063 | |
| البوليسترين المعقمة 5 مل Falcon | 352054 | ||
| أنابيب معقمة مع 70 & مايكرو ؛ غطاء مصفاة الخلية m | Falcon | 352235 | |
| طبق بتري معقم | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | أسطوانة أنبوب فرز الخلايا |
| المعياري Scientific | R3005 |
المراجع
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
