Method Article

استخدام تسلسل الجيل التالي لتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح كسر الخيط المزدوج الناجم عن CAS9 بالقرب من مروج CD4

DOI:

10.3791/62583

⸱

March 31st, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Kansas State Veterinary Diagnostic Laboratory, Kansas State University, 3Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology, Kansas State University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر هنا إندونوكلياز sgRNA/CAS9 وبروتوكول تسلسل الجيل التالي الذي يمكن استخدامه لتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح كسر الخيط المزدوج بالقرب من مروج CD4.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) في الحمض النووي هي النوع الأكثر سمية للخلايا من تلف الحمض النووي. نظرا لأن عددا لا يحصى من الإهانات يمكن أن يؤدي إلى هذه الآفات (على سبيل المثال ، إجهاد النسخ المتماثل ، والإشعاع المؤين ، وتلف الأشعة فوق البنفسجية غير المصلحة) ، تحدث DSBs في معظم الخلايا كل يوم. بالإضافة إلى موت الخلايا ، تقلل DSBs التي لم يتم إصلاحها من سلامة الجينوم ويمكن أن تؤدي الطفرات الناتجة إلى تكوين الأورام. هذه المخاطر وانتشار DSBs يحفز التحقيقات في الآليات التي تقوم الخلايا من خلالها بإصلاح هذه الآفات. يمكن إقران تسلسل الجيل التالي بتحريض DSBs عن طريق الإشعاع المؤين لتوفير أداة قوية لتحديد الطفرات المرتبطة بعيوب إصلاح DSB بدقة. ومع ذلك، يتطلب هذا النهج تحديا حسابيا وتكلفة باهظة لتسلسل الجينوم الكامل للكشف عن إصلاح DSBs التي تحدث بشكل عشوائي المرتبطة بالإشعاع المؤين. توفر الإندونوكليز النادرة القطع ، مثل I-Sce1 ، القدرة على توليد DSB واحد ، ولكن يجب إدخال مواقع التعرف عليها في الجينوم محل الاهتمام. ونتيجة لذلك ، فإن موقع الإصلاح مصطنع بطبيعته. تسمح التطورات الحديثة لتوجيه الحمض النووي الريبي (sgRNA) بتوجيه إندونوكليز Cas9 إلى أي موضع جينوم ذي أهمية. يمكن تطبيق ذلك على دراسة إصلاح DSB مما يجعل تسلسل الجيل التالي أكثر فعالية من حيث التكلفة من خلال السماح له بالتركيز على الحمض النووي المحيط ب DSB الناجم عن Cas9. الهدف من المخطوطة هو إثبات جدوى هذا النهج من خلال تقديم بروتوكول يمكنه تحديد الطفرات التي تنبع من إصلاح DSB في المنبع من جين CD4. يمكن تكييف البروتوكول لتحديد التغيرات في الإمكانات الطافرة ل DSB المرتبطة بالعوامل الخارجية ، مثل مثبطات الإصلاح ، والتعبير عن البروتين الفيروسي ، والطفرات ، والتعرض البيئي مع متطلبات حسابية محدودة نسبيا. بمجرد تسلسل جينوم الكائن الحي ، يمكن استخدام هذه الطريقة نظريا في أي موضع جينومي وفي أي نموذج لزراعة الخلايا لهذا الكائن الحي يمكن نقله. ويمكن أن تسمح التعديلات المماثلة للنهج بإجراء مقارنات بين دقة الإصلاح بين مواقع مختلفة في نفس الخلفية الجينية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحفاظ على الاستقرار الجينومي أمر بالغ الأهمية لجميع الكائنات الحية. يعد تكرار الحمض النووي الدقيق والاستجابة القوية لتلف الحمض النووي (DDR) ضروريين لنشر المادة الوراثية بأمانة 1,2. تحدث أضرار الحمض النووي بانتظام في معظم الخلايا 2,3. عندما يتم استشعار هذه الأضرار ، يتم إيقاف تقدم دورة الخلية ، ويتم تنشيط آليات إصلاح الحمض النووي. فواصل الخيوط المزدوجة في الحمض النووي أو DSBs هي النوع الأكثر سمية وطفرا من تلف الحمض النووي 3,4.

في حين أن العديد من مسارات إشارات DDR يمكن أن تصلح هذه الآفات ، فإن مسارات إصلاح DSB الأكثر دراسة بدقة هي إعادة التركيب المتماثلة (HR) والانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ). الموارد البشرية هي مسار خال من الأخطاء إلى حد كبير يقوم بإصلاح DSB باستخدام كروماتيد شقيق كقالب متماثل. يميل هذا إلى الحدوث في المرحلة S والمرحلة G2 من دورة الخلية 5,6,7. NHEJ أكثر عرضة للخطأ ، ولكن يمكن أن يحدث طوال دورة الخلية 8,9. تم تطوير العديد من اختبارات المراسلين لقياس كفاءة آليات الإصلاح المحددة 10،11،12. تميل هذه الفحوصات إلى الاعتماد على قياس التدفق الخلوي لقياس الإنتاجية العالية لنشاط مسار إصلاح DSB باستخدام GFP أو mCherry كقراءة11,13. على الرغم من كفاءتها العالية ، إلا أنها تعتمد على الإصلاح الأساسي الذي يحدث في DSB الذي تم تقديمه بشكل مصطنع.

هناك مجموعة متنوعة من الطرق الأخرى المستخدمة لدراسة إصلاح DSB. يعتمد العديد من هذه على الفحص المجهري للتألق المناعي (IF) 1,14. إذا اكتشف الفحص المجهري البؤر النووية المنفصلة الممثلة لمجمعات الإصلاح بعد أن يتم تحفيز DSBs عن طريق التعرض للمواد الكيميائية السامة وراثيا أو الإشعاع المؤين15,16. يوفر تتبع تكوين هذه البؤر وحلها مؤشرا على بدء الإصلاح والانتهاء منه ، على التوالي14,17. ومع ذلك ، فإن طرق تحريض DSB هذه (أي المواد الكيميائية أو الإشعاع المؤين) لا تسبب DSBs في مواقع محددة في الجينوم. كما أنه من المستحيل وظيفيا استخدامها لحث عدد صغير فقط (على سبيل المثال ، 2-4) من DSBs. ونتيجة لذلك ، فإن الطرق الأكثر استخداما لتحفيز DSBs تسبب العديد من الآفات الموزعة عشوائيا في جميع أنحاء الجينوم18. يمكن إدخال عدد صغير من DSBs عن طريق إدخال موقع التعرف على endonuclease نادر القطع والتعبير عن endonuclease ذات الصلة ، مثل I-Sce119. لسوء الحظ ، فإن التكامل المطلوب للموقع المستهدف يمنع فحص DSB في المواقع الجينومية الذاتية.

تصف هذه المخطوطة طريقة للكشف عن الطفرات المرتبطة بإصلاح DSB الذي تم إنشاؤه في موضع محدد من قبل المستخدم. نحن نقدم مثالا تمثيليا للنهج المطبق لتقييم قدرة البروتين الفيروسي على زيادة عدد الطفرات المرتبطة ب DSB. على وجه التحديد، تصف هذه المخطوطة استخدام الحمض النووي الريبي (sgRNA) لتوجيه إندونوكلياز CAS9 لحث DSB في إطار القراءة المفتوح CD4 البشري في الخلايا الكيراتينية القلفة البشرية التي تعبر عن مكافحة النواقل (HFK LXSN) و HFK التي تعبر عن بروتين E6 لفيروس الورم الحليمي البشري من النوع 8 (HFK 8E6). يسمح تسلسل الجيل التالي المستهدف (NGS) للمنطقة المحيطة بالكسر بتحديد الطفرات المرتبطة بإصلاح الآفة بدقة. تظهر هذه البيانات أن البروتين الفيروسي يسبب زيادة حوالي 20 ضعفا في الطفرات أثناء إصلاح DSB. كما أنه يوفر توصيفا غير متحيز للعواقب الطافرة ل DSBs في موضع واحد دون الحاجة إلى تسلسل الجينوم الكامل. من حيث المبدأ، يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لمقارنة المخاطر النسبية للطفرات بين مواقع الجينوم أو خطوط الخلايا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. طلاء الخلايا

  1. تنمو خلايا HFK LXSN و HFK 8E6 في ألواح 10 سم في وسائط زراعة الخلايا الكيراتينية (10 مل / لوحة) مع ملحق نمو الخلايا الكيراتينية البشرية (HKGS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. تنمو الخلايا إلى حوالي 80٪ من الالتقاء عند 37 درجة مئوية في حاضنة سترة مع 5٪ CO2.
  2. استبدل وسائط الاستزراع ب 3 مل من التربسين-EDTA (0.05٪ ، حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك). تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تحييد التربسين مع حجم متساو من المصل البقري الجنيني (FBS) تكملة الوسائط ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  3. أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على 10 مل من وسائط زراعة الخلايا الكيراتينية باستخدام HKGS. تحديد تركيز الخلايا باستخدام مقياس الدم.
  4. لوحة 4 × 105 خلايا / لوحات 6 سم (البذور لوحين ل HFK LXSN ولوحين ل HFK 8E6) في 4 مل من وسائط زراعة الخلايا الكيراتينية مع HKGS و 1 ٪ البنسلين والستربتومايسين. تنمو عند 37 درجة مئوية في حاضنة سترة مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: تم اختيار تحليل خلايا HFK لهذا البروتوكول لسببين. أولا ، HFK هو خط خلية يصعب نقله. وبالتالي ، من خلال إثبات أن البروتوكول يعمل في خط الخلايا هذا ، يتم تقديم أدلة على أنه من المحتمل أن يعمل في خلايا أكثر استخداما وأكثر سهولة في النقل. ثانيا ، تظهر البيانات المنشورة سابقا أن البروتين الفيروسي (8E6) يعيق إصلاح فواصل الخيوط المزدوجة في الحمض النووي20،21،22. وبالتالي ، فإن مقارنة HFK LXSN و HFK 8E6 تسمح لنا بإثبات قدرة الفحص على اكتشاف الزيادات في الطفرات المرتبطة بانخفاض في قدرة الإصلاح الخلوي.

2. النقل

  1. في يوم النقل (24 ساعة بعد الطلاء) ، استبدل الوسائط ب 3 مل من الوسائط المكملة الخالية من المضادات الحيوية. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة سترة.
  2. نقل الخلايا مع كواشف النقل المناسبة القائمة على الدهون وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. قم بتسخين كواشف النقل إلى درجة حرارة الغرفة وماصة بلطف قبل الاستخدام.
    2. لكل خط خلية (HFK LXSN و HFK 8E6) ، ضع كمية مناسبة من المخزن المؤقت للنقل (حسب توجيهات الشركة المصنعة) في أنبوب طرد مركزي معقم 1.5 مل (أنبوب 1). قم بتضمين أنبوب آخر بنفس الكمية من المخزن المؤقت للنقل (النقل الوهمي أو الأنبوب 2).
    3. أضف 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي الذي يعبر عن CAS9 / sgRNA الذي يستهدف CD4 البشري (px330-CD4 ، 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT) إلى الأنبوب 1 من الخطوة 2.2.2. ماصة بلطف لتخلط تماما. أضف كمية متساوية من الماء المعقم إلى الأنبوب 2.
    4. قم بتضمين لوحة تحكم مع كواشف نقل وحدها (بدون بلازميد) لكل خط خلية.
      ملاحظة: تعمل اللوحة الثانية كعنصر تحكم سلبي في التجربة ، مما يسمح للمستخدم بتأكيد أن النقل باستخدام CAS9 / sgRNA غير مسؤول عن أي طفرات.
    5. أضف كمية مناسبة من كاشف النقل (حسب توجيهات الشركة المصنعة) إلى الأنبوب مع خليط الحمض النووي (الأنبوب 1) من الخطوة 2.2.3 والنقل الوهمي (الأنبوب 2) من الخطوة 2.2.2. ماصة بلطف لتخلط تماما. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة لإتاحة الوقت الكافي لتشكيل المجمعات.
    6. يضاف خليط النقل إلى الطبق. هز الثقافة بلطف لمدة 1 دقيقة لتوزيع خليط النقل بالتساوي.
  3. احتضان لمدة 48 ساعة بعد النقل للسماح CAS9 التعبير.
  4. حصاد الخلايا عن طريق التربسين.
    1. استبدل وسائط الاستزراع ب 1 مل من التربسين-EDTA (0.05٪ ، حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك). تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. قم بتحييد التربسين مع حجم متساو من الوسائط المكملة من FBS.
    2. لكل صفيحة من الخلايا ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة مع أليكوتات متساوية. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية من أنبوب واحد في الخطوة 2.4.2 في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للتسلسل. أعد تعليق الأنبوب الآخر من الخطوة 2.4.2 باستخدام PBS المثلج البارد للحصول على لطخة مناعية.
  5. حصاد الخلية بأكملها lysates لبقعة مناعية.
    1. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من السوبرناتانت.
    2. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفحص الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA lysis buffer) ممزوجا بمثبط الأنزيم البروتيني بنسبة 1٪ ومثبط فوسفاتيز بنسبة 1٪ في الأنبوب ، واخلطه جيدا مع ماصة واحتضنه لمدة 10 دقائق على الجليد.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت لتحلل RIPA على 10 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ؛ 1 ملليمتر EDTA. 0.5 mM EGTA ؛ 1 ٪ تريتون X-100 ؛ 0.1 ٪ ديوكسيكولات الصوديوم. 0.1٪ SDS ؛ 140 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، والمياه منزوعة الأيونات.
    3. تحلل أجهزة الطرد المركزي عند 13000 × g لمدة 10 دقائق. جمع supernatants لبقعة المناعة.

3. قياس تعبير CAS9 عن طريق اللطخة المناعية

  1. حدد تركيز البروتين باستخدام فحص حمض البيتشينكونينيك (BCA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بتشغيل 20 ميكروغرام من البروتين لكل عينة في آبار هلام 3٪ -8٪ Tris-acetate لمدة 150 دقيقة ونقل شبه جاف (10 فولت لمدة 30 دقيقة ثم 25 فولت لمدة 12 دقيقة) إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين.
  3. بعد سد الغشاء في 5٪ حليب جاف خالي الدسم في PBS مع 0.1٪ توين (PBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، أضف الأجسام المضادة المضادة CAS9 (1: 1000) والمضادة ل GAPDH (1: 1000). احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. بعد غسل الغشاء باستخدام PBST ، احتضن الغشاء بجسم مضاد ثانوي في حليب جاف خالي الدسم بنسبة 5٪ في PBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتصوير اللطخة وحدد مستوى CAS9 بواسطة قياس الكثافة23. انظر الشكل 1 للحصول على لطخة تمثيلية.
    ملاحظة: يمكن استخدام الكشف عن تكوين بؤر H2AX (S139) المفسفرة بواسطة الفحص المجهري الفلوري المناعي للتحقق من صحة نشاط CAS914. من المتوقع وجود عدد قليل من البؤر المميزة (عادة 1-4 بؤر) اعتمادا على موضع دورة الخلية ، وما إذا كانت الطفرات في الموقع المستهدف CAS9 تمنع المزيد من القطع ، وعدد نسخ موقع القطع CAS9 الموجودة في الجينوم محل الاهتمام. تظهر صورة تمثيلية في الشكل 2.

4. استخراج الأحماض النووية وتوليد الأمبليكون

  1. استخراج الحمض النووي من عينات الخلايا من الخطوة 2.4.3 باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي ، كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة.
  2. أعد تعليق الاشعال مع المذيب المشار إليه وفقا لورقة البيانات. تمييع مع نفس الكاشف إلى 20 ميكرومتر وتجمع 20 ميكرومتر الاشعال في حمامات السباحة المشار إليها.
    ملاحظة: تجمع التمهيدي مدرج في الجدول التكميلي 1.
  3. قم بإنشاء مزيج رئيسي PCR باستخدام بوليميراز Taq طويل التضخيم لكل تجمع تمهيدي 20 ميكرومتر كما هو محدد في الجدول 1.
    1. أضف 21 ميكرولتر من الخلطات الرئيسية لفصل أنابيب PCR.
  4. أضف 4 ميكرولتر من العينة المستهدفة (100 نانوغرام / ميكرولتر) من الخطوة 4.1 إلى أنابيب فحص PCR التي تحتوي على أنابيب فحص ماسترميكس وغطاء. ضمان ردود فعل منفصلة لكل تجمع تمهيدي.
    1. دوامة لخلط أنابيب فحص PCR وأجهزة الطرد المركزي (الدوران السريع) لإزالة القطرات من أغطية الأنبوب.
    2. ضع أنابيب PCR على آلة تدوير حراري تقليدية.
    3. برنامج جهاز PCR كما هو محدد في الجدول 2.
    4. قم بتشغيل البرنامج على جهاز تدوير حراري.

5. تنظيف PCR

  1. قم بإزالة الاشعال من تفاعلات PCR باستخدام نظام تنظيف PCR القائم على الخرز.
    1. قم بإزالة حبات التنظيف من الثلاجة قبل 30 دقيقة من الاستخدام.
    2. حبات دوامة قبل وقت طويل من الاستخدام وضمان إنعاش جميع الخرز.
    3. أضف 30 ميكرولتر (1.2x) من الخرز المعاد تعليقه إلى كل بئر من صفيحة بئر عميقة من 96 بئرا.
    4. أضف 25 ميكرولتر من تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الآبار التي تحتوي على الخرز.
    5. ضع اللوحة على شاكر الطبق عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين.
    6. اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بعد الاهتزاز.
    7. ضع صفيحة البئر العميقة على مغناطيس صفيحة 96 بئرا واحتضنها لمدة 2 دقيقة.
    8. قم بإزالة والتخلص من supernatant دون الخرز المزعج.
    9. بينما تبقى اللوحة على المغناطيس ، أضف 180 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول واحتضنها لمدة 30 ثانية. قم بإزالة وتجاهل supernatant.
    10. كرر الخطوة 5.1.9.
    11. باستخدام ماصة 10 ميكرولتر ، قم بإزالة والتخلص من أي سائل متبقي من الآبار.
    12. اترك الخرز ليجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    13. أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز إلى الآبار التي تحتوي على الخرز وقم بإزالة الصفيحة من المغناطيس.
    14. رج اللوحة عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
    15. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    16. ضع اللوحة على حامل مغناطيسي واحتضنها لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    17. قم بإزالة السوبرناتانت إلى لوحة PCR ثانية تحمل علامة PCR. هذا يحتوي على الحمض النووي الذي تم تنظيفه.
  2. قياس تركيز كل تفاعل باستخدام مقياس الفلورومتر.
    1. تأكد من أن كواشف الفلورومتر dsDNA في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإعداد أنابيب فحص الفلورومترية بالإضافة إلى أنبوبين إضافيين للمعايير.
    3. أضف 199 ميكرولتر من حل عمل dsDNA 1x إلى جميع الأنابيب باستثناء أنبوبين. أضف 190 ميكرولتر من محلول العمل إلى آخر أنبوبين.
    4. أضف 10 ميكرولتر من المعيارين (المدرجين في جدول المواد) لفصل أنابيب الفحص.
    5. أضف 1 ميكرولتر من كل تفاعل PCR إلى أنابيب ماسترميكس الفلورومترية.
    6. دوامة أنابيب لخلط وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    7. على الشاشة الرئيسية لمقياس الفلورومتر، حدد الزر الذي يستخدم مجموعة أدوات الفحص (1x dsDNA) ثم حدد قراءة المعايير وتشغيل العينات.
    8. أدخل أنبوب قياسي 1 ، وحدد الزر قراءة ثم كرر للمعيار 2.
    9. بعد الخطوة 5.2.6 ، كرر لعينة واحدة ، حدد حجم عينة من 1 ميكرولتر وسيتم توفير التركيز الناتج.
    10. كرر الخطوة 5.2.7 للعينات المتبقية.
  3. احسب المرارة المتوقعة لجميع التفاعلات وتجمع تركيزات متساوية من التفاعلات من كل عينة فردية على حدة (تجمع نهائي واحد لكل عينة) باستخدام المعادلة أدناه.
    figure-protocol-1
    1. كرر الخطوات من 5.2.1 إلى 5.2.7 للحصول على تركيز التجمع النهائي.
  4. تحقق من تجمع الأمبليكون على آلة الرحلان الكهربائي الشعري / هلام الأغاروز كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة.
    1. تحضير أنابيب الرحلان الكهربائي الشعري للعدد المناسب من العينات. أضف 7 ميكرولتر من مخزن الحمض النووي المخزن المؤقت كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة.
    2. أضف 4 ميكرولتر من تجمع الأمبليكون إلى الأنبوب الذي يحتوي على مخزن الحمض النووي.
    3. ضع الأنابيب على آلة الرحلان الكهربائي وقم بتشغيل الجهاز كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة ل dsDNA.
    4. عرض صور هلام الرحلان الكهربائي لضمان توطين النطاقات إلى ~ 5 كيلو بايت (حجم الأمبليكونات).
  5. احسب المرارة المتوقعة لجميع التفاعلات وتجمع تركيزات متساوية من التفاعلات من كل عينة فردية على حدة (تجمع نهائي واحد لكل عينة) باستخدام المعادلة أدناه.
    figure-protocol-2

6. إعداد المكتبة

  1. تمييع تجمعات العينات من الخطوة 5.3.1 إلى 0.2 نانوغرام/ميكرولتر لإعداد المكتبة.
    1. باستخدام مجموعة أدوات إعداد مكتبة منخفضة الإدخال متوافقة مع التسلسلات القصيرة (300 بت في الثانية) قم بإعداد المكتبات باستخدام مجموعات فهرس فريدة لكل تجمع عينات تم إنشاؤه في الخطوة 5.3 باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتحديد تسلسلات الفهرس. ستعمل جميع الفهارس القابلة لمجموعة أدوات إعداد المكتبة مع العينات.
    2. بعد إعداد المكتبة ، قم بتجميع جميع العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: قبل إنشاء تجمع المكتبة، احسب عدد مرات القراءة اللازمة لتغطية 250x للتسلسل المستهدف وتأكد من أن خرطوشة التسلسل المحددة يمكن أن توفر تغطية كافية لكل عينة مضمنة. بالنسبة لإجمالي 0.5 ميجابايت ، سيعادل هذا 1 مليون قراءة.
  2. قم بإعداد تجمع المكتبة للتسلسل.
    1. قم بإذابة وإعداد خرطوشة 300 دورة وكواشف تسلسل.
    2. قم بتشويه وتخفيف تجمع التسلسل الذي تم إنشاؤه في الخطوة 5.1.1 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لجهاز التسلسل.
    3. أضف تجمع مكتبة مشوه ومخفف إلى كواشف التسلسل وقم بتشغيل جهاز التسلسل كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة.
      ملاحظة: راجع الجدول 3 المرفق للاطلاع على عمليات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

7. تحليل البيانات

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات البيانات في برنامج تحليل البيانات الجينومية. تشير الأقواس إلى إدخال المستخدم. يشير أكبر من علامة إلى ترتيب نقرات الماوس لأي خطوة معينة (على سبيل المثال ، 1 st mouse click > 2nd mouse click)

  1. استيراد القراءات بالنقر فوق فتح البرامج > استيراد > Illumina > حدد الملفات > التالي > حدد الموقع لحفظ > النهاية. ستظهر القراءات الآن في البرنامج.
  2. قص وتصفية القراءات.
    1. في برنامج تحليل بيانات التسلسل العميق، قم بقص المعلمات الافتراضية للقراءات الخام.
    2. قم بتمييز القراءات وانقر فوق مربع الأدوات > إعداد بيانات التسلسل > قص > > التالي > التالي > التالي > التالي > > التالي (حدد الموقع للحفظ) > إنهاء
  3. قم بتعيين القراءات المقتطعة كمرجع.
    1. يقرأ الخريطة المقتطع إلى التسلسل المرجعي المستخدم في الخطوة 4.1 باستخدام درجة مطابقة 2 وتكلفة عدم تطابق 3 وتكاليف إدراج/حذف 2. تأكد من أن كسر الطول أعلى من 0.7 وكسر التشابه عند أو أعلى من 0.8.
    2. قم بتمييز ملف القراءة المقتطع وانقر فوق مربع الأدوات > تحليل التسلسل > يقرأ الخريطة إلى مرجع > > التالي (تحديد تسلسل مرجعي) > التالي > ( تأكد من الإشارة إلى المعلمات كما هو موضح أعلاه) > التالي > حفظ > (تحديد الموقع المراد حفظه) > إنهاء.
  4. استخراج المتغيرات و indels.
    1. باستخدام متصل indel مناسب ، قم باستخراج indels باستخدام عتبة قيمة p تبلغ 0.005 أو أقل والحد الأقصى لعدد حالات عدم التطابق 3.
    2. قم بتمييز ملف القراءة المعين وانقر فوق مربع الأدوات > تحليل التسلسل > اكتشاف المتغيرات > Indels والمتغيرات الهيكلية > التالي > (تأكد من أن الأهمية المطلوبة هي الإدخال > التالي > حفظ > (حدد الموقع للحفظ) > Finish.
    3. باستخدام متغير مناسب ، استدعاء المتغيرات من تعيين القراءة باستخدام دلالة 5٪.
    4. قم بتمييز ملف القراءة المعين وانقر فوق مربع الأدوات > تحليل التسلسل > الكشف عن المتغيرات > الكشف عن المتغيرات منخفضة التردد > التالي > (تأكد من أن الأهمية المطلوبة هي الإدخال > التالي > التالي > حفظ > (حدد الموقع للحفظ) > إنهاء.
      ملاحظة: تأكد من حساب الصبغي للجينوم المضيف في المتصلين بالإندل والمتغيرين. لا تستخرج الطفرات أقل من 5٪. هذه العتبة تمثل PCR وأخطاء التسلسل المرتبطة بالفحص. يجب أن يتم التطبيع (بناء على اكتشاف البقع المناعية ل CAS9) عن طريق ضبط تغطية التسلسل. على سبيل المثال، إذا كانت العينة A لديها ضعف كفاءة النقل للعينة B، فيجب استخدام 50٪ من القراءات من العينة A للتحليل. يجب أن يتم ذلك عن طريق أخذ عينات عشوائية وعدم تقليل التغطية لأي عينة أقل من 100x.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتعرض ثلاث نتائج تمثيلية لهذا البروتوكول. الشكل 1 هو لطخة مناعية تؤكد التعبير عن CAS9 في التحكم HFK (LXSN) و HFK الذي يعبر عن بيتا فيروس الورم الحليمي البشري 8E6 (8E6). بعد 48 ساعة من النقل ، تم حصاد محللات الخلايا الكاملة ومن ثم فحصها باستخدام جسم مضاد مضاد CAS9 (أو GAPDH كعنصر تحكم في التحميل). تظهر النتيجة أن HFK LXSN و HFK 8E6 يعبران عن كمية مماثلة من CAS9 مما يشير إلى أن كفاءة النقل متشابهة بين خطين خلويين. الشكل 2 هو صورة م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالإضافة إلى عمق المعلومات المقدمة ، هناك العديد من المزايا لهذه الطريقة. أولا ، يمكن تقييم إصلاح DSB ، من الناحية النظرية ، في أي موقع جينومي دون تعديل جينوم الخلية محل الاهتمام. ثانيا ، يتم زيادة الوصول إلى تحليل NGS للإصلاح من خلال انخفاض التكلفة والجهد الحسابي الذي يوفره إنشاء وتحليل DSB واحد يستهدف منطقة محددة. وأخيرا، مع توفر جينومات الكائنات الحية الإضافية بشكل روتيني والمنشورات المتعددة التي تظهر بنجاح نقل خطوط الخلايا الثديية وغير الثديية المتنوعة، من المتوقع أن تكون فائدة هذا النهج واسعة النطاق

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم الأبحاث الواردة في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P20GM130448) (NAW و RP) ؛ المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NCI R15 CA242057 01A1) ؛ مركز جونسون لأبحاث السرطان في جامعة ولاية كانساس. ووزارة الدفاع الأمريكية (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). نحن نقدر KSU-CVM Confocal Core و Joel Sanneman للفحص المجهري المناعي لدينا. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لوكالات التمويل هذه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6 لوحة ثقافة أنسجة الآبارCelltreat229106لوحة ثقافة الخلية
BCA KitVWR89167-794مجموعة فحص BCA
طرد مركزي 5910 REppendorf2231000772أجهزة الطرد المركزي المنضدية
CLC منضدة العمل الجينوميةQiagen832001برنامج تحليل بيانات التسلسل العميق / المتصل indel / المتصل المتغير
Digital Microplate Genie نبضالصناعات العلميةSI-400Aلوحة شاكر
DYKDDDDK العلامة الجسم المضاد أحادي النسيلة (FG4R)ThermoFisher ScientificMA191878الأجسام المضادة المضادة
FLAG Epilife CF KitThermoFisher ScientificMEPICF500Cell cultrue Media والمكملات
الغذائية مصل الأبقار الجنيني (FBS)VWR89510-194مكمل زراعة الخلايا
الماعز المضاد للأرانب IgGThermoFisher ScientificA-11012نظام تنظيف الأجسام المضادة الثانوية
HighPrep PCRMagBioAC-60005طقم تنظيف PCR القائم على الخرز
KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPA BiosystemsKK2600PCR mastermix / PCR assay
MagAttract HMW DNA kitQiagen67563طقم استخراج الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي
حامل مغناطيسي -96Thermo Fisher ScientificAM1002796 بئر الرف المغناطيسي
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834Thermal Cycler
MiseqIlluminaSY-410-1003Sequencer
Miseq v2 300 دورة كاشف كيتIlluminaMS-102-2002300 دورة خرطوشة / كواشف التسلسل
Nextera XT DNA Library مجموعة الإعداديةIlluminaFC-131-1024طقم تحضير المكتبة
Nextera XT Kit v2 مجموعةIllumina20027215Indexes
Nunc 96 جيدا من مادة البولي بروبيلين DeepWell StroagePlates Thermo Fisher Scientific260251بئر عميق 96 بئر محلول
البنسلين الستربتومايسين (100X)Calsson LabsPSL02-6X100MLالمضادات الحيوية لزراعة الخلايا
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Bio BasicPD8117PBS
px330-CD4Addgen136938بلازميدات SgRNA / CAS9 التي تستهدف 5 '- GGCGTATCTGTGTGAGGACT
QIAxcel النظام المتقدمQiagen9001941آلة الرحلان الكهربائي الشعرية
QIAxcel مجموعة فحص الحمض النوويQiagen929004عازلة الحمض النووي / أنابيب الكهربية الشعرية Qubit
1x ds HS Assay KitThermoFisher ScientificQ23851كواشف مقياس الفلور / 1x حل dsDNA
Qubit 4 مقياس الفلورThermoFisher ScientificQ33238أنبوب
الفلورThermo Fisher ScientificQ32856أنابيب فحص مقياس الفلور
RIPA Lysis BufferVWRVWRVN653-100MLعازلة التحلل لاستخراج
البروتين Trypsin-EDTA (0.05٪) ، أحمرالفينولThermoFisher Scientific25300054Trypsin
Vortex-Genie 2الصناعات العلميةSI-0236كاشف الدوامة
Xfect كاشف الإرسالTakara Bio631318كاشف Transfection
برنامج تحليل البيانات الجينوميةQIAGENCLC Workbench v21.0.برنامج تحليل البيانات
جهاز فحص

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
  2. Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745(2011).
  3. Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
  4. vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
  5. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  6. Daley, J. M., Sung, P. 53B. P. 1 BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
  7. Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
  8. Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (0), 194-205 (2015).
  9. Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
  10. Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
  11. Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
  12. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
  13. Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
  14. Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653(2018).
  15. Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  16. Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327 (0), 48-60 (2012).
  17. Kuo, L. J., Yang, L. -X. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
  18. Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178(2020).
  19. Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
  20. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687(2015).
  21. Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356(2020).
  22. Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275(2022).
  23. Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821(2019).
  24. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  25. Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
  26. Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Next Generation SequencingDouble Strand BreaksCas9 Induced MutationsCD4 PromoterDNA Repair MechanismsSingle Guide RNAGenomic InstabilityImmunofluorescence MicroscopyTransfection EfficiencyMutation Detection

Related Articles