مقالة منهجية

حبة تحميل البروتينات والأحماض النووية في الخلايا البشرية الملتصقة

DOI:

10.3791/62559

⸱

يونيو 1, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Colorado State University, 2World Research Hub Initiative, Institute of Innovative Research, Tokyo Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحميل حبة يدخل البروتينات، البلازميدات، والجسيمات في خلايا الثدييات الملتصقة. تقنية تحميل الخلايا هذه غير مكلفة وسريعة ولا تؤثر بشكل كبير على صحة الخلية. وهو الأنسب للتصوير بالخلايا الحية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم العديد من تجارب التصوير بالخلايا الحية جزيئات خارجية (مثل الببتيدات والأجسام المضادة والخرز) لتسمية الخلايا أو عملها داخلها. ومع ذلك ، فإن إدخال البروتينات إلى خلية عبر غشاءها أمر صعب. إن الاختيار المحدود للطرق الحالية يتصارع مع انخفاض الكفاءة، ويتطلب معدات مكلفة وصعبة تقنيا، أو وظائف ضمن معايير ضيقة. هنا، نقوم بوصف تقنية بسيطة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لتحميل الحمض النووي، الحمض النووي الريبي، والبروتينات في الخلايا البشرية الحية. يؤدي تحميل الخرز إلى اضطراب ميكانيكي مؤقت في غشاء الخلية ، مما يسمح للجزيئات الكبيرة بدخول خلايا الثدييات الحية الملتصقة. في أقل من 0.01 دولار أمريكي لكل تجربة ، تحميل الخرز هو أقل طريقة تحميل الخلايا تكلفة المتاحة. وعلاوة على ذلك، تحميل حبة لا يضغط بشكل كبير الخلايا أو تؤثر على قدرتها على البقاء أو الانتشار. تصف هذه المخطوطة خطوات إجراء تحميل الخرز، والتعديلات، والاختلافات، والقيود التقنية. هذه المنهجية مناسبة بشكل خاص للتصوير بالخلايا الحية ولكنها توفر حلا عمليا للتطبيقات الأخرى التي تتطلب إدخال البروتينات أو الخرز أو الحمض النووي الريبي أو البلازميدات في خلايا الثدييات الحية الملتصقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحميل الجزيئات الكبيرة في خلايا الثدييات يتطلب منهجية تسمح لهم بعبور غشاء البلازما في الخلية1. يمكن أن تدخل عدة طرق البلازميدات في خلايا الثدييات من خلال العدوى ، بما في ذلك العدوى الليبوسومالية2 وتغذية ديثيلامينوثيل ديكتران3. ومع ذلك، فإن طرق تحميل البروتينات أو الجسيمات غير القابلة للغشاء إلى خلايا أكثر محدودية.

وقد تجاوزت عدة تقنيات هذه العقبة الصعبة باستخدام استراتيجيات مختلفة. أولا، microinjection يسلم الجسيمات من خلال micropipette في الخلايا الحية تحت المجهر4. في حين يمكن القول إن الطريقة الأكثر سيطرة وأقل الغازية، وهذه التقنية هي منخفضة نسبيا الإنتاجية لأنه يجب تحميل الخلايا واحدا تلو الآخر. وعلاوة على ذلك، يتطلب الميكروية معدات متخصصة وهو أمر صعب من الناحية التقنية.

ثانيا، الإلكتروبوين هو وسيلة لحقن البروتينات الكهربائية في الخلايا عن طريق تعطيل الغشاء الناجم عن الجهد5،6،7. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تتطلب مرة أخرى معدات متخصصة ومكلفة ، ويمكن أن تسبب الصدمة إجهاد الخلايا والوفيات. علاوة على ذلك ، يجب أن يتم تجريب الخلايا قبل الكهربوجين وإعادة طلاءها لاحقا ، مما يحد من الإطار الزمني الذي يمكن فيه فحص الخلايا بعد الكهربوجين.

ثالثا، قد يتم تعديل أغشية الخلايا كيميائيا للارتهان المؤقت القابل للعكس8،9. يدخل تحميل العقدية-O السموم الداخلية في أغشية الخلايا ، والتي تشكل مساما مؤقتة ، مما يسمح للجسيمات الخارجية الغشاء غير نفاذية ، بما في ذلك البروتينات وبلازميدات الحمض النووي ، بدخول الخلايا10. بعد 2 ساعة الانتعاش، حوالي نصف الخلايا إصلاح هذه المسام ووقف استيعاب الجسيمات من الحل. ومع ذلك، تتطلب هذه التقنية وقتا طويلا للتعافي ولا تتوافق مع أنواع الخلايا التي لا يمكنها تحمل السموم الداخلية.

رابعا، يقوم التعطيل الميكانيكي بتحميل الجسيمات في الخلايا من خلال الاضطراب المادي لغشاء الخلية11. ويمكن القيام بذلك بطرق متعددة، بما في ذلك الخدش، كشط، والمتداول الخرز فوق الخلايا12،13. في وقت مبكر من عام 1987 ، تم استخدام الخرز لتحميل البروتينات في الخلايا ميكانيكيا14. في الآونة الأخيرة ، تم تحسين تقنية تحميل الخرز وتكييفها خارج البروتينات لتشمل تحميل البلازميدات والحمض النووي الريبي ، كما هو موضح هنا.

تحميل الخرز هو وسيلة سهلة وغير مكلفة وسريعة لتحميل البروتين وplasmids في الخلايا البشرية الملتصقة. يتم لف الخرز الزجاجي لفترة وجيزة فوق الخلايا ، مما يعطل غشاءها الخلوي مؤقتا. وهذا يسمح للجسيمات في الحل للدخول. كما تحميل حبة لديه كفاءة منخفضة، هو الأنسب لتجارب المجهر جزيء واحد أو خلية واحدة. تحميل حبة يمكن أن أعرض مجموعة واسعة من البروتينات، بما في ذلك الأجسام المضادة مجزأة (فاب)،15،16 البروتينات النقية مثل scFvs،17 داخل الجسم،18،19،أو بروتينات معطف مرنا، على سبيل المثال، MS2 معطف البروتين (MCP)20،21. ويمكن أيضا أن تضاف ناقلات التعبير البلازميد إلى محلول البروتين والخرز محملة في وقت واحد22،23،24،25.

ما وراء البروتينات وplasmids، جزيئات كبيرة مثل 250 نانومتر حبات البوليسترين وقد أدخلت في الخلايا عن طريق تحميل حبة (الاتصالات الشخصية). تحميل حبة غير مكلفة بشكل لا يصدق، وتكلف أقل من 0.01 دولار أمريكي لكل تجربة في المواد والتي لا تتطلب معدات إضافية باهظة الثمن. يتم تقليل التكلفة بشكل أكبر عن طريق تقليل كمية المسابير المستخدمة في التجربة الواحدة لأنه يتم تحميل الخلايا فقط في الميكروويل المركزي الذي يبلغ قطره 14 مم في غرفة التصوير. وتجدر الإشارة إلى أن منطقة التحميل المحدودة تعني أن تحميل الخرز ليس مثاليا لتحميل الخلايا السائبة.

تعرض هذه المخطوطة عملية تحميل الخرز، بما في ذلك كيفية بناء جهاز تحميل الخرز وإجراء تجربة. ويظهر أن البروتينات والحمض النووي الريبي والحمض النووي يمكن تحميلها في أنواع مختلفة من الخلايا وأن اثنين من البروتينات المختلفة المحملة بالخرز في وقت واحد لديهما تركيزات خلوية مترابطة للغاية وتباين منخفض نسبيا. كما نوقشت الاختلافات في البروتوكول على أساس نوع الخلية وتحميل البروتين، البلازميد، أو الحمض النووي الريبي. على الرغم من أنه يعتقد أن الخرز يثقب ويعطل غشاء الخلية ، عند تنفيذه بشكل مناسب ، فإن عملية تحميل الخرز لا تطرد سوى عدد قليل من الخلايا من أسفل غرفة التصوير. بعد فترة نقاهة قصيرة، تستمر الخلايا في النمو والانقسام. هذه المنهجية مثالية لتجارب المجهر الخلية الحية، بما في ذلك البروتين جزيء واحد وتتبع الحمض النووي الريبي، والكشف عن تعديل ما بعد الترجمة، ومراقبة الآليات الخلوية الديناميكية، أو رصد توطين دونالخلوية 15،16،22،26،27.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنظيف وتعقيم، والخرز الزجاج الجاف لتجنب تكتل وضمان انتشار حتى فوق الخلايا.

  1. تعقيم ما يقرب من 5 مل من الخرز الزجاجي في هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). قياس الخرز في أنبوب مخروطي 50 مل. أضف 25 مل من 2 M NaOH واخلط بلطف باستخدام شاكر أو دوار لمدة 2 ساعة.
  2. Decant ناوه ، والاحتفاظ أكبر عدد ممكن من الخرز. إذا كانت الخرز في تعليق، تدور أسفل أنبوب الخرز لفترة وجيزة في جهاز الطرد المركزي (1 دقيقة في ~ 1000 × ز،درجة حرارة الغرفة).
  3. غسل الخرز جيدا مع المياه الخلية ثقافة الصف حتى درجة الحموضة محايدة (استخدام شريط اختبار درجة الحموضة على eluent لتأكيد درجة الحموضة محايدة). decant ماء الغسيل في كل مرة، كما كان من قبل.
  4. غسل الخرز جيدا مع الإيثانول 100٪ 2-3x. decant الإيثانول في كل مرة، كما كان من قبل.
  5. جفف الخرز. رش الخرز لتشكيل طبقة رقيقة داخل حاوية معقمة (مثل طبق بيتري 10 سم). ترك الحاوية مفتوحة، والسماح للخرزات الهواء الجاف في خزانة السلامة البيولوجية بين عشية وضحاها. تأكد من أن الخرز جاف تماما عن طريق النقر على الحاوية أو هزها برفق والتحقق من أن الخرز له نسيج رملي بدون تكتل أو تقشر.
  6. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الخرز الجاف لمدة 15 دقيقة.

2. تجميع جهاز محمل حبة.

  1. ربط رقعة من شبكة (البولي بروبلين أو ما يعادلها من المواد، وفتحات 105 ميكرومتر للسماح للخرزات بالمرور) لتغطية كامل افتتاح غرفة عقد الخرز مع الشريط أو لقط شبكة بين طرفي الذكور والإناث من غرفة التصوير المعدنية القابلة لإعادة الاستخدام (الشكل 1A).
  2. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الجهاز لمدة 15 دقيقة. إضافة الخرز إلى الجهاز وختم بإحكام مع فيلم شمعي.
    ملاحظة: من الضروري أن تكون الخرز نظيفة وجافة تماما في هذه الخطوة. يجب أن تكون فضفاضة وتبدو رملية مع عدم وجود كتل. إذا لم تظهر كذلك، إعادة غسل وتجفيف الخرز تماما.
  3. تخزين الجهاز في حاوية مختومة وجافة المجففة من هلام السيليكا أو غيرها من وسائل المجففة. إذا أصبحت الخرز رطبة ، والتي ستكون واضحة عن طريق تكتل الخرز ، وتجفيف وتعقيم محمل الخرز تماما واستبداله بالخرز الطازج.
    ملاحظة: كل هذه الاحتياطات سوف تمنع أي قالب أو بكتيريا من النمو على أو حول الخرز داخل محمل الخرز. يمكن إجراء جهاز محمل حبة بطرق مختلفة. انظر التفاصيل في المناقشة.

3. إعداد غرف الزجاج القاع من الخلايا الملتصقة.

  1. خلايا الثدييات الملتصقة بالبذور على غرفة ذات قاع زجاجي 35 ملم. تأكد من أن الخلايا هي تقريبا التقاء 80٪ في وقت تحميل حبة. (انظر الجدول 1 لمزيد من المعلومات حول أنواع الخلايا المختلفة والملاحظات حول فعالية تحميل الخرز في أنواع مختلفة من الخلايا.)
    ملاحظة: يمكن زرع الخلايا في ميكروويل فقط في وسط الغرفة للحفاظ على عدد الخلايا المستخدمة.
  2. احتضان الخلايا في ظل الظروف العادية حتى أنها ملتزمة تماما للزجاج.
    ملاحظة: من الضروري أن تكون كثافة الخلية عالية بما فيه الكفاية وأن يتم الالتزام بالخلايا بشكل آمن للزجاج. إذا لم يتم استيفاء هذه المتطلبات، فمن المرجح أن تقشر الخلايا أثناء تحميل الخرز. يمكن إطالة الجدول الزمني بين بذر الخلايا وتحميل الخرز لضمان التصاق الخلايا المناسبة والالتقاء.

4. حبة تحميل الخلايا

ملاحظة: إذا لزم الأمر، اغسل الخلايا لفترة وجيزة بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ثم أضف 2 مل من الوسط الأمثل. حضانة لمدة 30 دقيقة على الأقل.

  1. جعل حل من 3-8 ميكرولتر تحتوي على البلازميدات المطلوبة، والبروتين، و / أو الجسيمات. استخدام ~ 1 ميكروغرام (0.1-1 pmol) من كل نوع من البلازميد و ~ 0.5 ميكروغرام (0.01 نانومول) من البروتين، اعتمادا على الاحتياجات التجريبية. استخدم أنبوبا منخفض الاحتفاظ بالبروتينات بحيث لا تترك خلفها على جدران الأنبوب. جعل الحل يصل إلى الحد الأدنى من 3 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني، وضبط حجم الحل لمعطف كامل مساحة الخلايا ليتم تحميلها (أي، microwell الغرفة، الشكل 1B).
  2. خلط الحل تماما عن طريق pipetting صعودا وهبوطا و / أو النقر على الأنبوب. تدور لفترة وجيزة الحل وصولا الى الجزء السفلي من الأنبوب في microfuge الطاولة.
  3. نقل حل تحميل حبة وغرفة الخلايا في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة. تنفيذ الخطوات المتبقية في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة باستخدام تقنية معقمة.
  4. إزالة المتوسطة من الخلايا وتخزينها مؤقتا في أنبوب معقم. يستنشق بلطف كل وسيلة من جميع أنحاء حواف الغرفة، وإمالة الغرفة في زاوية 45 درجة تقريبا وإزالة قطرة المتبقية من وسائل الإعلام في microwell المركز. أثناء إزالة متوسطة، تأكد من تجنب السماح لطرف ماصة لمس الزجاج، مما قد يؤدي إلى تقشير الخلية وفقدان. تحرك بسرعة إلى الخطوة التالية بحيث لا تجف الخلايا لفترة طويلة.
  5. ماصة بلطف حل تحميل حبة على microwell الزجاج في وسط الغرفة. اختياري: احتضان مع هزاز لطيف ل~ 30 ق دون السماح للغرفة لتجف تماما.
  6. تفريق بلطف طبقة واحدة من الخرز الزجاجي على رأس الخلايا، ويفضل استخدام جهاز تحميل حبة (الشكل 1A). تأكد من أن الخرز تغطي الخلايا في ميكروويل الزجاج القاع تماما.
  7. معسر الغرفة بإصبعين، اضغط عليه ضد سطح غطاء محرك السيارة عن طريق رفعه ~ 2 بوصة وا اسقاطه بحزم. استخدام قوة تعادل تقريبا لإسقاط الطبق من هذا الارتفاع. كرر ما مجموعه ~ 10 الصنابير.
    ملاحظة: تأكد من أن الصنابير لا تقشير الخلايا بشكل كبير. يمكن تحسين النقر لنوع الخلية. إذا كانت الخلايا تحميل سيئة، اضغط أكثر صعوبة. ومع ذلك، إذا كان العديد من الخلايا قشر قبالة، اضغط على أكثر طفيفة.
  8. إضافة بلطف المتوسطة مرة أخرى إلى الغرفة عن طريق pipetting ببطء على الجانب البلاستيكي من الغرفة. في محاولة لتوبيخ أي حبات عائمة دون إزعاج الخلايا. أضف المزيد من الوسائط التي تم تسخينها مسبقا في هذه الخطوة إذا تمت إزالة الكثير. احتضان الخلايا لمدة 0.5-2 ساعة في الحاضنة.
  9. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم محمل حبة لمدة 15 دقيقة قبل إعادته إلى التخزين في ظل ظروف الجفاف.
  10. إضافة صبغة (على سبيل المثال، DAPI أو بقعة ليغات هالوتاغ، إذا لزم الأمر من قبل التجربة) إلى الخلايا وفقا للبروتوكول الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
  11. اغسل الخلايا 3x مع متوسط قبل التصوير لإزالة الخرز ومكونات التحميل الزائدة في الحل. تجنب الأنابيب مباشرة على الخلايا لمنعهم من التقشير.

5. تصوير الخلايا المحملة بالخرز

  1. قم بتصوير الخلايا على الفور أو عند الحاجة إليها من قبل التجربة. استخدام المجهر قادرة على التقاط مضان (الليزر أو مصدر الضوء أحادي اللون). تأكد من أن الأطوال الموجية للإثارة مناسبة للفلوروفور أو الصبغة المختارة (على سبيل المثال، ضوء الطول الموجي 488 نانومتر لبروتين الفلورية الخضراء (GFP)).
    ملاحظة: قد يتم تصوير البروتينات المحملة بالخرز بمجرد استعادة الخلايا (بمجرد تحميل 30 دقيقة لخطوط الخلية الموضحة هنا). تعبير البلازميد يأخذ ≥2 ساعة اعتمادا على عناصر متجه التعبير (الشكل 1C، ومزيد من التوضيح في المناقشة). يمكن إجراء تصوير الخلايا المحملة بالخرز على أي مجهر مجهز بمصادر فلورية مناسبة مرتبطة بمسابير محملة، وكاميرا قادرة على التقاط صور مضانة، مثل جهاز مقترن بشحنة الإلكترونات (EMCCD) أو كاميرا أشباه الموصلات التكميلية العلمية لأكسيد المعادن (sCMOS)، وحاضنة للتحكم في درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون. للحصول على دليل للفحص المجهري الفلوري، راجع 27.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التطبيق الأكثر شيوعا لتحميل حبة هو إدخال واحد أو أكثر من أنواع البروتين في الخلايا البشرية الملتصقة. لتوضيح ذلك ، كانت الخلايا محملة بالخرز بمحلول بروتين فاب Cy3 و Alexa488 المقترن. على الرغم من أن ليس كل خلية في microwell كانت محملة حبة، والخلايا التي تم تحميلها دائما تقريبا كان كل من Cy3- والبروتينات اليكسا488 المسمى معا (الشكل 2A). وفقا لتقديرات سابقة، عندما 0.5 ميكروغرام من فاب المخفف في 4 ميكرولترات هو حبة محملة29،كما هو الحال في الشكل 2A،يتم تحميل كل خلية مع ما يقرب من 106 جزيئات فاب.

Plasmid DNA ترميز GFP (1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد، 1.8 ميكرولتر من محلول 557 نانوغرام / ميكرولتر) و 0.5 ميكروغرام من فاب Cy3 المسمى كما أدخلت في الخلايا عن طريق تحميل الخرز وأعرب عنها في وقت لاحق وتصور(الشكل 2B). وأشار مضان GFP إلى أن البلازميد الذي يقوم ب ترميز GFP لم يتم تحميله في الخلايا فحسب، بل تم التعبير عنه أيضا. وهكذا، في نفس الخلية، تحميل حبة يمكن أن أعرض مسبار البروتين (على سبيل المثال، فاب Cy3 المسمى) ومراسل plasmid (على سبيل المثال، GFP)، كما أجريت في هذا المختبر سابقا22،23،24. قررنا أن 40٪ من الخلايا كانت محملة بالخرز مع بروتين فاب و 21٪ من الخلايا المحملة بالخرز أعرب عن البلازميد المحملة بشكل مشترك، كما هو موضح في مجالات الرؤية التمثيلية في الشكل 2B. عادة، يتم تحميل كل غرفة مع 1-2 ميكروغرام من البلازميد، تقريبا نفس كمية شفط الدهون.

الخلايا المحملة بالخرز تعبر عن مستويات متفاوتة على نطاق واسع من البلازميدات (الشكل 2C، D). لقياس هذا على وجه التحديد، استخدمنا اختبار نسبة فيشر لمقارنة توزيعات البروتين وبيانات كثافة البلازميد. وأظهرت النتائج أنه على الرغم من أن البروتينات 1 و 2 لديها توزيعات كثافة مماثلة (ع = ~ 1)، وكان كل بروتين توزيع أصغر بكثير من البلازميد (ع = 3.2e-6 و 1.8e-5). على الرغم من أن هذا يمكن أن يكون راجعا إلى التباين في عدد البلازميدات التي يتم تحميلها لكل خلية ، إلا أن المصدر الأكبر للتغير قد ينشأ عن العديد من الخطوات المطلوبة للتعبير البلازميد التي من المرجح أن تختلف بشكل كبير بين الخلايا ، بما في ذلك استيرادها إلى نواة الخلية والنسخ والترجمة. في المقابل، كانت مستويات البروتينات المحملة بالخرز تباينا طفيفا من خلية إلى خلية، وكانت مستويات اثنين من البروتينات المحملة في وقت واحد مرتبطة ارتباطا وثيقا ببعضها البعض(الشكل 2D، E).

يمكن رؤية تعبير البلازميد في وقت مبكر من تحميل حبة بعد 2-4 ساعة ولكن قد يحدث لاحقا اعتمادا على متى يتم الحصول على التعبير البلازميد الأمثل. نوصي بإجراء دورة زمنية لتحديد أفضل نافذة للتعبير عن بلازميد محدد يمتد من 2 إلى 24 ساعة بعد تحميل الخرز. ويمكن القيام بذلك في غرفة واحدة مع التصوير الإطار الزمني الطويل أو عن طريق تحميل حبة وغرف متعددة مذهلة. تبقى الخلايا المحملة بالخرز ملتزمة وهي صحية بما يكفي للنمو والانقسام. تم تصوير خلايا U2OS البشرية المحملة بالخرز مباشرة قبل تحميل الخرز مباشرة بعده و24 ساعة بعد تحميل الخرز. لم يكن لتحميل الخرز المناسب أي تأثير ملحوظ تقريبا على عدد الخلايا أو مورفولوجياها ، كما هو موضح في الشكل 3A (يسار ، وسط).

في المقابل ، يتم تصوير تحميل حبة الفقراء مع الكثير من الخرز وقوة التنصت المفرطة في الشكل 3B. تسبب هذا في فقدان الكثير من الخلايا (بقع كبيرة من غطاء الزجاج دون خلايا وخلايا منفصلة ، عائمة ، خارج التركيز) ، ومورفولوجيا الخلايا الفقيرة (الخلايا التي تظهر متجمعة وغير ملتزمة بشكل جيد) ، ومجموعات من الخرز المتبقية على coverglass بعد تحميل الخرز. على الرغم من أن الخلايا يعتقد أن تخضع لأضرار ميكانيكية أثناء تحميل الخرز، نمت الخلايا وانتشرت في غرفة محملة بالخرز بشكل صحيح، كما يتضح من زيادة عدد الخلايا 24 ساعة بعد تحميل الخرز (الشكل 3A، إلى اليمين). يمكن تقييم التأثير على صلاحية الخلية من خلال مجموعة متنوعة من المقايسات ، مثل 3-(4،5-dimethylthiazol-2-yl)-2،5-diphenyltetrazolium بروميد (MTT) ، لمقارنة حبة محملة بالخلايا المحملة وهمية30. علاوة على ذلك ، هذا العمل والسابق تبين أن الخلايا المحملة حبة تخضع لتقسيم الخلية (الشكل 3C والفيديو التكميلي 1) ، وتوقيت الانقسام لا يتأثر تحميل حبة31، والذي هو بمثابة دليل آخر على صحة الخلية المستدامة بعد تحميل الخرز.

تحميل الخرز هو تقنية متعددة الاستخدامات ، تستوعب العديد من خطوط الخلايا الملتصقة والجزيئات الكبيرة المختلفة. هنا، وقد ثبت هذا التنوع عن طريق تحميل خطوط الخلية RPE1 و HeLa مع فاب (الشكل 4A،B). ويقدم الجدول 1 أمثلة أخرى لتحميل الخرز في خطوط الخلايا المختلفة، في هذا المختبر وخارجه، ويشير إلى بعض الاختلافات الدقيقة بين بروتوكولات تحميل الخرز من مختبرات أخرى. وتجدر الإشارة إلى أن قطر الخرز الزجاجي المستخدم في التحميل يختلف اختلافا كبيرا بين المختبرات، على الرغم من أن التحميل الأكثر كفاءة تم العثور عليه للخرزات الصغيرة التي يبلغ قطرها 75 ميكرومتر في عدة خطوط خلوية14. وعلاوة على ذلك، بدأ هذا المختبر حبة تحميل الحمض النووي الريبي كذلك (البيانات غير مبين). يعرض الشكل 4C خلية U2OS تمثيلية محملة ب Cy5-RNA 9mer و Cy3-DNA 28mer معا.

figure-results-1
الشكل 1: الخرز تحميل الجهاز والتقنية والجدول الزمني يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. تحميل حبة يدخل تقلب منخفض في تركيز البروتين ولكن تقلب عالية في التعبير البلازميد. (أ)كانت الخلايا محملة بالخرز مع 0.5 ميكروغرام من كل من اليكسا488-مترافقة المضادة H3K27 أسيتيل فاب (الأخضر) وCy3-مترافقة المضادة RNAPII-سيرين 5-الفوسفوريلات فاب (الأحمر) في 4 ميكرولتر من حل تحميل حبة. كانت الخلايا ملطخة بال DAPI (زرقاء) ثم تم تصويرها مباشرة على الفور. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر (B) كانت الخلايا محملة بالخرز مع 0.5 ميكروغرام من بروتين فاب (Cy3-مترافقة المضادة RNAPII-سيرين 5-الفوسفوريلات البروتين، الأحمر) و 1 ميكروغرام من البلازميد ترميز فائقة المجلد GFP-H2B (الأخضر) في 4 ميكروغرام من محلول تحميل الخرز. بعد 24 ساعة، كانت الخلايا ملطخة DAPI (الأزرق) وصورت على الهواء مباشرة. أشرطة مقياس = 30 ميكرومتر (C-E) البروتين 1 (JF646-HaloLigand المسمى HaloTag-MCP)، البروتين 2 (Cy3-اقتران المضادة العلم فاب)، وترميز البلازميد EGFP (λN-EGFP-LacZ) كانت حبة محملة معا في الخلايا. تم قياس الكثافة الإجمالية في كل قناة فلورية في رقعة 1.3 × 1.3 ميكرومتر في السيتوبلازم لكل خلية. N = 25 خلية. (ج) الخلايا التمثيلية التي تعبر عن البلازميد المحمل بالخرز، λN-EGFP-LacZ. واستخدمت نفس ظروف التصوير وكثافته لجميع الخلايا. البقع هي مجاميع من البروتين المعبر عنه. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (D) يظهر الرسم البياني الكثافة الإجمالية لكل خلية إما البروتين 1 أو البروتين 2 أو EGFP المعبر عنها من البلازميد. تم تطبيع كل قناة إلى الوسيط. تم حساب قيم P التي تم تصحيحها في Bonferroni من خلال اختبار نسبة فيشر لتحديد ما إذا كان توزيع بيانات كثافة البروتين أو البلازميد له نفس التغير. تمثل كل نقطة خلية. (ه)يتم رسم الكثافة الكلية لكل من البروتينات والبروتين 1 وبلازميد، أو البروتين 2 وبلازميد، ضد بعضها البعض. يتم عرض قيم R2 المحسوبة. تمثل كل نقطة خلية. الاختصارات: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; EGFP = البروتين الفلوري الأخضر المحسن. وحدة تعسفية = MCP = بروتين معطف MS2. RNAPII = RNA بوليمراز الثاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تبقى الخلايا المحملة بالخرز ملتصقة وصحية بما يكفي للنمو والانقسام. (A)كانت خلايا U2OS محملة بالخرز مع 0.5 ميكروغرام من Cy3-المقترنة المضادة FLAG فاب في 4 ميكرولتر من حل تحميل الخرز. تم تصوير الخلايا مباشرة من قبل، مباشرة بعد تحميل الخرز، و 24 ساعة بعد تحميل الخرز. تحدد الأسهم البرتقالية المناطق التي تقشرت فيها الخلايا أثناء تحميل الخرز. أشرطة مقياس = 2 مم (ب) صورة تمثيلية من خلايا U2OS حبة محملة مكونات من (A) ولكن مع التنصت قاسية والخرز كثيرة جدا. يحدد السهم الأحمر الخرز الزجاجي الإضافي. شريط المقياس = 2 مم (C) تم تحميل خلايا U2OS مع 1.5 ميكروغرام من 14.4 كيلوبايت في الثانية سمفلاج-KDM5B-15xBoxB-24xMS2، 0.5 ميكروغرام من Cy3-اقتران المضادة FLAG فاب (الأخضر)، 130 نانوغرام من هالوتاغ-MCP (أرجواني) في 8 ميكرولتر من حل تحميل حبة. مباشرة قبل التصوير ، كانت ملطخة HaloTag مع JF646 - HaloLigand. يتم تسمية الحلقات الجذعية MS2 من الحمض النووي الريبي المنسوخة من plasmid مراسل من قبل MCP (البقع أرجواني)، وعلامة FLAG الموسومة بروتين مراسل المترجمة وصفت من قبل مكافحة FLAG فاب (كولوكاليس الأخضر إلى مرنا). ناضجة فاب المسمى البروتين ي توطين النواة. تم تصوير هذه الخلية 4-15 ساعة بعد تحميل الخرز. الأسهم الصفراء تحديد نواة الخلية قبل والنوى بعد انقسام الخلية. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر. اختصار: MCP = بروتين معطف MS2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: الاختلافات في نوع الخلية تحميل المواد من بروتوكول تحميل حبة. (أ-ب) RPE1 (A) و HeLa (B) كانت الخلايا محملة بالخرز مع 1.5 ميكروغرام من بروتين فاب النووية (المضادة RNAPII-سيرين 5-الفوسفور) في 4 ميكرولتر من محلول التحميل. يتم وضع علامة على نواة كل خلية (nuc) والسيتوبلازم (سيتوبلازم). تم تصوير الخلايا 6 ساعة بعد أن تم تحميلها حبة. أشرطة مقياس = 5 ميكرومتر (C) كانت خلايا U2OS البشرية محملة بالخرز مع كل من Cy5-RNA 9mer (أرجواني) وCy3-DNA 28mer (الأخضر) oligos ، 10 picomoles من كل منهما ، في 4 ميكرولتر من محلول تحميل الخرز. تم تصوير الخلايا 4 ساعة بعد أن تم تحميلها حبة. يتم تمييز جميع نواة الخلية بواسطة خط متقطع. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر. الاختصارات: RNAPII = RNA بوليمراز الثاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خط الخليةنوع الخليةفعالية تحميل الخرزملاحظات/ مرجع
الخلايا الجذعية (الإنسان)الخلايا الجذعية الجنينيةصعب* العديد من الخلايا تقشر أثناء تحميل الخرز إذا مطلي على لوحات مغلفة الجيلاتين
HEK 293خلايا الكلى الجنينية البشريةصعب* الحاجة إلى وضع مصفوفة هلام إلى سطح غرفة التصوير قبل تحميل حبة. اضغط برفق عند تحميل الخرز في البداية.
الخلايا العصبية (الفئران)الخلايا العصبية الجنينية الأولية (e-18)، مفككةغير فعالة جدا* لم يتم رصد تحميل حبة فعالة من الخلايا العصبية باستخدام هذا البروتوكول تحميل حبة القياسية. وهذا يمكن أن يكون بسبب الطبيعة غير الملتصقة للخلايا العصبية أو من الأضرار الناجمة عن العمليات العصبية.
MDCK (ال كلاب)مادين داربي خلايا الكلى الانظر ماكنيل وواردر (1987)14 * تحميل حبة منخفضة الكفاءة14
U2OS (الإنسان)سرطان العظامبروتوكول تحميل حبة قياسية
هيلا (الإنسان)سرطان عنق الرحمبروتوكول تحميل حبة قياسية
RPE1 (الإنسان)الخلايا الظهارية خلدت مع hTERTبروتوكول تحميل حبة قياسية
HFF (الإنسان)الخلايا الليفية القلفة الأوليةانظر بيستيرو وآخرون (2009)31 * تعديل بروتوكول إمالة بدلا من التنصت31
BALB / c 3T3 ، NIH 3T3 ، والسويسرية 3T3 (الماوس)الخلايا الليفية الجنينيةانظر جيلمور ورومر (1996)32، إيمرسون وآخرون (2014)33 وماكنيل ووردر (1987)14 *425-600 ميكرومتر حبات زجاجية تم الإبلاغ عنها32
* تستخدم 200-300 μm حبات الزجاج33
* أعطى 75 μm الخرز الزجاج نتائج أفضل من 400 ميكرومتر14
DM (مونتجاك الهندي)الخلايا الليفية الجلديةانظر ماندرز، كيمورا، وكوك (1999)34
CHO (الهامستر)خلايا المبيض الظهاريةانظر ميميدولا وبلمونت (2003)35 * تستخدم 425-600 ميكرومتر حبات زجاجية35
BAE (البقرة)الخلايا البطانية الأبهري البقري (BAEC-11)انظر ماكنيل وواردر (1987)14 * أعطى 75 μm الخرز الزجاج نتائج أفضل من 400 ميكرومتر14
PtK-2 (بوتوموس تريدكليس)خلايا الكلى الظهاريةانظر ماكنيل وواردر (1987)14 * أعطى 75 μm الخرز الزجاج نتائج أفضل من 400 ميكرومتر14
HUVEC (الإنسان)الخلايا البطانية الوريدية السريةانظر جيلمور ورومر (1996)32 * تستخدم 425-600 ميكرومتر حبات زجاجية32
J774 و J774.2 (الماوس)خلايا الضامة أحادية الخليةانظر بيكر وآخرون (2005)36 وماكنيل ووردر (1987)14 * التحريض لطيف (بدلا من التنصت) و425-600 ميكرومتر حبات الزجاج36
MS-5 (الماوس)خلايا نخاع العظم الستروماليةانظر مولنار وآخرون (2003)37
WPE1-NB11 (الإنسان)خلايا الظهارية البروستاتاانظر جيلمور ورومر (1996)32 و* تستخدم 425-600 ميكرومتر حبات زجاجية32
إيمرسون وآخرون (2014)33 * تستخدم 200-300 μm حبات الزجاج33

الجدول 1: تحميل الخرز في خطوط خلايا مختلفة. بالنسبة لخطوط الخلايا التي لم يتم تحميلها بعد في هذا المختبر ، يتم توفير مراجع وملاحظات حول الاختلافات في البروتوكول.

فيديو إضافي 1: مثال على خلية محملة بالخرز تمر بتقسيم الخلية. تم تحميل خلايا U2OS مع 1.5 ميكروغرام من 14.4 كيلوبايت في الثانية بلازميد smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2، 0.5 ميكروغرام من Cy3-اقتران المضادة FLAG فاب (الأخضر)، 130 نانوغرام من هالوتاغ-MCP (أرجواني) في 8 ميكروغرام من حل تحميل الخرز. مباشرة قبل التصوير ، كانت ملطخة HaloTag مع JF646 - HaloLigand. يتم تسمية الحلقات الجذعية MS2 من الحمض النووي الريبي المنسوخة من plasmid المراسل من قبل MCP (البقع أرجواني)، ويتم تسمية العلم الموسومة البروتين مراسل المترجمة عبر مكافحة العلم فاب (كولوكاليس الأخضر إلى ميرنا). ناضجة فاب المسمى البروتين ي توطين النواة. تم تصوير هذه الخلية 4-15 ساعة بعد تحميل الخرز. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. اختصار: MCP = بروتين معطف MS2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية تحميل الخرز الموصوفة هنا هي طريقة فعالة من حيث التكلفة وفعالة من حيث الوقت لإدخال الجزيئات الكبيرة وغيرها من الجسيمات في الخلايا الملتصقة. هذه العملية تنوعا يمكن تحميل البروتين (الشكل 2A)15،16،26،27، مزيج من البروتين وplasmids ( الشكل2B،C)22،25، RNA ( الشكل4C) ، 100 و 250 نانومتر البوليسترين الخرز (المراسلات الشخصية) ، والأصباغ الاصطناعية39 أو نقاط الكم34،400 نانومتر . قد يكون تحميل حبة القدرة على تحميل أنواع أخرى من الجسيمات الغشاء غير منفذة كذلك. التطبيق الأكثر استخداما هو لتحميل الأجسام المضادة أو فابس لاستهداف epitopes الذاتية، مثل التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs)، في الخلايا الحية. الأهداف، مثل PTMs، غالبا ما يكون من الصعب تسمية في الخلايا الحية دون تحديد PTM محددة، المجسات المشفرة وراثيا41،42. في المقابل ، يمكن تحميل حبة إدخال أنواع متعددة من المسابير ، والمراسلين ، أو غيرها من الأدوات الجزيئية معا في نفس الخلية لرصد قراءات متعددة في وقت واحد. نتوقع أن يكون تحميل الخرز تقنية مفيدة لتحميل مجموعة متنوعة من الجزيئات أو الجسيمات الكبيرة.

ميزة رئيسية لتحميل حبة هو انخفاض التكلفة: كل تجربة تكاليف أقل من 0.01 USD. ويمكن إجراء جهاز محمل حبة بسهولة باستخدام مواد غير مكلفة تكلف في المجموع ~ 150 دولارا ، وهو أقل تكلفة بكثير من أي طريقة أخرى لتحميل الخلايا. يمكن تخفيض تكلفة جهاز محمل الخرز إلى أقل من 10 دولارات عن طريق استبدال الغرفة المعدنية القابلة لإعادة الاستخدام بأخرى بلاستيكية. لهذا، إما حفر حفرة في غرفة 35 ملم أو إزالة الزجاج من غرفة 35 ملم الزجاج القاع، ثم ربط شبكة بأمان في مكان مع الشريط. بدلا من جهاز، يمكن حتى تحميل حبة يمكن القيام به باستخدام واسعة تتحمل 1000 ميكرولتر ماصة تلميح لغرف ورش الخرز على الخلايا، على الرغم من أن هذا الاختلاف يجعل من الصعب رش طبقة واحدة من الخرز على الخلايا (الخطوة 4.6).

فائدة أخرى لتحميل حبة هو أن الخلايا يمكن أن تحتفظ مورفولوجيا العام العادي، يتعافى بسرعة، والاستمرار في النمو والانقسام، على الأقل لخلايا U2OS، RPE1، وهيلا درس هنا ولخطوط الخلية الأخرى درس في مكان آخر (الشكل 3؛ الشكل 4 ألف، باء ؛ فيديو تكميلي 1؛ والجدول 1)31. أثناء تحميل الخرز ، تخضع الخلايا للإجهاد البدني وأحيانا تزيح وتقشر (~ 5٪ من الخلايا تقشر في ظل الظروف المثلى ، ولكن يمكن أن يحدث فقدان أكبر للخلية إذا تم تحميل الخرز بقوة كبيرة جدا أو يتم تحميل الكثير من الخرز الزجاجي فوق الخلايا ، كما هو موضح في الشكل 3B). ومع ذلك، عادة ما تظهر الخلايا المحملة بالخرز التي تظل متصلة بالقطعة الأغطية صحية ويمكن تصويرها في أقرب وقت 30 دقيقة بعد تحميل الخرز(الشكل 3A). نسمح للخلايا بشكل عام بفترة استرداد مدتها 30 دقيقة ولكن نتوقع أن يكون التصوير في وقت أقرب بعد تحميل الخرز ممكنا.

عيب رئيسي في هذه التقنية هو أن الخلايا تحتاج إلى أن تكون قادرة على تحمل الإجهاد البدني البسيط أثناء التحميل وتبقى ملتزمة بشكل آمن بالزلاقة. خطوط الخلايا سيئة / غير الملتصقة أو الخلايا التي تزرع على لوحات مغلفة (على سبيل المثال، HEK والخلايا الجذعية) غالبا ما تنفصل عند التنصت لطيف أثناء تحميل حبة. علاوة على ذلك، أظهرت التجربة أن الخلايا العصبية الأولية حساسة جدا لتحميل الخرز.

تحميل حبة هو الأنسب للتجارب وحيد الخلية أو جزيء واحد. في تجربتنا، تحميل حبة لديه ما يقرب من 20-40٪ كفاءة تحميل البروتين، و ~ 20٪ من الخلايا المحملة بالخرز وأعرب أيضا عن بلازميد محملة المشاركة (الشكل 2A،B). وهكذا، قد يكون تحميل الخرز البلازميدات أقل كفاءة للتعبير عن البروتين من حبة تحميل البروتينات المنقى لأن البلازميدات يجب أن لا تدخل الخلايا فقط ولكن أيضا أن أعرب (الذي ينطوي، من بين أمور أخرى، استيراد النووية، والنسخ، والترجمة، كل منها يمكن أن تقلل من كفاءة التعبير). يمكن التحايل على الكفاءة المنخفضة للتعبير البلازميد المحمل بالخرز باستخدام بروتوكولات العدوى البديلة ، مثل شفط الدهون ، قبل تحميل حبة البروتينات أو المسابير16،27. بالإضافة إلى ذلك، قد تساعد احتضان الخلايا في الوسائط المثلى لمدة 30 دقيقة قبل تحميل الخرز في التعبير البلازميد. بسبب انخفاض تعبير البلازميد ، لم يتم استخدام تحميل الخرز في كثير من الأحيان كبديل لإصابة العدوى القائمة على شفط الدهون في هذا المختبر. الاستثناء الوحيد هو عندما البروتين المنقى، مثل فاب، هو أن تكون محملة مشتركة، وفي هذه الحالة هو مريح جدا لتحميل حبة البروتين وبلازميد في نفس الوقت. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للخلايا التي لا تستجيب أو غير متسامحة مع شفط الدهون، قد يوفر تحميل الخرز طريقة بديلة، وإن كانت منخفضة الكفاءة، للتعبير البلازميد العابر.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون لأعضاء مختبر ستاسيفيتش على المحادثات التي لا حصر لها التي ساعدت على تحسين وتطوير هذا البروتوكول. على وجه التحديد، الدكتور ليندا فوردو والدكتور فوكس للحصول على المشورة بشأن حبة تحميل أنواع مختلفة من الخلايا. ونود أن نشكر بإخلاص الدكتور يوكو هاياشي - تاكاناكا، والدكتور يوكو ساتو، والدكتور هيروشي كيمورا على تقاسم بروتوكول تحميل الخرز الزجاجي. نحن ممتنون جدا للدكتور أشوك براساد والدكتور دييغو كرابف لتقاسم بسخاء بروتوكولات تحميل الخرز لإدخال الجسيمات غير العضوية في الخلايا. ونحن ممتنون للدكتور ترافيس ساندرز، كريغ مارشال، والدكتور توماس سانتانجيلو لتقاسم بسخاء كاشف الحمض النووي الريبي المسمى. تم دعم ALK و MNS و CAC و GG و TJS من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R35GM119728 ومنحة المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) المهنية MCB-1845761 ، وكلاهما إلى TJS. كما تم دعم CAC من قبل NRT NRT NSF جائزة DGE-1450032.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطباق زراعة الخلايا مقاس 10 سمVWR82050-916استخدم لزراعة الخلايا
أطباق زراعة الخلايا 35 ممFalcon353001استخدم لبناء محمل حبة
Attofluor غرفة الخليةThermo Fisher ScientificA7816استخدم لبناء محمل الخرز المخصص
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، لا يوجد جلوتامينThermo Fisher Scientific11960069الاستخدام في الخلية العامة ثقافة
Drierite تشير إلى المواد الماصةThermo Fisher Scientific07-578-3Bقم بتخزين محمل الخرز في مجفف مع هذه الكريات الماصة
مصل الأجنينAtlas BiologicsF-0050-Aاستخدم في زراعة الخلايا العامة وكملحق قبل تحميل
الخرز الزجاجي ، مغسول بالحمض ، & 106 وميكرو ؛ m *Millipore SigmaG4649يرش على الخلايا لتحميل حبة الحمض النووي البلازميد والبروتينات
أطباق القاع الزجاجي ، 35 مم ، # 1.5 ، زجاج 14 ممMatTek CorporationP35G-1.5-14-Cخلايا البذور على هذه الغرف لتصوير
L-Glutamine-200 mMThermo Fisher Scientific25030081استخدامها لصنع DMEM + وسائط
Opti-MEM ، مصل منخفض متوسطحراري فيشر علمي31985070الوسائط المثلى لاحتضان الخلايا قبل تحميل الخرزة (خطوة اختيارية)
فيلم شمعي ParafilmVWR52858-032يستخدم لبناء محمل الخرزة
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140-122استخدم لصنع DMEM + وسائط
Thermo Fisher Scientific31053036الفينولاستخدمها على الخلايا قبل التصوير
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625المعقم 1X PBS
(NaOH) ThermoFisher ScientificS318-500استخدم محلول 2 متر لغسل الخرز الزجاجي
مرشحات منسوجة شبكية طيفية ، بولي بروبيلين ، 105 وميكرو ؛ م فتحمختبراتالطيف 148496استخدامها لبناء محمل الخرز
TrypsinThermo Fisher Scientific25300062استخدامها في زراعة الخلايا العامة
DMEM خالية من مخزون عمل من هيدروكسيد الصوديوم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stewart, M. P., et al. In vitro and ex vivo strategies for intracellular delivery. Nature. 538 (7624), 183-192 (2016).
  2. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  3. Schenborn, E. T., Goiffon, V. DEAE-dextran tansfection of mammalian cultured cells. Methods in Molecular Biology. 130, 147-153 (2000).
  4. Celis, J. E. Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques. Biochemical Journal. 223 (2), 281-291 (1984).
  5. Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. Journal of Biological Chemistry. 264 (26), 15494-15500 (1989).
  6. Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. American Journal of Physiology. 260 (2), 355-363 (1991).
  7. Potter, H. Transfection by electroporation. Current Protocols in Molecular Biology. 62 (1), 1-6 (2003).
  8. Fawell, S., et al. Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (2), 664-668 (1994).
  9. Prior, T. I., FitzGerald, D. J., Pastan, I. Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol. Biochemistry. 31 (14), 3555-3559 (1992).
  10. Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3185-3190 (2001).
  11. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Reports. 13 (8), 709-715 (2012).
  12. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98 (4), 1556-1564 (1984).
  13. Ortiz, D., Baldwin, M. M., Lucas, J. J. Transient correction of genetic defects in cultured animal cells by introduction of functional proteins. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 3012-3017 (1987).
  14. McNeil, P. L., Warder, E. Glass beads load macromolecules into living cells. Journal of Cell Science. 88 (5), 669-678 (1987).
  15. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Research. 39 (15), 6475-6488 (2011).
  16. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352 (6292), 1425-1429 (2016).
  17. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  18. Zhao, N., et al. A genetically encoded probe for imaging nascent and mature HA-tagged proteins in vivo. Nature Communications. 10 (1), 2947(2019).
  19. Jedlitzke, B., Mootz, H. D. Photocaged nanobodies delivered into cells for light activation of biological processes. ChemPhotoChem. 5 (1), 22-25 (2021).
  20. Coulon, A., et al. Kinetic competition during the transcription cycle results in stochastic RNA processing. eLife. 3, 03939(2014).
  21. Pichon, X., Robert, M. -C., Bertrand, E., Singer, R. H., Tutucci, E. New generations of MS2 variants and MCP fusions to detect single mRNAs in living eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. 2166, 121-144 (2020).
  22. Koch, A., et al. Quantifying the dynamics of IRES and cap translation with single-molecule resolution in live cells. Nature Structural & Molecular Biology. 27, 1095-1104 (2020).
  23. Moon, S. L., et al. Multicolor single-molecule tracking of mRNA interactions with RNP granules. Nature cell biology. 21 (2), 162-168 (2019).
  24. Moon, S. L. Coupling of translation quality control and mRNA targeting to stress granules. Journal of Cell Biology. 219 (8), 202004120(2020).
  25. Cialek, C. A., et al. Imaging translational control by Argonaute with single-molecule resolution in live cells. bioRxiv. , (2021).
  26. Forero-Quintero, L. S., et al. Live-cell imaging reveals the spatiotemporal organization of endogenous RNA polymerase II phosphorylation at a single gene. bioRxiv. , (2020).
  27. Lyon, K., Aguilera, L. U., Morisaki, T., Munsky, B., Stasevich, T. J. Live-cell single RNA imaging reveals bursts of translational frameshifting. Molecular Cell. 75 (1), 172-183 (2019).
  28. JoVE. Introduction to Fluorescence Microscopy. General Laboratory Techniques. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
  29. Hayashi-Takanaka, Y., Yamagata, K., Nozaki, N., Kimura, H. Visualizing histone modifications in living cells: spatiotemporal dynamics of H3 phosphorylation during interphase. Journal of Cell Biology. 187 (6), 781-790 (2009).
  30. Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Analysis of cell viability by the MTT assay. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  31. Stasevich, T. J., et al. Regulation of RNA polymerase II activation by histone acetylation in single living cells. Nature. 516 (7530), 272-275 (2014).
  32. Besteiro, S., Michelin, A., Poncet, J., Dubremetz, J. -F., Lebrun, M. Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion. PLOS Pathogens. 5 (2), 1000309(2009).
  33. Gilmore, A. P., Romer, L. H. Inhibition of focal adhesion kinase (FAK) signaling in focal adhesions decreases cell motility and proliferation. Molecular Biology of the Cell. 7 (8), 1209-1224 (1996).
  34. Emerson, N. T., Hsia, C. -H., Rafalska-Metcalf, I. U., Yang, H. Mechanodelivery of nanoparticles to the cytoplasm of living cells. Nanoscale. 6 (9), 4538-4543 (2014).
  35. Manders, E. M. M., Kimura, H., Cook, P. R. Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics of chromosome formation. Journal of Cell Biology. 144 (5), 813-822 (1999).
  36. Memedula, S., Belmont, A. S. Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16. Current Biology. 13 (3), 241-246 (2003).
  37. Becker, T., Volchuk, A., Rothman, J. E. Differential use of endoplasmic reticulum membrane for phagocytosis in J774 macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4022-4026 (2005).
  38. Molenaar, C., et al. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes. The EMBO Journal. 22 (24), 6631-6641 (2003).
  39. Jones, S. A., Shim, S. -H., He, J., Zhuang, X. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nature Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
  40. Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells. Physical Review Letters. 125 (5), 053901(2020).
  41. Sato, Y., et al. Genetically encoded system to track histone modification in vivo. Scientific Reports. 3, 2436(2013).
  42. Sato, Y., Stasevich, T. J., Kimura, H. Visualizing the dynamics of inactive X chromosomes in living cells using antibody-based fluorescent probes. X-Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, Humana. New York, NY, USA. 91-102 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة