مقالة منهجية

التنميط المكاني للبروتين وتعبير الحمض النووي الريبي في الأنسجة: نهج لضبط التشريح المجهري الافتراضي

DOI:

10.3791/62651

⸱

يوليو 6, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف بروتوكولا لضبط مناطق الاهتمام (ROIs) لتقنيات Spatial Omics لتوصيف البيئة المكروية للورم بشكل أفضل وتحديد مجموعات خلايا معينة. بالنسبة لفحوصات البروتينات ، يمكن للبروتوكولات المخصصة الآلية توجيه اختيار عائد الاستثمار ، بينما يمكن ضبط فحوصات النسخ باستخدام عائد استثمار صغير يصل إلى 50 ميكرومتر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح تعدد الإرسال تقييم العديد من العلامات على نفس النسيج مع توفير السياق المكاني. تسمح تقنيات Omics المكانية بتعدد إرسال كل من البروتين والحمض النووي الريبي من خلال الاستفادة من الأجسام المضادة والمجسات الموسومة بالصور ، على التوالي. يتم شق Oligos وقياسها كميا من مناطق محددة عبر الأنسجة لتوضيح البيولوجيا الأساسية. هنا ، توضح الدراسة أنه يمكن استخدام بروتوكولات تصور الأجسام المضادة المخصصة الآلية لتوجيه اختيار عائد الاستثمار بالتزامن مع فحوصات البروتينات المكانية. لم تظهر هذه الطريقة المحددة أداء مقبولا مع فحوصات النسخ المكاني. يصف البروتوكول تطوير مقايسة 3-plex immunofluorescent (IF) لتصور العلامة على منصة آلية ، باستخدام تضخيم إشارة التيراميد (TSA) لتضخيم إشارة الفلورسنت من هدف بروتين معين وزيادة تجمع الأجسام المضادة للاختيار من بينها. تم أتمتة بروتوكول التصور باستخدام اختبار 3-plex تم التحقق من صحته بدقة لضمان الجودة وقابلية الاستنساخ. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم تبادل DAPI لأصباغ SYTO للسماح بتصوير مقايسات IF القائمة على TSA على منصة التنميط المكاني. بالإضافة إلى ذلك ، اختبرنا القدرة على اختيار عائد استثمار صغير باستخدام مقايسة النسخ المكاني للسماح بالتحقيق في مجالات اهتمام محددة للغاية (على سبيل المثال ، المناطق المخصبة لنوع خلية معين). تم جمع عائد الاستثمار بقطر 50 ميكرومتر و 300 ميكرومتر ، وهو ما يتوافق مع حوالي 15 خلية و 100 خلية على التوالي. تم عمل العينات في المكتبات وتسلسلها للتحقيق في القدرة على اكتشاف الإشارات من عائد الاستثمار الصغير والمناطق الخاصة بالملف الشخصي في الأنسجة. لقد قررنا أن تقنيات البروتينات المكانية تستفيد بشكل كبير من البروتوكولات الآلية الموحدة لتوجيه اختيار عائد الاستثمار. على الرغم من أن بروتوكول التصور الآلي هذا لم يكن متوافقا مع فحوصات النسخ المكاني ، فقد تمكنا من اختبار وتأكيد أنه يمكن اكتشاف مجموعات خلايا معينة بنجاح حتى في عائد الاستثمار الصغير باستخدام بروتوكول التصور اليدوي القياسي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستمر التقدم في تقنيات تعدد الإرسال في توفير أدوات توصيف أفضل للأهداف الموجودة في الأورام. البيئة المكروية للورم (TME) هي نظام معقد من الخلايا السرطانية ، والخلايا المناعية المتسللة ، والسدى ، حيث تكون المعلومات المكانية ضرورية لفهم وتفسير آليات التفاعل بين المؤشرات الحيوية ذات الأهميةبشكل أفضل 1. مع التقنيات الناشئة مثل GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) و 10x Visium ، يمكن اكتشاف أهداف متعددة وقياسها كميا في وقت واحد ضمن سياقها المكاني. يمكن أن يؤدي استخدام بروتوكولات التألق المناعي التي تسهل تصور الأنسجة إلى زيادة تحسين قدرات التنميط المكاني لهذه التقنيات.

تتكون تقنية Spatial Omics التي ركزنا عليها لتطوير هذه الطريقة من البروتينات المكانية ومقايسات النسخ حيث يتم ربط oligonucleotides بالأجسام المضادة أو مجسات الحمض النووي الريبي عبر رابط ضوئي حساس للأشعة فوق البنفسجية. يتم تمييز الشرائح النسيجية بهذه الأجسام المضادة أو المجسات المترافقة ثم يتم تصويرها على منصة التنميط المكاني. بعد ذلك ، يتم اختيار عائد الاستثمار بأحجام وأشكال مختلفة للإضاءة ، ويتم استنشاق قليل النوكليوتيدات المشقوقة ضوئيا وتجميعها في لوحة ذات 96 بئرا. يتم تحضير قليل النيوكليوتيدات المشقوقة ضوئيا ليتم قياسها كميا إما باستخدام نظام Nanostring nCounter أو تسلسل الجيل التالي (NGS) 2,3 (الشكل 1) 4,5.

تختلف توزيعات الخلايا داخل الأنسجة ، والقدرة على توصيف مواقع محددة للخلايا باستخدام علامات محددة وأحجام عائد استثمار مختلفة لها أهمية كبيرة لفهم بيئة الأنسجة بشكل كامل وتحديد ميزات محددة. في تقنية Spatial Omics المذكورة هنا ، يستخدم بروتوكول التصور القياسي أجساما مضادة مترافقة مباشرة وهو بروتوكول يدوي. العلامات القياسية للتمييز بين الورم والسدى هي panCytokeratin (panCK) و CD45 6,7 ، ولكن هناك حاجة إلى علامات إضافية لاستهداف مجموعات خلايا معينة ذات أهمية. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الأجسام المضادة الفلورية المترافقة مباشرة يفتقر إلى التضخيم ، مما يحد من اختيار الأجسام المضادة إلى علامات وفيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تخضع المقايسات اليدوية لتنوع أكبر من سير العمل الآلي8. لذلك ، من المستحسن أن يكون لديك بروتوكول تصور قابل للتخصيص وتلقائي ومضخم لاختيار عائد الاستثمار.

هنا ، توضح الدراسة أنه بالنسبة لمقايسات البروتينات المكانية ، يمكن استخدام تقنية TSA لبروتوكولات التصور على منصة آلية مما يؤدي إلى فحص أكثر استهدافا وتوحيدا. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح المقايسات القائمة على TSA استخدام علامات منخفضة التعبير ، مما يزيد من نطاق الأهداف التي يمكن اختيارها للتصور. تم تطوير اختبار 3-plex ل panCK و FAP و Antibody X باستخدام منصة آلية حيث تم استخدام panCK و FAP للتمييز بين الورم والسدى ، على التوالي. الجسم المضاد X هو بروتين انسجة كثيرا ما يصادف في الأورام ، لكن بيولوجيته وتأثيره على المناعة المضادة للورم غير مفهومين تماما. يمكن أن يوضح توصيف النسيج المناعي في المناطق الغنية بالجسم المضاد X دوره في المناعة المضادة للورم والاستجابة العلاجية ، فضلا عن إمكاناته كهدف دوائي.

في حين أثبتت لوحات التصور TSA الآلية المخصصة نجاحها في فحوصات البروتينات المكانية ، لا يمكن تأكيد تطبيق هذه المقايسات لمقايسات النسخ المكاني. ويرجع ذلك على الأرجح إلى الكواشف والبروتوكول المستخدم لبروتوكولات التصور الآلي ، والتي يبدو أنها تعرض سلامة الحمض النووي الريبي للخطر. إن إدراك أنه يمكن استخدام بروتوكول وضع العلامات الآلي لعلامات التصور لمقايسات البروتينات المكانية ولكن ليس لفحوصات النسخ المكاني يوفر إرشادات مهمة حول تصميمات مقايسة تقنية Spatial Omics.

بالإضافة إلى ذلك ، توضح الدراسة أنه يمكن استخدام اختبار النسخ المكاني لتحديد الأهداف في مناطق صغيرة يصل قطرها إلى 50 ميكرومتر ، أو ما يقرب من 15 خلية. تم اختيار اثنين من عائد الاستثمار مختلفي الحجم لاختبار قدرة الفحص على اكتشاف النصوص أيضا في عائد الاستثمار الصغير. لكل منطقة ذات أهمية ، تم جمع oligos المقابلة لأهداف 1,800 mRNA وتحويلها إلى مكتبات وفقا لبروتوكول منصة التنميط المكاني. تمت فهرسة المكتبات بشكل فردي ، ثم تجميعها وتسلسلها. سمح ذلك بتقييم كل من كفاءة التجميع والقدرة على تحديد مجموعات خلايا معينة في عائد استثمار صغير.

توضح هذه الورقة أنه بالنسبة لفحوصات البروتينات المكانية ، يمكن استخدام بروتوكول آلي لتوجيه اختيار عائد الاستثمار على علامات محددة ذات أهمية لاستهداف استجواب مناطق الأنسجة ذات الصلة بشكل انتقائي وتوصيف البيئة المكانية للأنسجة. علاوة على ذلك ، أثبتنا أنه يمكن استخدام عائد استثمار أصغر لفحوصات النسخ المكاني لاكتشاف وتوصيف مجموعات خلايا معينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على جميع الأنسجة البشرية من البنوك الحيوية التجارية أو بنوك الأنسجة المعتمدة بموجب ضمان الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية المناسبة والموافقة المستنيرة.

ملاحظة: يتم تنفيذ البروتوكول باستخدام Discovery Ultra وملف التعريف المكاني الرقمي GeoMx. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الكواشف والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. بروتوكول التصور الآلي لفحوصات البروتينات المكانية

  1. برنامج autostainer لتطبيق الأجسام المضادة التصور الفلورسنت
    1. في برنامج autostainer ، انقر فوق زر الصفحة الرئيسية واختر البروتوكولات. ثم ، انقر فوق إنشاء / تحرير البروتوكولات وحدد RUO DISCOVERY Universal كإجراء.
    2. انقر فوق التسلسل الأول > Deparaffinization > Depar v2. بالنسبة لدرجة الحرارة المتوسطة ، اختر 72 درجة مئوية ، ثم انقر فوق المعالجة المسبقة وحدد تكييف الخلية وخزان CC1. للحصول على درجة حرارة عالية جدا ، اختر 100 درجة مئوية ، ثم انقر فوق CC1 8 Min واستمر في النقر حتى يتم تحديد CC1 64 Min.
    3. انقر فوق المانع > مثبط DISCOVERY ، ولوقت الحضانة ، اختر 8 دقائق. ثم ، انقر فوق الأجسام المضادة > حضانة Ab عالية الحرارة. لدرجة حرارة منخفضة ، اختر 37 درجة مئوية ؛ بالنسبة للجسم المضاد ، اختر رقم الجسم المضاد من ملصق الموزع (الجسم المضاد 6 في هذا المثال) ؛ لوقت الحضانة الإضافية، حدد 32 دقيقة.
      ملاحظة: يحتوي هذا البروتوكول على ثلاثة أرقام مختلفة للأجسام المضادة. الجسم المضاد الأول هو FAP ، والثاني هو Pan-Cytokeratin ، والثالث هو الجسم المضاد X.
    4. انقر فوق Multimer HRP > Multimer HRP Blocking ، ثم لحظر الأجسام المضادة ، اختر Gt Ig Block ، ولوقت الحضانة ، اختر 4 دقائق. بعد ذلك ، في كاشف Multimer HRP ، حدد OMap anti-Rb HRP ، ولوقت الحضانة ، اختر 16 دقيقة. ثم ، انقر فوق Cy5 ، ولوقت الحضانة الطويل ، اختر 0 ساعة 8 دقيقة.
    5. انقر فوق تسلسل مزدوج واختر تمسخ الأجسام المضادة ، ثم حدد تشوه الجسم المضاد CC2-1 ، ولدرجة الحرارة العالية جدا ، اختر 100 درجة مئوية. تأكد من أن وقت الحضانة هو 8 دقائق. بعد ذلك ، انقر فوق DS Inhibitor وحدد تحييد.
    6. انقر فوق الجسم المضاد DS ، وللحصول على درجة حرارة منخفضة جدا ، اختر 37 درجة مئوية. بعد ذلك، في Antibody، اختر رقم الجسم المضاد من ملصق الموزع (الجسم المضاد 3 في هذا المثال)، وبالنسبة إلى Plus Incubation Time، حدد 32 دقيقة.
    7. انقر فوق DS Multimer HRP واختر DS Multimer HRP Blocker. ثم ، بالنسبة لحظر الأجسام المضادة ، حدد gt ig block ، ولوقت الحضانة ، اختر 4 دقائق. بعد ذلك ، في كاشف Multimer HRP ، حدد OMap anti-Ms HRP ، ولوقت الحضانة ، اختر 16 دقيقة. ثم ، انقر فوق DS Rhodamine 6G ، ولوقت الحضانة الطويل ، اختر 0 ساعة 8 دقيقة.
    8. انقر فوق Triple Stain وحدد TS Antibody Denaturation ، ثم حدد Antibody Denature CC2-2 ، ولدرجة الحرارة العالية جدا ، حدد 100 درجة مئوية. تأكد من أن وقت الحضانة هو 8 دقائق. بعد ذلك ، انقر فوق مثبط TS وحدد تحييد TS.
    9. انقر فوق TS Antibody ، وللحصول على درجة حرارة منخفضة جدا ، حدد 37 درجة مئوية. بعد ذلك، في الأجسام المضادة، حدد رقم الجسم المضاد من ملصق الموزع (الجسم المضاد 7 في هذا المثال)، وبالنسبة إلى وقت الحضانة الإضافية، حدد 32 دقيقة.
    10. انقر فوق TS Multimer HRP واختر مانع TS Multimer HRP. ثم ، بالنسبة لحظر الأجسام المضادة ، حدد gt ig block ، ولوقت الحضانة ، اختر 4 دقائق. بعد ذلك ، في كاشف Multimer HRP ، حدد OMap anti-Rb HRP ، ولوقت الحضانة ، اختر 16 دقيقة. ثم ، انقر فوق TS FAM ، ولوقت الحضانة الطويل ، اختر 0 ساعة 8 دقيقة.
    11. أضف عنوانا إلى البروتوكول. حدد رقم بروتوكول ، وأضف تعليقا ، وانقر فوق نشط متبوعا بحفظ.
  2. قم بإعداد الشرائح وطباعة الملصقات وبدء تشغيل جهاز التلوين التلقائي
    1. اشترى بائع المخبوزات FFPE (ثابت بالفورمالين ، مضمن بالبارافين) أقسام الأنسجة البشرية في فرن مضبوط على 70 درجة مئوية لمدة 20-60 دقيقة. أثناء خبز الشرائح، اطبع الملصقات بالنقر فوق إنشاء ملصق في برنامج التلوين التلقائي. بعد ذلك ، انقر فوق البروتوكولات ، وحدد رقم البروتوكول ، وانقر فوق إغلاق / طباعة. أضف المعلومات ذات الصلة على ملصق الشريحة وانقر فوق طباعة.
    2. أخرج الشرائح من الفرن واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتطبيق تسميات البروتوكول المطبوعة مسبقا على الشرائح المقابلة.
    3. قم بتحميل موزعات الأجسام المضادة القابلة لإعادة التعبئة بالأجسام المضادة وفقا لرقم ملصق الأجسام المضادة المعين في الخطوة 1.1. في هذا البروتوكول ، استخدم الأجسام المضادة 6 ل FAP عند 1 ميكروغرام / مل ، واستخدم الجسم المضاد 3 ل Pan-Cytokeratin عند 0.1 ميكروغرام / مل ، واستخدم الجسم المضاد 7 للجسم المضاد X عند 2.5 ميكروغرام / مل. قم بتخفيف كل جسم مضاد في المادة المخففة المحددة وقم بتجهيز موزعات الأجسام المضادة القابلة لإعادة التعبئة.
    4. اجمع موزعات الكواشف المملوءة مسبقا للحجب والكشف والتضخيم المذكورة أعلاه وضعها على صينية الكاشف. قم بتحميل الشرائح في أدراج الشرائح (حتى 30 شريحة لكل تشغيل) وانقر فوق تشغيل متبوعا بنعم. لاحظ أن DAPI لا يستخدم في التلوين النووي.
    5. قم بتأكيد بدء التشغيل عن طريق التحقق من مدة التشغيل على برنامج autostainer. يستغرق البروتوكول ~ 11 ساعة للإكمال ويمكن تشغيله بين عشية وضحاها.
    6. في اليوم التالي ، تأكد من اكتمال التشغيل من خلال مراقبة الأضواء الوامضة الخضراء على فتحات درج الانزلاق. بعد ذلك ، قم بإزالة الشرائح من الجهاز وشطف الشرائح بقوة في 1x Reaction Buffer حتى تتم إزالة محلول انزلاق الغطاء السائل تماما.
  3. بروتوكول منصة التنميط المكاني لفحص البروتينات
    1. اتبع بروتوكول البروتينات المكانية المشار إليه في الملاحظة أدناه. قم بتضمين التغييرات التالية على البروتوكول لتمكين إجراء وضع العلامات الآلي 3-plex.
    2. قم بتنفيذ الخطوات 1.2.1-1.2.6 في اليوم السابق لبدء بروتوكول البروتينات المكانية وانتقل مباشرة إلى خطوة استرجاع المستضد لبروتوكول البروتينات المكانية بعد تنفيذ الخطوة 1.2.6. حذف إجراء التصور الموضح في بروتوكول البروتينات التنميط المكاني.
    3. استبدل SYTO 13 ب SYTO 64 عند 5000 نانومتر لتمكين تكامل الفلوروفور. خفف SYTO 64 في 1x TBS واحتضانه في غرفة الرطوبة لمدة 15 دقيقة.
    4. عند إعداد معلمات المسح في منصة التنميط المكاني ، حدد المرشحات وقنوات التركيز وفقا للفلوروفورات المستخدمة في لوحة التصور للسماح بتكامل 3-plex. استخدم FITC ل DISCOVERY FAM واضبط التعرض على 200 مللي ثانية ، واستخدم Cy3 ل DISCOVERY Rhodamine 6G واضبط التعرض على 200 مللي ثانية ، واستخدم Texas Red ل SYTO 64 واضبط التعرض على 50 مللي ثانية (حدد هذا كقناة التركيز) ، وأخيرا ، استخدم Cy5 ل DISCOVERY Cy5 ، واضبط التعرض على 200 مللي ثانية ، وحفظ التغييرات.
      ملاحظة: توجد تعليمات مفصلة لبروتوكول البروتينات التنميط المكاني في علامة التبويب دعم الموقع الرسمي عن طريق تحديد الوثائق > أدلة المستخدم. هنا ، ابحث عن بروتوكول البروتين ل nCounter باستخدام Bond RX.

2. اختيار عائد الاستثمار لفحوصات النسخ المكاني

  1. تخبز أقسام حبيبات خلية FFPE في فرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 20-60 دقيقة. اتبع بروتوكول NGS لمنصة التنميط المكاني المشار إليه في الملاحظة أدناه وقم بمسح الشرائح على منصة التنميط المكاني ، واختيار أحجام 50 ميكرومتر و 300 ميكرومتر. تم تسليط الضوء على التوصية التالية لفحص النسخ المكاني:
    1. عند إعداد المكتبة ، إذا تم تحديد أحجام مختلفة من عائد الاستثمار ، فقم بتجميع عائد الاستثمار بأحجام مماثلة لإنشاء مكتبة واحدة لكل حجم. هذا لضمان تحقيق أعماق تسلسل كافية لجميع عائد الاستثمار دون تحيز من الحجم.
      ملاحظة: توجد تعليمات مفصلة لمنصة التنميط المكاني في علامة التبويب دعم الموقع الرسمي عن طريق تحديد الوثائق > أدلة المستخدم. هنا ، ابحث عن بروتوكول RNA لتطبيقات NGS باستخدام Bond RX.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول التصور الآلي لتوجيه اختيار عائد الاستثمار
في هذه الورقة ، نقدم استخدام بروتوكول IF آلي مخصص قائم على TSA لتصور الأنسجة وتحديد عائد استثمار محدد. تألف تطوير لوحة التصور باستخدام سرطان الجلد والجلد الطبيعي البشري كأنسجة تحكم من اختبار ثبات الحافة ، والضبط الدقيق لشدة العلامة ، وتقييم النزيف من خلال ترك واحد خارج الضوابط. لاختبار ما إذا كان استقرار الخلاصة للأجسام المضادة يتأثر بخطوات الشطف المتكررة ، تم تقييم إشارات FAP و Antibody X نوعيا بعد وضع العلامات في كل موضع من 3-plex. ظلت إشارة الجسم ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حتى الآن ، يتم استخدام الأجسام المضادة الفلورية المترافقة مباشرة في بروتوكول يدوي بشكل شائع كلوحات تصور للبروتينات المكانية أو فحوصات النسخ المكاني 9,10. ومع ذلك ، فإن استخدام الأجسام المضادة الفلورية المترافقة مباشرة يمكن أن يمثل تحديا للعلامات الأقل وفرة ، مما يحد من اختيار الأجسام المضادة المناسبة. يوضح هذا البروتوكول أن وضع العلامات على علامات التصور يمكن أن يكون آليا على منصة تلطيخ آلية باستخدام تقنيات TSA لدعم فحوصات البروتينات المكانية. يتيح ذلك مزيدا من ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيرونيكا إيبارا لوبيز ، سانجيتا جاياكار ، يتشينغ أنجيلا يانغ ، زورا مودروسان ، وساندرا روست هم موظفون ومساهمون في Genentech ، عضو في مجموعة روش. تنتج الشركات الأخرى التي تشكل جزءا من روش الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المخطوطة. سيارا مارتن موظفة بدوام كامل في شركة NanoString Technologies Inc، التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المخطوطة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفون بتوماس وو لمعالجة ملفات NGS. نشكر جيمس زياي على مناقشات النتائج ومراجعة المخطوطات وميريديث تريبليت وراشيل تايلور على المراجعة الداخلية للمخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10x Tris Buffered Saline (TBS)تقنيات إشارات الخلية12498Sمخففة إلى 1x TBS في المياه المعالجة DEPC
الجسم المضاد X (لم يتم الكشف عنه)الجسم المضاد أعمى بسبب السرية
المياه المعالجةDEPC ThermoFisherAM9922يمكن استخدام آخر
خلية ديسكفري (CC1)Ventana950-500
مجموعة DISCOVERY Cy5Ventana760-238يشار إليها باسم Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243يشار إليها باسم FAM
DISCOVERY Goat Ig BlockVentana760-6008يشار إليها باسم Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRPVentana760-4310يشار إليها باسم OMap anti-MS HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRPVentana760-4311يشار إليها باسم OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G KitVentana760-244يشار إليها باسم Rhodamine 6G
Discovery نظام تحضير الشرائح الآلي الفائقVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FSيشار إليه باسم autostainer على المخطوطة
FAP [EPR20021] الأجسام المضادةAbcamAb207178
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanoStringGMX-DSP-1Yيشار إليها باسم منصة التنميط المكاني على المخطوطة
غرفة الرطوبةSimportM920-2يمكن استخدام آخر
Pan-Cytokeratin [AE1 / AE3] الجسم المضادAbcamAb27988
ProLong Gold AntifadeMountant ThermoFisherP36934
PythonPython التحليل الإحصائي
للتفاعل المؤقت (10x)Ventana950-300
برنامج التحليل الإحصائيGraphPadPrism 7التحليل الإحصائي
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana950-223
مخفف الأجسام المضادة Ventana مع الكازينVentana760-219المشار إليه على أنه مخفف محدد في المخطوطة
يعتمد رقم كتالوج موزع الأجسام المضادة الأساسي Ventanaعلى رقم الموزع
تكييف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
  2. Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
  3. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
  4. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
  5. NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
  6. McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
  7. McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
  8. Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  9. Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783(2020).
  10. Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
  11. Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
  12. Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
  13. Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448(2020).
  14. Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
  15. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
  16. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  17. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  18. Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
  19. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456(2021).
  20. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
  21. Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA

مقالات ذات صلة