Method Article

التقاط المركبات العضوية المتطايرة الميكروبية المنتجة بنشاط من العينات المرتبطة بالإنسان باستخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ

DOI:

10.3791/62547

⸱

June 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استخراج المركبات العضوية المتطايرة من عينة بيولوجية باستخدام طريقة استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ ، وكروماتوغرافيا الغاز إلى جانب قياس الطيف الكتلي باستخدام سكة إعداد العينات Entech ، وتحليل البيانات. كما يصف استزراع العينات البيولوجية وفحص النظائر المستقرة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) من العينات البيولوجية لها أصول غير معروفة. قد تنشأ المركبات العضوية المتطايرة من المضيف أو الكائنات الحية المختلفة من داخل المجتمع الميكروبي للمضيف. لفك تشابك أصل المركبات العضوية المتطايرة الميكروبية ، تم إجراء تحليل متطاير لمساحة الرأس للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة للمكورات العنقودية الذهبية ، والزائفة الزنجارية ، و Acinetobacter baumannii ، وفحص النظائر المستقرة في العينات البيولوجية من البراز واللعاب ومياه الصرف الصحي والبلغم. تم استخدام المزارع الأحادية والمشتركة لتحديد الإنتاج المتطاير من الأنواع البكتيرية الفردية أو بالاشتراك مع فحص النظائر المستقرة لتحديد التمثيل الغذائي النشط للميكروبات من العينات البيولوجية.

تم استخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ (VASE) لاستخراج المركبات العضوية المتطايرة. VASE هي طريقة سهلة الاستخدام وتجارية وخالية من المذيبات لاستخراج مساحة الرأس للمركبات شبه المتطايرة والمتطايرة. إن نقص المذيبات والظروف شبه الفراغية المستخدمة أثناء الاستخراج تجعل تطوير طريقة سهلة وسريعة نسبيا عند مقارنتها بخيارات الاستخراج الأخرى مثل tert-butylation والاستخراج الدقيق للطور الصلب. تم استخدام سير العمل الموصوف هنا لتحديد توقيعات متقلبة محددة من الثقافات الأحادية والمشتركة. وعلاوة على ذلك، حدد تحليل فحص النظائر المستقرة للعينات البيولوجية المرتبطة بالإنسان المركبات العضوية المتطايرة التي أنتجت إما بشكل شائع أو فريد. تعرض هذه الورقة سير العمل العام والاعتبارات التجريبية ل VASE بالاقتران مع فحص النظائر المستقرة للمزارع الميكروبية الحية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) لديها وعد كبير للكشف عن البكتيريا وتحديد هويتها لأنها تنبعث من جميع الكائنات الحية ، والميكروبات المختلفة لها توقيعات فريدة من نوعها المركبات العضوية المتطايرة. تم استخدام الجزيئات المتطايرة كقياس غير جراحي للكشف عن التهابات الجهاز التنفسي المختلفة بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن1 ، والسل2 في البول3 ، والالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الصناعي4 ، بالإضافة إلى التمييز بين الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (CF) من مواضيع التحكم الصحية 5,6. حتى أن التوقيعات المتطايرة استخدمت للتمييز بين عدوى ممرضة محددة في التليف الكيسي (المكورات العنقودية الذهبية 7 ، والزائفة الزنجارية 8,9 ، و S. aureus مقابل P. aeruginosa10). ومع ذلك ، مع تعقيد هذه العينات البيولوجية ، غالبا ما يكون من الصعب تحديد مصدر المركبات العضوية المتطايرة المحددة.

تتمثل إحدى الاستراتيجيات لفك تشابك الملامح المتطايرة من الميكروبات المصابة المتعددة في إجراء تحليل للكائنات الحية الدقيقة في كل من الزراعة الأحادية والمشتركة11. يفحص تحليل مساحة الرأس التحليلات المنبعثة في "مساحة الرأس" فوق العينة بدلا من تلك المضمنة في العينة نفسها. غالبا ما تتميز المستقلبات الميكروبية في الثقافات الأحادية بسبب صعوبة تحديد أصل المستقلبات الميكروبية في العينات السريرية المعقدة. من خلال تنميط المواد المتطايرة من الثقافات الأحادية البكتيرية ، قد تمثل أنواع المواد المتطايرة التي ينتجها الميكروب في المختبر خط أساس لذخيرته المتطايرة. الجمع بين الثقافات البكتيرية ، على سبيل المثال ، إنشاء مزارع مشتركة ، وتوصيف الجزيئات المتطايرة المنتجة قد يكشف عن التفاعلات أو التغذية المتبادلة بين البكتيريا12.

استراتيجية أخرى لتحديد الأصل الميكروبي للجزيئات المتطايرة هي توفير مصدر غذائي يحمل نظائر مستقرة. النظائر المستقرة هي أشكال غير مشعة من الذرات التي تحدث بشكل طبيعي مع عدد مختلف من النيوترونات. في استراتيجية تم استخدامها منذ أوائل 1930s لتتبع التمثيل الغذائي النشط في الحيوانات13 ، تتغذى الكائنات الحية الدقيقة من مصدر المغذيات المسمى وتدمج النظير المستقر في مساراتها الأيضية. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام نظير مستقر في شكل ماء ثقيل (D2O) لتحديد S. aureus النشط استقلابيا في عينة بلغم CF السريرية14. في مثال آخر ، تم استخدام 13جلوكوز يحمل علامة C لإثبات التغذية المتقاطعة للمستقلبات بين العزلات السريرية CF ل P. aeruginosa و Rothia mucilaginosa12 .

مع تقدم تقنيات قياس الطيف الكتلي ، انتقلت طرق اكتشاف الإشارات المتطايرة من الملاحظات النوعية إلى قياسات أكثر كمية. باستخدام مطياف كتلة كروماتوغرافيا الغاز (GC-MS) ، أصبحت معالجة العينات البيولوجية في متناول معظم البيئات المختبرية أو السريرية. تم استخدام العديد من الطرق لمسح الجزيئات المتطايرة لتحديد ملامح العينات مثل الطعام والثقافات البكتيرية والعينات البيولوجية الأخرى والهواء والماء للكشف عن التلوث. ومع ذلك ، فإن العديد من الطرق الشائعة لأخذ العينات المتطايرة ذات الإنتاجية العالية تتطلب مذيبا ولا يتم تنفيذها بالمزايا التي يوفرها الاستخراج الفراغي. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى كميات أو كميات أكبر (أكبر من 0.5 مل) من المواد التي تم أخذ عينات منها للتحليل15،16،17،18،19 ، على الرغم من أن هذا خاص بالركيزة ويتطلب التحسين لكل نوع عينة وطريقة.

هنا ، تم استخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ (VASE) متبوعا بالامتزاز الحراري على GC-MS لمسح الملامح المتطايرة للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة وتحديد المواد المتطايرة المنتجة بنشاط مع فحص النظائر المستقرة من البراز البشري واللعاب ومياه الصرف الصحي وعينات البلغم (الشكل 1). مع كميات عينات محدودة ، تم استخراج المركبات العضوية المتطايرة من أقل من 15 ميكرولتر من البلغم. تتطلب تجارب فحص النظائر مع العينات البشرية إضافة مصدر نظير مستقر ، مثل الجلوكوز 13C ، والوسائط لزراعة نمو المجتمع الميكروبي. تم تحديد الإنتاج النشط للمواد المتطايرة كجزيء أثقل بواسطة GC-MS. مكن استخراج الجزيئات المتطايرة تحت فراغ ثابت من اكتشاف الجزيئات المتطايرة مع زيادة الحساسية 20،21،22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. القلم الماص Headspace (HSP) واعتبارات تحليل العينات

ملاحظة: تم اختيار HSP الذي يحتوي على مادة Tenax TA الماصة لالتقاط مجموعة واسعة من المواد المتطايرة. لدى Tenax تقارب أقل للمياه مقارنة بالمواد الماصة الأخرى ، مما يمكنه من احتجاز المزيد من المركبات العضوية المتطايرة من عينات الرطوبة العالية. يحتوي Tenax أيضا على مستوى منخفض من الشوائب ويمكن تكييفه لإعادة الاستخدام. كما تم اختيار المواد الماصة مع مراعاة العمود المثبت في GC-MS (انظر جدول المواد).

  1. قم بإنشاء عناصر تحكم سلبية عن طريق استخراج الوسائط و / أو فراغات العينات بنفس الشروط المستخدمة لاستخراج العينة.
  2. قم بتحليل HSP فارغ (تم تأكيده سابقا على أنه نظيف وخالي من الخلفية الهامة) على GC-MS قبل تحليل العينات المستخرجة. قم بتشغيل الفراغات بين أنواع العينات (على سبيل المثال ، ثلاثة تكرارات للبكتيريا أحادية الثقافة ، فارغة ، ثلاثة نسخ متماثلة من البكتيريا المشاركة في الزراعة ، فارغة ، إلخ).
  3. الحد من استخدام مواد العناية الشخصية العطرية أو استهلاك الأطعمة ذات الرائحة الكريهة قبل استخراج العينات وتحليلها. من الناحية المثالية ، قم بإعداد عينات في غطاء السلامة البيولوجية الذي لم يتم تطهيره بواسطة الكحول أو غيره من المنظفات المتطايرة لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بتشغيل تدفق الهواء في غطاء محرك السيارة للسلامة الأحيائية لمدة 30-60 دقيقة قبل إعداد العينة.
  4. احتفظ بالعينات على الجليد للحد من الإطلاق المتطاير أثناء تحضير العينة.

2. إعداد الثقافة الأحادية والمشتركة

  1. في غطاء السلامة الأحيائية ، قم بتلقيح ثقافات A. baumannii و S. aureus و P. aeruginosa في وسائط نمو تود هيويت. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة التحريض.
  2. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، قم بإجراء مناولة الثقافة في غطاء السلامة الأحيائية. قم بتخفيف كل ثقافة إلى الكثافة البصرية 0.05 عند 500 نانومتر.
  3. امزج الثقافات المشتركة في أجزاء متساوية ، وماصة 200 ميكرولتر من وسائط التحكم ، أحادية اللون ، أو الزراعة المشتركة في كل بئر من صفيحة 96 بئرا ، وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. إعداد لوحة ثانية لحضانة 48 ساعة.
  4. في نهاية فترة الحضانة ، قم بإعداد عينات لاستخراجها في القسم 4. تزرع سائل ماصة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وتخزن عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية لاستخراجها لاحقا إذا لزم الأمر.

3. فحص النظائر المستقرة في إعداد العينات البيولوجية

ملاحظة: تم التبرع بعينات البراز واللعاب من متبرعين مجهولين بموافقة من مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة كاليفورنيا إيرفين (HS# 2017-3867). جاءت مياه الصرف الصحي من سان دييغو ، كاليفورنيا. تم جمع عينات البلغم من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي كجزء من دراسة أكبر وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية لكلية الطب بجامعة ميشيغان (HUM00037056).

  1. إجراء جميع مستحضرات العينات البيولوجية في غطاء محرك السيارة للسلامة الأحيائية.
    1. لإعداد عينات من البراز ، أضف 1 مل من الماء منزوع الأيونات إلى 100 ملغ من البراز في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ودوامة لمدة 3 دقائق. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
      1. إلى 15 ميكرولتر من خليط البراز والماء ، أضف 485 ميكرولتر من وسط تسريب قلب الدماغ (BHI) مع 20 mM 13C glucose ، أو BHI مع 30٪ من الديوتيريوم (D2O). تأكد من أن الحجم النهائي للعينة هو 500 ميكرولتر.
    2. لإعداد عينات مياه الصرف الصحي ، أضف 500 ميكرولتر من مياه الصرف الصحي إلى 500 ميكرولتر من BHI مع 20 mM 13C glucose أو BHI مع 30٪ D2O لحجم إجمالي قدره 1 مل. تحضير العينات في ثلاثة أضعاف. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
    3. لإعداد عينات اللعاب ، أضف 50 ميكرولتر من اللعاب إلى 500 ميكرولتر من BHI مع 20 mM 13C glucose أو BHI مع 30٪ D2O لحجم إجمالي قدره 550 ميكرولتر. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
    4. لإعداد عينات البلغم لمقارنة المواد المتطايرة الموجودة في العينة قبل وبعد الزراعة ، قم بإجراء استخراج أول باستخدام 15 ميكرولتر من البلغم. تحضير العينات في ثلاثة أضعاف. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام. انتقل إلى القسم 4 لاستخراج العينات ، واستخرج لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع إثارة 200 دورة في الدقيقة.
    5. بعد الانتهاء من الاستخراج الأول لعينات البلغم غير المستزرعة ، احفظ القوارير بالبلغم. أضف 500 ميكرولتر من BHI مع جلوكوز 20 mM 13C إلى القوارير ذات البلغم من 3.5.1. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
  2. انتقل إلى القسم 4 لاستخراج العينات.

4. استخراج العينات

  1. ضع قوارير التحليل العضوي المتطاير (VOA) الفارغة (20 مل) على الصفيحة الباردة ، وضع الصفيحة الباردة على الجليد في غطاء السلامة الأحيائية.
  2. قم بتشغيل وحدة استخراج القلم الماصة 5600 (SPEU)، واضبط درجة الحرارة المطلوبة كما هو مطلوب لكل طريقة.
    ملاحظة: بالنسبة لتجارب فحص النظائر المستقرة عند 37 درجة مئوية، قد يستغرق الوصول إلى نقطة الضبط ما يصل إلى 15 دقيقة. بالنسبة لتجارب الزراعة الأحادية والمشتركة عند 70 درجة مئوية ، قد يستغرق الوصول إلى نقطة الضبط ما يصل إلى 60 دقيقة.
  3. اجمع HSPs نظيفة تساوي عدد العينات التي تم إعدادها، بما في ذلك HSPs للوسائط أو عناصر التحكم في العينات.
  4. قم بتسمية قوارير VOA سعة 20 مل وفقا للعينات والنسخ المتماثلة ومعرفات HSP حسب الحاجة. استخدم علامة تقاوم الماء في حالة تشكل التكثيف على السطح الخارجي للقارورة أثناء وجودها على الجليد.
  5. داخل غطاء السلامة الأحيائية ، قم بفك الغطاء الأبيض على القارورة ، وقم بسحب العينة بسرعة في القارورة ، وقم بتجميع الغطاء الأسود وبطانة الغطاء و HSP.
    ملاحظة: يجب ألا تتلامس العينات مع HSP ، وسيعتمد حجم العينة على نوع العينة.
  6. ضع القارورة التي تحتوي على العينة و HSP مرة أخرى على اللوحة الباردة.
  7. كرر الخطوتين 4.5 و4.6 لكل عينة. نفذ هذه الخطوات لكل عينة بدلا من كل مرة واحدة لمنع ارتفاع درجة حرارة العينة وبالتالي الإطلاق المتطاير المبكر.
  8. بمجرد إعداد جميع العينات في القوارير الزجاجية ، قم بتنفيذ الخطوات التالية خارج غطاء السلامة الأحيائية على المقعد. قم بتشغيل مضخة التفريغ ، وضع القوارير تحت الفراغ إلى 30 مم زئبق ، وإزالة مصدر التفريغ.
    ملاحظة: لا يلزم أن تكون القوارير على الدرج البارد بعد اكتمال تطبيق التفريغ.
  9. تحقق مرة أخرى من الضغط بعد وضع جميع العينات تحت الفراغ باستخدام مقياس الضغط. إذا كانت القارورة بها تسرب ، فتأكد من أن الغطاء مشدود بإحكام ، وأن حلقات O البيضاء لبطانات HSP والغطاء في مكانها بشكل صحيح.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي الختم المخترق إلى انخفاض الكشف عن التطاير مقارنة بالقارورة تحت الفراغ.
  10. ضع القوارير في SPEU للحصول على الوقت ودرجة الحرارة الأمثل مع الإثارة عند 200 دورة في الدقيقة. استخراج الثقافات لمدة 1 ساعة عند 70 درجة مئوية. استخراج تجارب فحص النظائر المستقرة مع عينات البراز والصرف الصحي واللعاب والبلغم لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  11. ضع اللوحة الباردة عند -80 درجة مئوية لاستخدامها بعد اكتمال فترة الاستخراج.
  12. عند اكتمال الاستخراج ، ضع عينات على اللوحة الباردة لمدة 15 دقيقة لسحب بخار الماء من HSP ومساحة رأس القارورة.
  13. نقل HSPs إلى أكمامهم.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا لمدة تصل إلى ~ 1 أسبوع في درجة حرارة الغرفة قبل فقدان المركبات الأكثر تقلبا من HSPs.

5. تحليل العينات على كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة (GC-MS)

  1. استخدم إعدادات GC-MS التالية (انظر جدول المواد): 35 درجة مئوية مع تعليق لمدة 5 دقائق، ومنحدر من 10 درجات مئوية/دقيقة إلى 170 درجة مئوية، ومنحدر من 15 درجة مئوية/دقيقة إلى 230 درجة مئوية مع نسبة تقسيم 20:1 ووقت تشغيل إجمالي يبلغ 38 دقيقة.
  2. اضبط طريقة الامتزاز على النحو التالي: 2 دقيقة ، 70 درجة مئوية ؛ 2 دقيقة 260 درجة مئوية الامتزاز. 34 دقيقة ، 260 درجة مئوية خبز ؛ و 2 دقيقة ، 70 درجة مئوية بعد الخبز.
  3. قم بإعداد تسلسل العينات ، وابدأ التشغيل وفقا للأجهزة.
    1. لإعداد تسلسل على برنامج Entech، افتح البرنامج. في الخيارات الموجودة على يسار القائمة المنسدلة للأداة، حدد 5800 | التسلسل.
    2. راقب جدول التسلسل في برنامج Entech المشابه لتلك الموجودة في برنامج GC-MS. قم بتسمية العمود نموذج المعرف وفقا لرقم date_vial الحالي. ضع في اعتبارك أن الاسم مشابه للاسم في جدول تسلسل GC-MS ، ويحدد 5800 Method معدل منحدر درجة الحرارة وأوقات الانتظار وما إلى ذلك (يفتح قائمة لتحديد الطريقة التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.2).
    3. ضع في اعتبارك أن عمودي الدرج والموضع يحددان المكان الذي ستذهب إليه سكة إعداد العينات (SPR) لالتقاط HSPs.
      1. راقب الصواني مع 30 بقعة لكل منها إلى اليسار مباشرة ، وضعت على شكل ستة أعمدة مع خمس بقع لكل منهما. موضع الدرج الأكثر يسارا والأقرب إلى المستخدم (الأمامي) هو الموضع 1 ، في حين أن أقصى اليمين والأبعد هو الموضع 30.
      2. لاحظ أن هذه الصواني هي HSP A أو B ، حيث HSP B هو الدرج الأقرب إلى SPR (الدرج الأعمق) ، وخلف HSP B مباشرة هو HSP فارغ. ضع العينات المستخرجة في الصواني ، وحدد البقعة على التسلسل وفقا لذلك.
    4. احفظ جدول التسلسل، وحدد تشغيل على الجانب الأيسر، ثم ابدأ بفارغ في desorber إذا كان HSP الفارغ في desorber (يشار إليه ب HSP مميز بتسمية صفراء).
  4. لاحظ أنه سيتم التعامل مع HSPs بواسطة SPR لكل عينة في التسلسل. دع SPR يسخن ، ثم ستظهر رسالة في الجزء العلوي من الشاشة لتأكيد ما إذا كان الفراغ في desorber. انقر فوق تخطي للتأكد من أن القلم موجود. اسمح ل SPR بتشغيل جميع العينات تلقائيا ، وسيقوم التسلسل الموجود على جانب GC-MS بتسجيل البيانات تلقائيا في ملفات منفصلة.

6. تحليل البيانات

  1. بيانات تصفية الجودة على برنامج GC-MS (جدول المواد).
    1. راجع كل قمة على الكروماتوجرام، على القمم التي تتطابق مع مكتبة المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) (أو مع مكتبة أخرى متاحة).
    2. إضافة قمم كروماتوجرام مشروحة إلى طريقة المعالجة. ضع معايير اختيار القمم لتشمل المركبات ذات الاحتمال الأكبر من 75٪ ، وتأكد من أن محاذاة كل أيون تعريف للمركب تقع داخل مركز الذروة.
      1. لإضافة ذروة إلى طريقة المعالجة، حدد معايرة | تحرير | المجمع الاسم | إدراج مركب ضمن المركب القياسي الخارجي. أضف اسم المركب ، وقت الاحتفاظ ، أيون هدف الإشارة الكمية. أضف أكبر ثلاث قمم. للحفظ، اختر موافق | طريقة | حفظ.
    3. بمجرد إعداد طريقة العملية ، انتقل إلى تحديد كمية | حساب | وعرضها QEdit النتيجة الكمية.
    4. افحص كل مركب للتأكد من أن القمم تتماشى مع أوقات الاحتفاظ المتوقعة وأنها أعلى من ضوضاء الخلفية.
    5. بمجرد اكتمال QEdit ، حدد الخروج | نعم لحفظ QEdits والعودة إلى الكروماتوجرام الرئيسي. تصدير تكاملات المنطقة عن طريق فتح الملف على الجانب الأيسر. حدد تحديد كمية | إنشاء تقرير.
    6. لتصدير ملفات لاستخدامها في DExSI، حدد ملف | تصدير البيانات إلى تنسيق AIA | إنشاء دليل جديد، وحدد موقعا للملف أو استخدم الدليل الموجود.
    7. راقب نافذة جديدة تفتح لتحديد الملفات المراد تصديرها. انقل الملفات إلى الجانب الأيمن من النافذة وانقر فوق معالجة. انتظر لبضع ثوان إلى بضع دقائق اعتمادا على عدد الملفات التي يتم تحويلها.
  2. تصحيح وفرة النظائر في DExSI وفقا لتعليمات برنامج DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) ، وإجراء التحليل باستخدام برنامج أو برنامج مفضل (على سبيل المثال ، R). توجد البرامج النصية المستخدمة لإنشاء الأشكال في https://github.com/joannlp/ VOC_SIP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الثقافات الأحادية والمشتركة ل S. aureus و P. aeruginosa و A. baumannii
تألفت الثقافات الأحادية والمشتركة من الأنواع البكتيرية S. aureus و P. aeruginosa و A. baumannii. هذه هي مسببات الأمراض الانتهازية الشائعة الموجودة في الجروح البشرية والالتهابات المزمنة. لتحديد الجزيئات المتطايرة الموجودة في الثقافات الأحادية والمشتركة ، تم إجراء استخراج قصير لمدة 1 ساعة عند 70 درجة مئوية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد الإنتاج المتطاير في الثقافات المخبرية والعينات المرتبطة بالإنسان ، تم إجراء تحليل متطاير للمزارع الأحادية والمشتركة من P. aeruginosa و S. aureus و A. baumanii وفحص النظائر المستقرة لعينات بيولوجية مختلفة. في تحليل الثقافات الأحادية والمشتركة ، تم الكشف عن المواد المتطايرة عن طريق إجراء استخراج قصير لمدة 1 ساعة عند 70 درجة مئوية. سمح التحليل المتقلب للمزارع الأحادية والمشتركة بمسح المركبات التي تنتجها الأنواع الفردية وأثناء تفاعلاتها مع الأنواع الأخرى. كانت هناك اختلافات في الوفرة النسبي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان V. L. V و S. J.B. D. موظفين سابقين في Entech Instruments Inc. ، و K. W. هو عضو في برنامج جامعة Entech. ج. ب. و ج. ك. و س. إ. ر. ليس لديهم تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر هيذر موغان وليندا م. كاليكين على التحرير الدقيق لهذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH NHLBI (منحة 5R01HL136647-04).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
13< / sup>C الجلوكوزسيجما ألدريتش389374-1G
2-Stg مضخة الحجابالحاجز Entech Instruments01-10-20030
20 مل قوارير VOAفيشر Scientific5719110
24 مم أغطية سوداء مع ثقب ، بدون حاجزEntech Instruments01-39-76044Bيحمل بطانة الغطاء في مكانها على بطانة قارورة
24 مم للأقلام الماصةتسمح Entech InstrumentsSP-L024Sللأقلام بعمل ختم فراغ أعلى القارورة
5600 وحدة استخراج القلم الماص (SPEU)Entech Instruments5600-SPES5600 وحدة استخراج القلم الماص -120 VAC
96 لوحات فحص البئرGenesee25-224
وسائط تسريب قلب الدماغ (BHI)Sigma-Aldrich53286-500G
ChemStation Stofwareعمود Agilent
DB-624Agilent122-1364E60 م ، معرف 0.25 مم ، سمك فيلم 1.40 ميكرون ، في GC-MS
أكسيد الديوتيريومSigma-Aldrich151882-1L
Dexsi sofwareDexsi (مفتوح المصدر)
GC-MS (7890A GC و 5975C خامل XL MSD مع كاشف ثلاثي المحاور)Agilent7890A GC و 5975C خامل XL MSD مع ثلاثي المحور كاشف
حزمة Headspace HS-B01 ، 120VAEntech InstrumentsSP-HS-B01عناصر لتشغيل استخراج مساحة الرأس المدرجة في الحزمة
قلم امتصاص Headspace (HSP) - قلمفارغ Entech InstrumentsSP-HS-0
Headspace (HSP) Tenax TA (35/60 شبكة) أنابيبالدقيقة Entech InstrumentsSP-HS-T3560
(2 مل)VWR53550-792
O-ringsEntech InstrumentsSP-OR-L024
عينة إعداد السكك الحديديةEntech Instruments
مكيف حراري للقلم الماصEntech Instruments3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) وسائل الإعلامSigmaT1438-500G
امتصاص الطرد المركزي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
  2. Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
  3. Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
  4. Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179(2015).
  5. Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
  6. Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
  7. Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
  8. Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87(2012).
  9. Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584(2014).
  10. Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826(2018).
  11. Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412(2015).
  12. Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151(2018).
  13. Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
  14. Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365(2018).
  15. Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
  16. Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184(2014).
  17. Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
  18. Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
  19. Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
  20. Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390(2020).
  21. Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
  22. Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
  23. Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12(2015).
  24. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060(2018).
  25. Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Volatile CompoundsVacuum Assisted Sorbent ExtractionStable Isotope ProbingHuman Biological SamplesVolatile Headspace AnalysisBacterial Mono CulturesCo Culture AnalysisGC MS AnalysisMetabolic Biomarker DiscoveryVolatile Metabolite Profiling

Related Articles