يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحضير فيروسات أنفلونزا الطيور H5 من النوع الزائف بطريقة نقل فوسفات الكالسيوم وقياس نشاط تحييد الأجسام المضادة

2.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62626

⸱

نوفمبر 22, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanjing Advanced Academy of Life and Health, 2Institute of Animal Bio-technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, 3National Clinical Research Center for Infectious Diseases, Shenzhen Third People’s Hospital, Southern University of Science and Technology, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا نصف بروتوكولا لتغليف الفيروسات الكاذبة وقياس نشاط تحييد الأجسام المضادة.

الملخص

ومنذ عام 1996، تتسبب فيروسات أنفلونزا الطيور H5 الشديدة الإمراض A/goose/Guangdong/1/96 في تفشي الأنفلونزا بين الدواجن والطيور البرية. في بعض الأحيان ، يقع البشر أيضا ضحية لها ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات. ومع ذلك، غالبا ما يتم إعاقة أبحاث فيروس أنفلونزا الطيور شديدة الانفلونزا، بالنظر إلى أنه يجب التعامل معها داخل مختبرات مستوى السلامة الأحيائية 3. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اعتماد الفيروسات الكاذبة كبديل للفيروسات البرية في بعض تجارب دراسات H5 HPAI. تثبت الفيروسات الزائفة أنها الأدوات المثالية لدراسة الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروسات H5 HPAI. يصف هذا البروتوكول الإجراءات والخطوات الحاسمة لاستعدادات الفيروس الكاذب H5 HPAI ومقايسات تحييد الفيروس الكاذب. كما يناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييدها وتعديلها لهذه المقايسات.

المقدمة

ومنذ عام 1996، تتسبب فيروسات أنفلونزا الطيور H5 الشديدة الإمراض A/goose/Guangdong/1/96 في تفشي الأنفلونزا بشكل مستمر بين الدواجن والطيور البرية، مما يتسبب في خسائر اجتماعية واقتصادية هائلة في صناعة الدواجن العالمية. في بعض الأحيان ، يصاب البشر أيضا به ، ويواجهون معدل وفيات مرتفع 1,2. ومع ذلك، غالبا ما يتم إعاقة أبحاث فيروس أنفلونزا الطيور شديدة الانفلونزا، نظرا لأنه لا يمكن معالجتها خارج مختبرات مستوى السلامة الأحيائية 3. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اعتماد الفيروسات الكاذبة كبديل للفيروسات البرية في بعض تجارب دراسات H5 HPAI. الفيروسات الزائفة آمنة بما يكفي للممارسة في مختبرات السلامة الأحيائية من المستوى 2.

تنتمي الفيروسات الكاذبة H5 HPAI إلى فيروسات وهمية تتكون من نوى فيروسات بديلة ، ومغلفات دهنية مع البروتينات السكرية السطحية من فيروسات الأنفلونزا ، وجينات المراسل. عادة ما يتم اشتقاق نوى الفيروسات الكاذبة من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ، والفيروسات القهقرية مثل فيروس سرطان الدم الفئران (MLV) ، وفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV) 3. على وجه التحديد ، يستخدم نظام التعبئة والتغليف HIV-1 على نطاق واسع لإنتاج فيروس الأنفلونزا الكاذب ، حيث الجينات الأساسية المقدمة هي gag و pol. يعبر جين هفوة فيروس نقص المناعة البشرية عن البروتينات الأساسية. يعبر جين بول عن إنزيم الانتراز وإنزيم النسخ العكسي، وكلاهما ضروري للتعبير عن جين المراسل في الخلايا المحولة. محاكاة جينوم الفيروس البديل ، يتم احتضان جين المراسل في قلب الفيروس الكاذب في شكل الحمض النووي الريبي. سيعبر جين المراسل عن البروتين في الخلايا المضيفة. يمكن استخدام مستويات التعبير الجيني لجينات المراسل لقياس كفاءة عدوى الفيروس الكاذب 3,4. المراسل الأساسي هو لوسيفيراز اليراع لقياس وحدات التلألؤ النسبية (RLU) أو نشاط اللوسيفيراز النسبي (RLA) في الخلايا المحولة. كما يتم استخدام مراسلين آخرين مثل lacZ و Gaussia و Renilla luciferase ، فقط بدرجة أقل5.

الفيروسات الزائفة هي أدوات مثالية لدراسة الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروسات H5 HAPI. لقياس قوة تحييد الأجسام المضادة ، يتم استخدام مقايسات تحييد الفيروس الكاذب (PN)6. الهيماجلوتينين (HA) والنورامينيداز (NA) هي بروتينات سكرية على سطح فيروس الأنفلونزاA 7,8. يتكون HA من مجال رأس كروي لربط المستقبلات ومجال جذعي للاندماج الغشائي. يحتوي بروتين NA على نشاط sialidase لتسهيل إطلاق الفيروس 7,8. يمكن لفحص PN قياس الأجسام المضادة المعادلة الموجهة إلى بروتينات HA. يمكن أيضا اكتشاف الأجسام المضادة المعادلة الموجهة إلى الرأس ومنطقة الجذع من HA عن طريق فحوصات الارتباط الفيروسي والدخول. بالمقارنة مع الفيروسات البرية ، فإن تجارب تحييد الفيروس الكاذب لها قيم كشف أكثر حساسية ، ويمكن التعامل معها بأمان في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 2 ، وهي عموما أسهل في العمل في الممارسة العملية.

يعرض هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراءات والخطوات الحاسمة لمستحضرات الفيروس الكاذب H5 HPAI وفحوصات PN. كما يناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييدها وتعديلها لهذه المقايسات. وفي هذه الدراسة، استخدمت كمثال على ذلك السلالة A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) من فيروسات H5N1 HPAI. للحصول على الأمصال المناعية المستخدمة في المقايسات ، اختار هذا البروتوكول بروتين HA الناشئ من سلالة TH كمناعي لتحصين الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع العمليات التجريبية المتعلقة بالفيروس الكاذب تحت حالة ABSL2 في معهد باستور التابع لأكاديمية شنغهاي الصينية للعلوم (IPS ، CAS). تم إجراء التجارب على الحيوانات بناء على بروتوكولات الحيوانات المعتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية من IPS ، CAS.

1. تغليف الفيروسات الكاذبة مع نقل الكالسيوم والفوسفات

  1. قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا HEK293FT (9 × 105 لكل مل) في وسط DMEM كامل (الجدول 1). أضف 10 مل من المعلقات أحادية الخلية إلى دورق T75 ، واحتضن الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2) لمدة 20 ساعة قبل النقل.
    ملاحظة: يوصى باستخدام HEK293FT ممر منخفض (<20 مقطعا). تأكد من أن الطبقة الأحادية للخلية متقاربة بنسبة 80-90٪.
  2. استبدل الوسط ب 10 مل من الوسط الطازج الكامل الذي يحتوي على الكلوروكين (100 ميكرومتر) قبل 2 ساعة من النقل.
  3. امزج الكواشف والحمض النووي البلازميد كما هو موضح في الجدول 2 والشكل 1: ddH 2 O ، pCMV / R-HA ، pCMV / R-NA ، pHR-Luc ، pCMV Δ 8.9 ، 2.5 M CaCl2 ، و 2x HEPES buffer. ماصة صعودا وهبوطا 5 مرات بلطف ، احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
  4. انقل الخليط إلى الوسط فوق الخلايا ، وهز القارورة برفق. احتضان الخلايا في حاضنة الخلايا لمدة 15 ساعة.
  5. استبدل الوسط ب 15 مل من وسط DMEM الكامل الطازج. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 65 ساعة.
    ملاحظة: سيكون لون الوسط برتقاليا فاتحا أو أصفر قليلا ، ويجب أن يظهر 80٪ على الأقل من الخلية تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) تحت المجهر الضوئي المقلوب.
  6. احصد المادة الطافية ، وطردها مركزيا عند 2095 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية ، وقسمها ، واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. الكشف عن تعبير بروتين HA و NA و HIV-1 p24 للفيروس الكاذب للأنفلونزا

  1. الكشف عن تعبير بروتين HA عن طريق مقايسة الهيماجلوتينين (HA).
    1. أضف 50 ميكرولتر من PBS إلى الأعمدة 2-12 ، الصفوف A و B و C من لوحة مستديرة القاع ذات 96 بئرا.
      ملاحظة: ينتمي الصف A و B و C إلى 3 اختبارات نسخ متماثل مستقلة ، ويتم استخدام العمود 12 كعنصر تحكم سالب.
    2. أضف 100 ميكرولتر من الفيروس الكاذب إلى آبار العمود 1. انقل 50 ميكرولتر من العمود 1 إلى العمود 2 ، واخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5 مرات ، وقم بإجراء التخفيفات ذات الشقين حتى العمود الأخير 11 ، وتجاهل 50 ميكرولتر الإضافية من العمود 11.
    3. أضف 50 ميكرولتر من كريات الدم الحمراء 0.5٪ في كل بئر ، وقم بسحبها لأعلى ولأسفل برفق مرتين. احتضان اللوحة لمدة 30-60 دقيقة في RT أو حتى تشكل كريات الدم الحمراء للتحكم السلبي البقع العادية في قاع البئر.
    4. مراقبة وتسجيل عيار HA للفيروس الكاذب.
      ملاحظة: وحدة HA للفيروسات الكاذبة هي أعلى عامل تخفيف للفيروس يمكن أن يسبب تراصا دمويا بنسبة 100٪ لخلايا الدم الحمراء.
  2. كشف تعبير بروتين HA و NA عن طريق مقايسة اللطخة الغربية.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات اللطخة الغربية وفقا لدليل الاستنساخ الجزيئي(الطبعة 4).
  3. اكتشف تعبير بروتين HIV-1 p24 بواسطة مجموعة HIV-1 p24 ELISA (جدول المواد).
    1. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى 450 ميكرولتر من عينة الفيروس الكاذب. امزجه جيدا.
    2. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة. اضرب اللوحة المقلوبة لإزالة المخزن المؤقت للغسيل تماما. كرر الغسيل 5 مرات.
    3. أضف 200 ميكرولتر من المعيار والعينات إلى كل بئر على حدة. احتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل أو لمدة 2 ساعة.
    4. نضح محتويات اللوحة واغسل اللوحة كما هو موضح في الخطوة 2.3.2.
      ملاحظة: اترك بئرا واحدا من لوحة الفحص فارغا لاستخدامه كركيزة فارغة.
    5. أضف 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة لكاشف p24 إلى كل بئر. احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. نضح وغسل اللوحة كما هو موضح في الخطوة 2.3.2.
    6. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل الستربتافيدين بيروكسيديز إلى كل بئر ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نضح وغسل اللوحة كما هو موضح في الخطوة 2.3.2.
    7. أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل الفرعي إلى كل بئر ، بما في ذلك بئر الركيزة الفارغة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: سوف يتطور اللون الأزرق في الآبار.
    8. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوقف إلى كل بئر.
      ملاحظة: سيتغير اللون الأزرق إلى اللون الأصفر على الفور.
    9. اقرأ الكثافة البصرية عند 450 نانومتر في غضون 15 دقيقة. سجل عيار p24 للفيروس الكاذب

3. معايرة الفيروس الكاذب

  1. قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا MDCK (5 × 104 لكل مل) في وسط DMEM كامل ، أضف 1250 و 2500 و 5000 و 10000 و 20000 و 40000 خلية إلى آبار مختلفة من صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20 ساعة.
  2. أخرج الفيروس الكاذب من الثلاجة -80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الجليد ، ودوامة الفيروس الكاذب.
  3. أضف 6 فيروسات كاذبة HAU (6x HA) إلى كل بئر من 96 صفيحة مستديرة القاع وجدد كل بئر ب DMEM الكامل حتى 120 ميكرولتر.
  4. ماصة أعلى وأسفل الخليط 5 مرات لخلط جيدا. احتضان لوحة الخليط في حاضنة 37 °C ، 5 ٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
  5. نقل 100 ميكرولتر من الخليط إلى الخلايا في لوحة 96 بئر. ضع لوحة زراعة الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة بالفيروس.
  6. أخرج اللوحة من الحاضنة وقم بإجراء فحص luciferase (جدول المواد).
  7. قم بإزالة الوسط من آبار اللوحة بعناية. شطف الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإزالة برنامج تلفزيوني قدر الإمكان.
    ملاحظة: اقلب اللوحة وتخلص من المادة الطافية عن طريق صفعها عكسيا على ورق ماص. إذا لم يتمكن خط خلية الاختبار من الالتصاق بإحكام بالأسفل ، فقم بإزالة الشفط المتوسط بعناية.
  8. أضف 50 ميكرولتر من مخزن التحلل إلى كل بئر ، وقم بهز لوحة الاستزراع عدة مرات. يخزن الطبق في درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: امزج حجما واحدا من محلول التحلل 5x مع 4 مجلدات من الماء لعمل المخزن المؤقت للتحلل 1x. قم بموازنة المخزن المؤقت للتحلل 1x إلى RT قبل الاستخدام. هز اللوحة للتأكد من أن الخلايا مغطاة بمحلول التحلل بالكامل. يمكن أن تساعد عملية التجميد والذوبان المفردة في تحلل الخلية تماما.
  9. أخرج اللوحة ، وازن عند RT لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: يجب تحليل الخلية بالكامل.
  10. هز اللوحة عدة مرات برفق ، وانقل جميع الخلايا المحللة إلى ألواح غير شفافة من 96 بئرا.
  11. أضف 50 ميكرولتر من الركيزة إلى كل بئر ، وقم بهز اللوحة عدة مرات برفق ، واخلط الركيزة ومحلول التحلل جيدا.
  12. قم بقياس الضوء الناتج في غضون 5 دقائق باستخدام مقياس الإضاءة. سجل عيار لوسيفيراز للفيروس الكاذب.
    ملاحظة: عند إضافة ركيزة مناسبة ، ينبعث الضوء كمنتج ثانوي عبر تفاعل كيميائي يتم فيه تحويل لوسيفيرين إلى أوكسي لوسيفيرين بواسطة إنزيم لوسيفيراز. تتناسب كمية الضوء الناتجة مع كمية إنزيم لوسيفيراز.

4. إعداد الأمصال المناعية

ملاحظة: سيتم استخدام المصل المناعي للتجارب المتعلقة بالخلايا ، ويجب إجراء العملية التجريبية في ظل ظروف معقمة.

  1. تحضير 12 أنثى فأر BALB / c تبلغ من العمر ثمانية أسابيع. قسم الفئران بالتساوي إلى مجموعتين.
    ملاحظة: كانت إحدى المجموعتين هي مجموعة DDV والأخرى كانت مجموعة التحكم السلبية.
  2. تحصين مجموعة DDV: يتم التعزيز مرتين في العضل باستخدام 100 ميكروغرام من ترميز بلازميد الحمض النووي المحسن للكودون A / Thailand / (KAN-1) / 2004 (TH) بروتين HA في الأسبوع 0 والأسبوع 3 ويتم تعزيزه مرة واحدة داخل الصفاق ب 512 جسيما شبيها بالفيروس HAU TH (VLP) في الأسبوع 6.
  3. تحصين المجموعة الضابطة: رئيس مرتين في العضل مع 100 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد الفارغ في الأسبوع 0 والأسبوع 3 وتعزيز مرة واحدة داخل الصفاق مع فيروس نقص المناعة البشرية -1 هفوة VLP في الأسبوع 6.
  4. جمع دم الفأر 2 أسابيع بعد التحصين الأخير.
    ملاحظة: هنا ، تم تخدير الفئران بصوديوم بنتوباربيتال (65 مجم / كجم) في وقت جمع الدم. بعد جمع الدم من الوريد تحت الفك السفلي ، تم القتل الرحيم للفئران على الفور باستخدام CO2.
  5. الحفاظ على الدم في RT لمدة 2 ساعة ، ثم 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. أجهزة الطرد المركزي في 900 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع الطاف. قم بتعطيل الأمصال بوضعها على درجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  6. قم بتخزين الأمصال المناعية في ثلاجة -80 درجة مئوية للاستخدام.
    ملاحظة: راجع الشكل التكميلي 1 للاطلاع على المخطط الانسيابي الذي يصف الإجراءات الرئيسية لتحصين الفئران.

5. مقايسة تحييد الفيروس الكاذب (PN)

  1. قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا MDCK (5 × 104 لكل مل) في وسط DMEM كامل ، وأضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20 ساعة.
  2. أخرج الفيروس الكاذب والأمصال من الثلاجة -80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الثلج على الجليد ، ودوامة جيدا.
  3. قم بتخفيف الأمصال في الوسط الكامل 20 مرة ، وأضف 100 ميكرولتر من وسط DMEM الكامل إلى آبار صفيحة مستديرة القاع مكونة من 96 بئرا من الأعمدة 2-10.
  4. أضف 200 ميكرولتر من الأمصال المخففة إلى آبار العمود 2 ، وانقل 100 ميكرولتر من العمود 2 إلى العمود 3 ، وقم بتخفيف الأمصال مثل 1:20 ، 1:40 ، 1:80 ، وما إلى ذلك ، إلى 1: 10240 على التوالي من العمود 2 إلى العمود 10 ، وتجاهل 100 ميكرولتر من العمود 10.
  5. أضف 100 ميكرولتر من الوسط الكامل DMEM إلى آبار العمود 11 كعنصر تحكم سلبي.
  6. أضف 100 ميكرولتر من الفيروسات الكاذبة إلى كل بئر ، ماصة لأعلى ولأسفل الخليط 5 مرات جيدا ، واحتضن لوحة الخليط في 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة.
  7. نقل 100 ميكرولتر من الخليط من الصفيحة ذات القاع المستدير 96 بئرا إلى البئر المقابلة للوحة زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 60 ساعة.
  8. أخرج اللوحة من الحاضنة. قم بإجراء اختبار لوسيفيراز كما هو موضح في الخطوات 3.7-3.12.

6. فحص مرفق الفيروس الكاذب

  1. قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا MDCK (4 × 104 لكل مل) في وسط DMEM كامل ، وأضف معلقات خلية 100 ميكرولتر إلى كل بئر في صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20 ساعة.
  2. احتضان الفيروس الكاذب مع الأمصال في DMEM التي تحتوي على 1٪ BSA عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: حجم الخليط 100 ميكرولتر.
  3. سد خلايا MDCK ب 100 ميكرولتر لكل بئر من DMEM تحتوي على 1٪ BSA عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
  4. تلقيح الفيروس الكاذب وخليط المصل (100 ميكرولتر) على طبقة MDCK الأحادية واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
  5. اغسل لوحة الخلية 4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA لإزالة أي فيروس غير مرتبط.
  6. تحلل الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول تحلل لوسيفيراز في RT لمدة 30 دقيقة.
  7. حدد كمية الفيروس المرتبط على الخلايا باستخدام مجموعة HIV-1 p24 ELISA كما هو موضح أعلاه (القسم 2.3).

7. تقييم دخول الفيروس

  1. قم بعمل معلقات أحادية الخلية لخلايا MDCK (5 × 104 لكل مل) في وسط DMEM كامل ، وأضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20 ساعة قبل الفحص.
  2. قم بتلقيح الفيروس الكاذب (100 ميكرولتر) على طبقة أحادية MDCK في صفيحة 96 بئرا عند 4 درجات مئوية لمدة 6 ساعات.
  3. اغسل لوحة الخلية 4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA لإزالة الفيروسات الزائفة غير المرتبطة.
  4. أضف 100 ميكرولتر من الأمصال المناعية المخففة بشكل متسلسل أو الأمصال من فئران التطعيم الوهمية في DMEM التي تحتوي على 1٪ BSA إلى الطبقة الأحادية ، واحتضان الخلية عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
  5. قم بإزالة طاف الخلية ، واغسل لوحة زراعة الخلايا 4 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ BSA.
  6. أضف DMEM الطازج إلى الخلايا واحتضانه لمدة 60 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
  7. قم بقياس نشاط لوسيفيراز النسبي (RLA) للخلايا كما هو موضح في الخطوات 3.7-3.12.
    ملاحظة: تم التعبير عن الدخول الفيروسي ، كما هو موضح من قبل RLA ، كنسبة مئوية من القراءة التي تم الحصول عليها في غياب الأمصال ، والتي تم تحديدها على أنها 100٪.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

HA و NA و HIV-1 p24 تعبير البروتين عن الفيروس الكاذب للأنفلونزا
لتحديد كفاءة التعبئة الفيروسية ، تم اكتشاف مخزونات الفيروس الكاذب للأنفلونزا لأول مرة بواسطة اختبار HA (الشكل 2 أ). وحدات HA لكل ملليلتر من فيروسات الأنفلونزا الكاذبة هي 643 (الجدول 3). تم استخدام مقايسة اللطخة الغربية ومقايسات ELISA للشطيرة لاختبار تعبير بروتين HA و NA و HIV-1 p24. ثم تم حساب نسب وحدة HA وكمية الكمامة p24 للفيروسات الكاذبة. أظهرت نتائج مقايسة اللطخة الغربية أن هناك 4 أنواع م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

عادة ما تستخدم الخلايا HEK293FT كخلايا تغليف لإنتاج فيروسات كاذبة. الكشف المنتظم عن الميكوبلازما ضروري أثناء زراعة الخلايا. يمكن أن يقلل تلوث الميكوبلازما بشكل كبير من غلة الفيروس الكاذب وأحيانا يقترب من الصفر. بالمقارنة مع الملوثات الأخرى ، لا تؤدي ملوثات الميكوبلازما إلى تغيرات في قيمة الأس الهيدروجيني أو تعكر وسط زراعة الخلية. حتى التركيز العالي للميكوبلازما غير مرئي بالعين المجردة أو تحت المجهر. ثلاث طرق شائعة للكشف عن الميكوبلازما هي ثقافة الميكوبلازما ، وتلطيخ الحمض النووي باستخدام DAPI الفلوري أو Hoechst 33258 ، و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية المقدمة من مشروع بناء القدرات الابتكارية لمقاطعة جيانغسو (BM2020019) ، ومشروع شنتشن العلمي والتكنولوجي (No. JSGG20200225150702770) ، وبرنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB29030103) ، ومشروع قوانغدونغ العلمي والتكنولوجي (رقم 2020B1111340076) وبرنامج البحوث المفتوحة لمختبر خليج شنتشن (رقم. SZBL202002271003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ Chiken ErythrocyteBio-channelBC-RBC-C001كاشف
96 بئر لوحات زراعة الخلايا (قاع مسطح)167008علمية للثيران
الحراري ألواح ثقافة الخلايا 96 بئر (قاع دائري)Thermo fisher Scientific163320المواد الاستهلاكية
Allegra X-15RBeckman coulter-المعدات / أجهزة الطرد المركزي
BD محاقن الأنسولينBD324910المواد الاستهلاكية
كلوريد الكالسيوم اللامائيAMRESCO1B1110-500Gكاشف
الكلوروكين ثنائي فوسفاتSelleckS4157كاشف
Dulbecco ' s النسر المعدل المتوسط (DMEM)Gibco12100-046كاشف
مصل الأبقار الجنينGibco16000-044كاشف
HEK293FTGibcoR700-07خط الخلية
HEPES FREE ACIDAMRESCO0511-250Gكاشف
HIV-1 p24 مستضد ELISAZeptoMetrix801111مجموعة كاشف
Luciferase نظام الفحص فريزر حزمةطقم كاشفPromegaE4530
MDCK.1ATCCCRL-2935خط الخلية
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 ملثيرمو فيشر علمي509-GRD-Qالمواد الاستهلاكية
Nunc أنابيب الطرد المركزي المخروطية 15 ملثيرمو فيشر علمي339650المواد الاستهلاكية
الطرد المركزي المخروطية Nunc 50 ملثيرمو فيشر علمي339652المواد الاستهلاكية
Nunc EasYFlask 75 سم < sup>2< / sup>Thermo fisher علمية156499المواد الاستهلاكية
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122أطراف الماصة الكاشف
(10 & mu ؛ L)Thermo fisher العلميةTF102-10-Qالمواد الاستهلاكية
نصائح الماصة (100 مو ؛ L)Thermo fisher العلميةTF113-100-Qالمواد الاستهلاكية
نصائح الماصة (1000 مو ؛ L)Thermo fisher العلميةTF112-1000-Qالمواد الاستهلاكية
الماصات المصلية (5 مل)Thermo fisher العلمية170355Nالمواد الاستهلاكية
الماصات المصلية (10 مل)Thermo fisher العلمية170356Nالمواد الاستهلاكية
Trypsin / EDTAGibco25200-072كاشف
Varioskan FlashThermo Fisher علمي-المعدات / قارئ الصفائح
الدقيقة حاضنة سترة مائيةثيرمو فيشر علمي3111معدات / حاضنة خلية
ملح الصوديوم بنتوباربيتالسيجما57-33-0كاشف
مواد أنابيب

المراجع

  1. Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
  2. Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854(2017).
  3. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963(2018).
  4. Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311(2020).
  5. Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
  6. Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
  7. Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
  8. Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
  9. Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
  10. Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
  11. Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
  12. Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
  13. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
  14. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
  15. Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69(2020).
  16. Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
  17. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الفيروس الكاذب H5فيروس إنفلونزا الطيورمقايسة تحييد الفيروس الكاذبمقايسة الهماغلوتينينمقايسة اللوسيفيريزخلايا MDCKلطخة ويسترنمستوى السلامة البيولوجية
تحضير فيروسات أنفلونزا الطيور H5 من النوع الزائف بطريقة نقل فوسفات الكالسيوم وقياس نشاط تحييد الأجسام المضادة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.