مقالة منهجية

تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم القائم على الرحلان الكهربائي الشعري للتوصيف التوافقي للبروتينات باستخدام مطياف الكتلة من أعلى إلى أسفل

2.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62672

⸱

يونيو 8, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

في هذه المقالة

ملخص

يظهر هنا بروتوكول لنهج تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX) القائم على الرحلان الكهربائي الشعري إلى جانب قياس الطيف الكتلي من أعلى إلى أسفل. يميز هذا النهج الفرق في الهياكل ذات الترتيب الأعلى بين أنواع البروتين المختلفة ، بما في ذلك البروتينات في حالات مختلفة وأشكال بروتينية مختلفة ، من خلال إجراء فصل HDX التفاضلي المتزامن والفصل الكهربائي.

الملخص

لا يزال حل عدم التجانس التوافقي لحالات البروتين المتعددة التي تتعايش في المحلول أحد العقبات الرئيسية في توصيف علاجات البروتين وتحديد مسارات الانتقال التوافقية الحاسمة للوظائف البيولوجية ، بدءا من التعرف الجزيئي إلى التحفيز الإنزيمي. يوفر تفاعل تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم (HDX) إلى جانب التحليل الطيفي الكتلي من أعلى إلى أسفل (MS) وسيلة لتوصيف هياكل وديناميكيات البروتين ذات الترتيب الأعلى بطريقة مطابقة محددة. تعتمد قوة الحل التوافقية لهذه التقنية بشكل كبير على كفاءة فصل حالات البروتين على مستوى البروتين السليم وتقليل المحتوى البروتيكي المتبقي غير المثني أثناء تفاعلات HDX.

هنا نصف متغيرا قائما على الرحلان الكهربائي الشعري (CE) لنهج HDX MS الذي يهدف إلى تحسين الدقة المطابقة. في هذا النهج ، تخضع البروتينات لتفاعلات HDX أثناء الهجرة عبر محلول إلكتروليت الخلفية المحايد (BGE) أثناء الفصل الكهربائي الشعري. يمكن فصل حالات البروتين المختلفة أو الأشكال البروتينية التي تتعايش في المحلول بكفاءة بناء على نسب الشحن إلى الحجم المختلفة. الفرق في الحركة الكهربية بين البروتينات وجزيئات المذيبات البروتيكية يقلل من المذيب المتبقي غير المخصي ، مما يؤدي إلى بيئة تثنية كاملة تقريبا أثناء عملية HDX. تسمح واجهة CE-MS المتدفقة عبر الميكروفيال بالتأين الكهربائي الفعال لأنواع البروتين المنتفخة بعد الخلط السريع مع محلول معدل التبريد وتغيير الطبيعة عند مخرج البخاخ. يقيس تحليل التصلب المتعدد عبر الإنترنت من أعلى إلى أسفل مستوى التثدي العالمي لأنواع البروتين السليمة التي تم التخلص منها ، وبالتالي إزالة خصاء شظاياها في الطور الغازي. توضح هذه الورقة هذا النهج في HDX التفاضلي للأنظمة ، بما في ذلك متغيرات البروتين الطبيعي التي تتعايش في الحليب.

المقدمة

إن التمييز بين أنواع البروتين في حالات مختلفة من التشكيل أو الارتباط أو التعديل وتوصيف اختلافاتها الهيكلية أمر مهم لرصد مسارات التحولات بين هذه الأنواع المشاركة في الأحداث البيولوجية ، بدءا من التعرف الجزيئي إلى التحفيز الأنزيمي ، وفهم الآليات الكامنة وراء هذه الأحداث. لا توفر التقنيات الفيزيائية الحيوية التقليدية حلا كاملا بسبب القيود مثل عدم كفاية الدقة وفقدان المعلومات الديناميكية في الحل. تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم إلى جانب قياس الطيف الكتلي (HDX MS) هو تقنية تصف السمات الهيكلية والتوافقية للبروتينات مع الديوتيريوم (2 H) عن طريق التبادل بين ذرات الهيدروجين الشفوية للبروتينات و 2 H من محلول 2 H 2O الذي تمإدخاله عمدا. البروتونات المشاركة في الترابط الهيدروجيني أو التي يتم عزلها عن المذيب في داخل البروتين لا تتبادل بسهولة1. وبالتالي ، نظرا لأن سعر الصرف في موقع قابل للتبادل يعتمد بشكل كبير على مشاركته في هياكل أعلى ترتيبا ، يمكن الكشف عن هياكل البروتين بدقة مكانية عالية بواسطة MS الذي يسبر مدى ومعدل امتصاص 2 H بناء على الكتل الذرية المختلفة بين 1H و 2H. على مدى العقود الأخيرة ، أصبح HDX MS تقنية ناجحة بشكل رائع لدراسة تشكيلات البروتين وديناميكياته2.

في النهج الكلاسيكي من أسفل إلى أعلى ل HDX MS ، يتم بروتينية مجموعة أنواع البروتين في حالات مختلفة من التشكيل أو الارتباط أو التعديل دون فصل على مستوى البروتين السليم ، مما يجعل من غير الممكن توصيف الأنواع الفردية من خلال تحليل شظايا التحلل البروتيني الناتجة مع محتويات الديوتيريوم المعقدة. في المقابل، في النهج من أعلى إلى أسفل، تؤدي حالات البروتين المختلفة أو الأشكال البروتينية التي تضمنت محتويات مختلفة من الديوتيريوم إلى توزيعات متعددة لكتل البروتين السليمة في فحص التصلب المتعدد. وهذا يسمح بفصل الأنواع الفردية عن طريق اختيار كتلة الأيونات المقابلة لكل توزيع كتلي باستخدام مرشح كتلة مناسب (مثل رباعي) وتوصيف اختلافاتها التوافقية في تحليل MS الترادفي اللاحق 3,4,5,6. ومع ذلك ، فإن كفاءة فصل حالات البروتين أو البروتيوفورمات في هذه الاستراتيجية محدودة بمدى الاختلاف في توزيعات الكتلة المقابلة لها.

يوفر الرحلان الكهربائي الشعري (CE) وسيلة لفصل أنواع البروتين بناء على شحناتها المختلفة وأحجامها الهيدروديناميكية في مرحلة الحل بكفاءة عالية7. الجمع بين CE و HDX يوفر فصلا إضافيا لحالات البروتين أو البروتيوفورمات في مرحلة الحل. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح الحجم الصغير للشعيرات الدموية CE باستخدام محلول متحلل بالكامل كمحلول إلكتروليت في الخلفية (BGE) ، أي المخزن المؤقت الجاري ، مما يجعل الشعيرات الدموية كمفاعل HDX لعينات البروتين. نظرا للاختلاف في التنقل الكهربائي بين البروتينات والكواشف البروتيكية في عملية الرحلان الكهربائي ، فإن إجراء HDX خلال CE يؤدي إلى بيئة تثنية كاملة تقريبا لتحليلات البروتين مع الحد الأدنى من المحتويات المتبقية غير المثنية ، وبالتالي تعزيز حساسية التحليل الهيكلي باستخدام بيانات HDX. على هذا النحو ، قمنا بتطوير نهج HDX التفاضلي القائم على CE إلى جانب MS من أعلى إلى أسفل لتوصيف هياكل البروتين ذات الترتيب الأعلى بطريقة خاصة بالحالة أو البروتيوفورم8.

تصف هذه الورقة بروتوكولات هذا النهج من خلال تفصيل خطوات إعداد المواد والإجراءات التجريبية وتحليل البيانات. يتم سرد العوامل التي قد تؤثر على أداء الطريقة أو جودة البيانات في ملاحظات قصيرة. تشمل النتائج التمثيلية المعروضة هنا بيانات HDX التفاضلية لمخاليط البروتينات المختلفة والمتغيرات الطبيعية للبلورة البقرية β-lactoglobulin (β-lg) ، وهو بروتين مصل اللبن الرئيسي الموجود في الحليب9. نحن نظهر كفاءة الفصل ، وقابلية التكرار ، وأداء وضع العلامات H 2للمتغيرين الوفيرين من β-lg ، أي A و B10,11 خلال HDX القائم على CE والتوصيف الخاص بالمتغيرات لتشكيلاتهما.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: استخدم كواشف الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) أو الكواشف ذات درجة MS كلما أمكن ذلك لتقليل الملوثات التي قد تتداخل مع تحليل التصلب المتعدد. لا تلمس واجهة CE-MS بأيدي عارية أثناء القياس لتجنب احتمال حدوث صدمة كهربائية ناجمة إما عن الجهد الكهربائي أو جهد الرش الكهربائي.

1. إعداد المواد

  1. تعديل الشعيرات الدموية السيليكا المنصهرة ل CE
    1. تحضير محلول 5٪ (ث / ث) هيدروكسي بروبيل السليلوز (HPC) عن طريق إذابة مسحوق HPC (الوزن الجزيئي [MW]: 100 kDa) في الماء مع التحريك المستمر في درجة حرارة الغرفة على التحريك المغناطيسي لمدة ~ 12 ساعة أو حتى الاختفاء التام للجزيئات الصلبة12. قم بإزالة أي فقاعات هواء مرئية باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية.
    2. قم بتركيب شعيرات شعرية من زجاج السيليكا المنصهر (القطر الداخلي [ID]: 50 ميكرومتر ، القطر الخارجي [OD]: 360 ميكرومتر) بطول 85 سم تقريبا في أداة CE. شطف الشعيرات الدموية عن طريق غرس مذيب عضوي باستمرار ، مثل الأسيتون13 ، باستخدام جهاز أخذ العينات الذاتية من CE عند ضغط تسريب 40 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10-15 دقيقة.
    3. املأ الشعيرات الدموية التي تم تنظيفها بمحلول HPC باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي عند ضغط ضخ يبلغ 40 رطل لكل بوصة مربعة (والذي غالبا ما يستغرق حوالي 40 دقيقة). قم بضخ الهواء في الشعيرات الدموية المملوءة ب HPC بسرعة 40 رطل لكل بوصة مربعة لضمان تدفق الهواء الحر في الشعيرات الدموية ، والتي تشير إليها فقاعات الهواء المنبعثة من الشعيرات الدموية عند الغمر في الماء.
    4. اخبز الشعيرات الدموية المطلية بتقنية HPC في فرن قابل للبرمجة بدرجة الحرارة (من الناحية المثالية فرن العمود الذي يتم التحكم في درجة حرارته في كروماتوغراف غاز مبرمج بدرجة حرارة) مع غاز النيتروجين (25 رطل لكل بوصة مربعة) يتدفق عبر الشعيرات الدموية ، باتباع برنامج درجة الحرارة الموضح في الشكل 1.
    5. يبرد الفرن إلى درجة حرارة الغرفة قبل إخراج الشعيرات الدموية. استخدم هذه الشعيرات الدموية المعدلة بواسطة HPC لفصل CE.

figure-protocol-1
الشكل 1: برنامج درجة حرارة موصى به للخبز الشعري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. حل المنحل بالكهرباء في الخلفية (BGE) وحل المعدل8
    1. تحضير 1-10 مل من BGE بالتركيز المطلوب (على سبيل المثال ، 10 mM) عن طريق إذابة الكمية المناسبة من خلات الأمونيوم في 2 H 2O. ضع 200 μL-aliquots من BGE في قوارير BGE منفصلة وختم القوارير مع parafilm لتقليل تفاعل HDX بين BGE وبخار الماء في الهواء.
    2. قم بإعداد 10 مل من محلول معدل مع 75٪ (v / v) من الميثانول و 25٪ (v / v) من الماء ، مع ضبط درجة الحموضة إلى 2.5 باستخدام حمض الفورميك.
      ملاحظة: استخدم 2 H2O والميثانول المخفض لإعداد محلول المعدل إذا كان ينبغي الاحتفاظ بذرات الديوتيريوم في السلاسل الجانبية وأميدات العمود الفقري غير المحمية للكشف عنها بواسطة MS.
  2. تحلية عينات البروتين
    1. تحضير محلول خلات الأمونيوم في الماء غير المثني بالتركيز المطلوب.
      ملاحظة: يوصى بتركيز أقل من 100 مللي متر لتجنب تيار كهربائي مرتفع أثناء الرحلان الكهربائي وتأثير تسخين الجول الناتج.
    2. عند الضرورة ، اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول خلات الأمونيوم على المستوى المطلوب باستخدام حمض الفورميك (للأس الهيدروجيني < 6.8) أو هيدروكسيد الأمونيوم (للأس الهيدروجيني > 6.8).
    3. استبدل المخازن المؤقتة الأصلية لمحلول البروتين بمحلول خلات الأمونيوم (المحضر في ماء غير مخفض بالتركيز المطلوب ؛ تم ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 مع هيدروكسيد الأمونيوم) من خلال خمس تركيزات متتالية على الأقل وخطوات تخفيف عند 4 درجات مئوية باستخدام مرشح طرد مركزي مع قطع MW مناسب.
      ملاحظة: قد تكون عينات البروتين المراد تحليحها إما من إجراءات الإنتاج السابقة (مثل التنقية أو التركيبة) أو يتم تحضيرها عن طريق إذابة مسحوق البروتين المجمد بالتجميد. تشير "الأملاح" التي يجب إزالتها من محاليل العينة في هذه الخطوة بشكل عام إلى جميع الأيونات أو الجزيئات الصغيرة غير المتطايرة. على الرغم من أنه يمكن فصل هذه الأنواع بكفاءة عن البروتينات أثناء عملية الرحلان الكهربائي ، يوصى بهذه الخطوة لتجنب المساس بالدقة الكهربية وبالتالي تقليل تلوث مطياف الكتلة. عندما يجب تثبيت تحليلات البروتين بواسطة أملاح أو إضافات محددة ، قم بتضمينها في BGE.
    4. حدد تركيز البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية UV-Vis صغير الحجم.

2. تشغيل تحليل HDX MS القائم على CE

ملاحظة: ينبغي تزويد مطياف الكتلة المستخدم في هذا النهج بمحلل كتلة ذي استبانة فائقة الاستبانة، مثل رنين السيكلوترون الأيوني المحول من فورييه (FTICR) أو المدار (orbitrap)، وهو مرشح كتلة، مثل رباعي الأقطاب يسمح باختيار كتلة أيونات السلائف للتفتيت، ووظائف تفكك نقل الإلكترون (ETD) أو تفكك التقاط الإلكترون (ECD) لإجراء تحليل من أعلى إلى أسفل باستخدام بيانات MS الترادفية الموثوقة (إشارات يتم حلها بشكل مثالي من الناحية النظائرية لأيونات الشظايا).

  1. تحسين إعدادات CE و MS
    1. قم بإجراء قياس تجريبي للتصلب المتعدد باستخدام مصدر قياسي لتأين الرش الكهربائي (ESI) عن طريق رش إما العينة المحملة مسبقا من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكية المطلية بالمعدن (مخطط nanoESI "الثابت") أو العينة المشبعة باستمرار من باعث المعادن لتحسين إعدادات MS لقياس البروتينات السليمة (MS1) وشظاياها في الطور الغازي (MS2). قم بتجزئة أنواع البروتين ذات الأهمية عن طريق الانتقاء الشامل لمجموعة أيوناته في حالة شحنة واحدة ، تليها ETD أو ECD لأيونات السلائف.
      ملاحظة: تشمل الإعدادات الأساسية المعلمات التي تؤثر على الذوبان، والانتقاء الشامل لأيونات السلائف (لتجنب التداخل من الأنواع الأخرى)، وكفاءة التجزئة. يجب زيادة كل من مركز وعرض نافذة اختيار الكتلة لتتناسب مع التوزيع الكتلي الناتج لأيونات التحليل بعد HDX. نظرا لأن نافذة الاستخلاص لأنواع البروتين في CE تتراوح عادة من 0.5 دقيقة إلى دقيقتين ، فقم بتقييم كفاءة التجزئة استنادا إلى عمليات مسح MS2 المتراكمة خلال نافذة زمنية مماثلة. القيم المثلى لهذه المعلمات خاصة بالبروتين. تتم إحالة القراء إلى التقارير المنشورة مسبقا للإعدادات المثالية 8,14.
    2. قم بإجراء قياس CE تجريبي باستخدام أداة CE مجهزة بكاشف بصري ، أي كاشف صفيف الصمام الثنائي الضوئي (PDA) أو كاشف الأشعة فوق البنفسجية لتحسين إعدادات CE لفصل أنواع البروتين وأوقات الهجرة ، وهو ما يعادل أوقات تفاعل HDX.
      ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية اعتمادا على توفر الكاشف البصري من CE. في حالة عدم وجود كاشف بصري ، يمكن تحسين إعدادات CE باستخدام CE-MS عند الانتهاء من القسم 2.2 ، باتباع الإرشادات الموضحة في القسم 2.3. تتضمن الإعدادات الأساسية المعلمات التي تؤثر على كفاءة الفصل ، وأشكال الذروة الموضحة في الفيروجرامات الكهربائية ، وأوقات الخروج.
  2. التكييف المسبق لإعداد CE-HDX
    1. قم بتنظيف واجهة CE-MS المتدفقة من خلال الميكروفيال بمزيج من 50٪ ميثانول و 49٪ ماء و 1٪ حمض الفورميك (v / v) باستخدام الموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    2. عند تركيب الشعيرات الدموية المعدلة بواسطة HPC على أداة CE ، اشطف الشعيرات الدموية باستخدام BGE باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي لمدة 10 دقائق واترك الشعيرات الدموية مليئة ب BGE.
    3. الحصول على طول مناسب من أنابيب الشعيرات الدموية السيليكا غير المعدلة (ID: 50 ميكرومتر ، OD: 360 ميكرومتر) كأنابيب ضخ لمحلول المعدل. قم بتوصيل أنبوب المعدل بحقنة زجاجية محكمة الإغلاق بطرف حاد باستخدام اتحاد وكم مناسب ، واشطف الأنابيب بمحلول المعدل باستخدام مضخة ضخ لمدة 10 دقائق على الأقل.
    4. أدخل منافذ أنابيب CE الشعرية والمعدلة المطلية ب HPC ، والتي تم تحميلها بالحلول المقابلة ، في واجهة CE-MS التي تم تنظيفها ، كما هو موضح في الشكل 2.
    5. قم بتطوير المحقنة لضخ المعدل إما يدويا أو باستخدام مضخة التسريب لضمان وصول محلول المعدل إلى طرف الواجهة. قم بتركيب واجهة CE-MS المجمعة على غلاف مصدر nanoESI لمطياف الكتلة.

figure-protocol-2
الشكل 2: رسم تخطيطي لإعداد HDX MS المستند إلى CE. تم تعديل هذا الرقم من8. الاختصارات: BGE = محلول إلكتروليت في الخلفية. CE = الرحلان الكهربائي الشعري. MS = قياس الطيف الكتلي; HDX = تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم ؛ ESI = تأين الرش الكهربائي ؛ FTICR = رنين سيكلوترون أيون تحويل فورييه. ETD = تفكك نقل الإلكترون ؛ ECD = تفكك التقاط الإلكترون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. فصل CE في وقت واحد ، تفاعل HDX ، وتحليل MS
    ملاحظة: يوصى باستخدام BGE المثني في غضون 1 يوم بعد فك الختم.
    1. قم بتطبيق جهد رش من 3-5 كيلو فولت على واجهة CE-MS.
    2. ابدأ في غرس محلول المعدل مع مضخة التسريب بمعدل تدفق يتراوح من 0.1 إلى 10 ميكرولتر / دقيقة ، وتأكد من وجود رذاذ كهربائي مستقر عند طرف واجهة CE-MS.
    3. ضع قارورة العينة التي تحتوي على BGE في جهاز أخذ العينات التلقائي، واستخدمها في الخطوة 2.3.4 للحصول على مخططات كهربائية فارغة وأطياف كتلة فارغة.
    4. حقن محلول العينة باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي عند 2 رطل لكل بوصة مربعة ولمدة مناسبة للسماح بحقن الكمية المطلوبة من العينة. تقدير حجم الحقن باستخدام العلاقة بين حجم الحقن ومعلمات الحقن15 المحددة بالمعادلة (1).
      figure-protocol-3 (1)
      حيث V inj هو حجم الحقن ، Δp هو ضغط الحقن ، dc هو القطر الداخلي للشعيرات الدموية ، A هو المقطع العرضي للشعيرات الدموية ، tinj هو مدة الحقن ، η هو لزوجة السائل في الشعيرات الدموية ، و L هو طول الشعيرات الدموية.
    5. ابدأ فصل CE عن طريق تطبيق جهد كهربائي من 30 كيلو فولت وضغط ضخ يتراوح من 0 إلى 2 رطل لكل بوصة مربعة ، والحصول على مخطط كهربائي. وفي الوقت نفسه ، ابدأ في الحصول على بيانات MS في الوضع الكروماتوغرافي حيث يتم الحصول على الرسم البياني للتيار الأيوني كدالة للوقت ، ولا يتم دمج عمليات مسح MS المقابلة تلقائيا في طيف واحد.
      ملاحظة: تخضع البروتينات لتفاعل HDX التلقائي عند نقطة ملامسة جزيئات 2 H 2O في BGE أثناءهجرتها الكهربية في هذه الخطوة. يمكن استخدام الكشف البصري ل CE بالإضافة إلى اكتشاف MS. نظرا لأن الكشف على العمود يتطلب إزالة طول معين من طلاء البوليميد في نهاية مخرج الشعيرات الدموية السيليكا المنصهرة ، يجب توخي مزيد من الحذر لتجنب تلف الشعيرات الدموية أثناء تجميع واجهة CE-MS.
    6. احفظ مخطط الفيروغرام الكهربائي الفارغ وأطياف الكتلة كمراجع.
      ملاحظة: يجب استخدام البيانات الفارغة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها بدلا من طرح الأساس.
    7. ضع قوارير العينة التي تحتوي على التركيزات المطلوبة من محاليل عينات البروتين في جهاز أخذ العينات التلقائي. الحصول على الكهربية وأطياف الكتلة لعينات البروتين باتباع الخطوات 2.3.4-2.3.5. اجمع عددا كافيا من فحوصات التصلب المتعدد للحصول على أطياف MS1 من أنواع البروتين المنفصلة كهربائيا و 2التي تحمل علامة H.
    8. قم بإجراء قياسات MS جنبا إلى جنب للأنواع ذات الأهمية إما بعد الحصول على أطياف MS1 داخل نفس التشغيل أو في تشغيل منفصل لاحق.
    9. عند الضرورة ، اضبط أوقات الترحيل / أوقات تفاعل HDX عن طريق تغيير ضغط التسريب أو طول الشعيرات الدموية CE. إذا كان يجب أن يكون وقت تفاعل HDX أقصر من وقت الهجرة ، فاستخدم النهج الموصوف سابقا8 ، والذي يستخدم كلا من BGE المحايد وغير المثني في الشعيرات الدموية أثناء عملية CE.
    10. اغسل الشعيرات الدموية CE باستخدام BGE عند ضغط 20 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقائق على الأقل بعد كل قياس.
    11. عند الانتهاء من التجارب ، قم بتنظيف واجهة CE-MS وجميع الأنابيب للتخزين.
    12. احصل على مجموعة بيانات من عينة "نقطة النهاية" HDX (والتي يمكن إعدادها باستخدام الأساليب الموضحة سابقا 6,16) مع MS في وضع التسريب المباشر.
      ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة فقط عند استخدام حل معدل مخفف ل HDX المستند إلى CE.

3. تحليل البيانات

  1. تحليل بيانات CE
    1. استخدم أحد المخططات التالية كمخطط كهربائي لتحديد الخصائص الكهربية ، بما في ذلك عدد القمم وأوقات الهجرة وكفاءة الفصل: (أ) امتصاص الأشعة فوق البنفسجية مقابل وقت الهجرة ، الذي يكتسبه الكاشف البصري لأداة CE (عند توفره) ؛ (ب) امتصاص الأشعة فوق البنفسجية مقابل وقت الهجرة ، الذي يكتسبه الكاشف البصري لجهاز CE (عند توفره) ؛ (ب) امتصاص الأشعة فوق البنفسجية مقابل وقت الهجرة ، الذي يكتسبه الكاشف البصري لجهاز CE (عند توفره) ؛ (ب) امتصاص الأشعة فوق البنفسجية مقابل وقت الهجرة ، الذي يكتسبه الكاشف البصري لجهاز CE (عند توفره) ؛ (ب) امتصاص الأشعة فوق البنفسجية مقابل وقت الهجرة ، الذي يكتسبه الكاشف البصري لجهاز CE (عند توفره) ؛ (ب) امتصاص الأشعة (ب) الرسم البياني للتيار الأيوني الكلي (TIC) الذي حصل عليه MS؛ (ج) الرسم البياني للتيار الأيوني المستخرج (EIC/XIC) الذي حصل عليه MS.
      ملاحظة: توفر EIC / XIC نسبة الإشارة / الضوضاء المثلى (S / N) ، بشكل عام ، من بين التنسيقات المذكورة أعلاه من المخططات الكهربية. من الجدير بالذكر أنه حتى في حالة عدم وجود أي تحيزات مفيدة ، في حين أن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية يتناسب مع تركيز كتلة البروتين ، فإن إشارة MS تتناسب مع التركيز المولي. وبالتالي ، من المعقول ملاحظة الاختلافات في أنماط الذروة بين الفيروجرامات الكهربائية المشتقة من CE و MS.
    2. استخدم المساحة تحت منحنى (AUC) للقمم الموضحة في الفيروجرامات الكهربائية لشبه الكمية. بالنسبة للعينات التي تنطوي على مجمعات بروتينية ، استخدم النهج الموصوف سابقا17 لاستنتاج بيانات تركيز الكتلة من الفيروجرامات الكهربائية TIC / EIC.
  2. تحليل بيانات التصلب المتعدد
    1. احصل على أطياف MS1 وMS2 من خلال الجمع بين عمليات الفحص MS1 وMS2 التي تم الحصول عليها داخل نوافذ الإزالة المقابلة، على التوالي.
    2. حدد كتل البروتين السليم (M (البروتين السليم)) والشظايا بأي من الطريقتين التاليتين.
      1. احسب متوسط كتل الأيونات التي تؤدي إلى ظهور مجموعات الإشارات التي تم حلها بالنظائر.
      2. استخدم مركز المنحنيات الشبيهة بغاوسي الناتجة عن تركيب المغلفات النظيرية المقابلة6.
    3. استخدم برامج مثل Biopharma Finder أو ProSight18 أو MASH Suite19 لإنشاء قائمة كتلة أيونات الأجزاء وتحديدها.
  3. تحليل بيانات HDX
    1. تحديد مستوى التثنية الكلي لأنواع البروتين السليمة باستخدام المعادلة (2).
      figure-protocol-4 (2)
      حيث M (2 H) أو M (1 H) هي أوزان ذرية من 2H أو 1H. تشير العلامة النجمية إلى بيانات العينة التي تحمل علامة H 2.
    2. تحديد الحماية التراكمية أو التثنية التراكمية لأميدات العمود الفقري لجزء معين.
      1. بالنسبة للبيانات التي يتم الحصول عليها باستخدام حل معدل مخفف ، استخدم المعادلتين (3) و (4) لتحديد مستوى الحماية التراكمية.
        figure-protocol-5 (3)
        figure-protocol-6 (4)
        حيث P(S k(N)) هي الحماية الكاملة للجزء الطرفي N الذي يمتد من 1 إلى k ، P(S m(C)) هو الحماية الكاملة للجزء الطرفي C الذي يتكون من بقاياm ، M (2 H) أو M (1 H) هي أوزان ذرية من 2H أو 1H ، و M (c i) أو M (z i) هي الأوزان الجزيئية لأيونات ci أو z i.
        ملاحظة: تشير العلامة النجمية المزدوجة إلى بيانات عينة "نقطة النهاية" HDX.
      2. بالنسبة للبيانات التي تم الحصول عليها باستخدام حل معدل غير مخفف ، استخدم المعادلتين (5) و (6) لتحديد مستوى الإزالة التراكمية.
        figure-protocol-7 (5)
        figure-protocol-8 (6)
        حيث D(S k(N)) هو امتصاص الديوتيريوم التراكمي للجزء الطرفي N الذي يمتد من 1 إلى k؛ D(Sm(C)) هو امتصاص الديوتيريوم التراكمي للجزء الطرفي C الذي يتكون من بقايا m.
    3. تحديد مستوى التثنية في مجموعة أميد العمود الفقري المحلية
      1. بالنسبة للبيانات التي يتم الحصول عليها باستخدام حل معدل مخفف ، استخدم المعادلات (7) و (8) و (9) و (10) و (11) لتحديد مستوى الحماية المحلي.
        للبيانات المستنبطة من الأيونات c-ions
        figure-protocol-9 (7)
        للبيانات المستنبطة من الأيونات z
        figure-protocol-10 (8)
        حيث P (R i) هو حماية أميد العمود الفقري عند البقايا i ، ويشير الحرف المنخفض "المجموع" إلى إجمالي عدد بقايا البروتين.
        بالنسبة لمواقع البقايا التي كانت فيها أيونات الشظايا اللاحقة مفقودة، قم بتعيين P(Ri) باستخدام المعادلتين (9) و (10).
        للبيانات المستنبطة من الأيونات c-ions
        figure-protocol-11 (9)
        للبيانات المستنبطة من الأيونات z
        figure-protocol-12 (10)
        ثم أوجد مستوى التثدي D(Ri) في مجموعة أميد العمود الفقري المحلية باستخدام المعادلة (11).
        figure-protocol-13(11)
      2. بالنسبة للبيانات التي يتم الحصول عليها باستخدام حل معدل غير مخفف ، استخدم المعادلات (12) و (13) و (14) و (15) لتحديد مستوى الحماية المحلي.
        للبيانات المستنبطة من الأيونات c-ions
        figure-protocol-14(12)
        للبيانات المستنبطة من الأيونات z
        figure-protocol-15(13)
        حيث D(R i) هو حماية أميد العمود الفقري في البقايا i ، ويشير الحرف المنخفض "المجموع" إلى إجمالي عدد بقايا البروتين.
        بالنسبة لمواقع البقايا التي كانت فيها أيونات الشظايا اللاحقة مفقودة، قم بتعيين D(Ri) باستخدام المعادلتين (14) و (15).
        للبيانات المستنبطة من الأيونات c-ions
        figure-protocol-16 (14)
        للبيانات المستنبطة من الأيونات z
        figure-protocol-17 (15)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يسمح تغيير ضغط التسريب ل BGE بتعديل كل من كفاءة الفصل ووقت الهجرة ، وهو ما يعادل وقت تفاعل HDX للبروتينات المراد فصلها (الشكل 3). يؤدي انخفاض ضغط التسريب إلى فصل أفضل لقمم CE على حساب مدة التجربة (الشكل 3A). يؤدي وقت تفاعل الهجرة / HDX الأطول إلى مستوى أعلى من إزالة التخصي من تحليلات البروتين (الشكل 3B-D). وفي المقياس الزمني للدقائق المحددة ب HDX، ينبغي أن يعكس الفرق في الانحراف في المقام الأول اختل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تشمل أهداف طلاء الجدار الداخلي للشعيرات الدموية CE تقليل التدفق الكهرواسمي وامتصاص البروتين أثناء عملية CE13. على الرغم من أن التدفق الكهرواسموزي مفيد لتحليل CE التقليدي للجزيئات الصغيرة بسبب قدرته على دفع الأنواع المحايدة أو المشحونة بشكل معاكس إلى الكاشف ، إلا أنه يعرض للخطر كفاءة فصل أنواع البروتين ذات الأحجام المماثلة والشحنات الصافية في المحلول. طلاء الشعيرات الدموية مع HPC يقلل من التدفق الكهروتنازي الناجم عن مجموعات سيلانول على الجدار الداخلي للشعيرات الدموية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إخفاء م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

D. D. Y. Chen هو أحد مؤسسي معهد المعرفة من أجل الصحة للجزيئات الحيوية ، الذي يقوم بتسويق واجهة CE-MS الميكروبية المتدفقة. المؤلفون الآخرون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC 21974069). وتلقى المؤلفون أيضا دعما من معهد تحليل الخلايا، مختبر خليج شنتشن، الصين؛ مركز جيانغسو للابتكار التعاوني للمواد الوظيفية الطبية الحيوية ؛ ومختبر جيانغسو الرئيسي للمواد الطبية الحيوية في جامعة نانجينغ نورمال ، الصين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أسيتات الأمونيومفيشر الكيميائيةA / 3446/50& ge ؛ 99٪
CESI 8000 بالإضافة إلى نظام الرحلان الكهربائي الشعريSciex ، الولايات المتحدة الأمريكية
جهاز الطرد المركزيEppendorf5406000097
مرشح الطرد المركزيMerckUFC20102410 كيلو دالتون
أكسيد الديوتيريومالطاقةالكيميائية E09000199.9٪ D
حمض الفورميكAcros Organics  ؛ 270480250
المنصهرة زجاج السيليكا الشعريةPolymicro Technologies1068150017ID 50 & mu ؛ م ، OD 360 & م
كروماتوغرافيا الغازAgilentGC6890N
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش258148
هيدروكسي بروبيل السليلوزعلاء الدينH113415ميجاوات 100000
أدوات تقليب مغناطيسيةDLAB8030101212
ميثانولفيشر كيميكالA456-4MS درجة
microvolume UV-Vis مقياس الطيف الضوئيDeNovix84677JK7731
myoglobinSigma AldrichM1882
Orbitrap Fusion Lumos مطياف الكتلةThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية
PA 800 Plus التحليل الصيدلاني نظام CEبيكمان كولتر ، الولايات المتحدة الأمريكية
Q Exactive UHMR مطياف الكتلةThermo Fisher Scientific ، ألمانيا
الصوديوم  هيدروكسيدسيجما ألدريتشS5881
يوبيكويتينسيجما ألدريتشU6253
الموجات فوق الصوتيةSCIENTZSB-5200
& بيتا ؛ -لاكتوغلوبولينسيجما ألدريتشL0130
قطع

المراجع

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).
  2. Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
  3. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
  4. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
  5. Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
  6. Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
  7. Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
  8. Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
  9. Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
  10. Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
  11. Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
  12. Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
  13. Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
  14. Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
  15. Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille's law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
  16. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  17. Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
  18. Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
  19. Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
  20. Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
  21. Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
  22. Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
  23. Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173(2019).
  24. Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
  25. Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة